通过活体显微镜观察斑马鱼胚胎中分枝杆菌感染期间巨噬细胞的裂解性细胞死亡

摘要

本方案描述了一种在Mycobacterium marinum感染过程中对斑马鱼胚胎内巨噬细胞行为及死亡进行可视化观察的技术。内容包括细菌制备、胚胎感染以及活体显微成像的操作步骤。该技术可应用于类似感染或无菌性炎症情境下细胞行为与死亡的观察。

摘要

斑马鱼因其在早期发育阶段具有透明特性且仅依赖先天免疫系统，是研究先天免疫细胞行为的优良模式生物。Mycobacterium marinum（M. marinum）感染的斑马鱼模型已被广泛用于研究宿主对分枝杆菌感染的免疫应答。已有研究表明，不同类型的巨噬细胞死亡将导致分枝杆菌感染结局的差异。本文描述了一种利用活体显微镜观察斑马鱼胚胎在M. marinum感染后巨噬细胞死亡的实验方案。通过在中脑或躯干部位进行肌肉内微量注射荧光标记的M. marinum，感染特异性标记巨噬细胞和中性粒细胞的斑马鱼转基因品系。随后将感染后的斑马鱼胚胎固定于低熔点琼脂糖中，并通过共聚焦显微镜在X-Y-Z-T四维维度下进行观察。由于长期活体成像需要使用低激光功率以避免光漂白和光毒性，因此强烈推荐使用荧光表达较强的转基因品系。该方案有助于在体内可视化免疫细胞迁移、宿主与病原体相互作用以及细胞死亡等动态过程。

引言

已证明分枝杆菌感染可导致宿主免疫细胞死亡¹。例如，减毒菌株会诱导巨噬细胞发生凋亡，从而控制感染；而毒力菌株则会引发裂解性细胞死亡，导致细菌扩散^1,2。鉴于不同类型的细胞死亡对宿主抗分枝杆菌免疫反应具有重要影响，有必要在体内对分枝杆菌感染过程中巨噬细胞的死亡进行详细观察。

检测细胞死亡的传统方法是使用死细胞染料，例如Annexin V、TUNEL或吖啶橙/碘化丙啶染色^3,4,5。然而，这些方法无法揭示体内细胞死亡的动态过程。体外细胞死亡的观察已可通过活细胞成像实现⁶。但这些结果是否能准确模拟生理条件仍不明确。

斑马鱼是研究宿主抗分枝杆菌反应的优良模型。其免疫系统与人类高度保守，基因组易于操作，且早期胚胎透明，便于进行活体成像^7,8,9。感染M. marinum后，成年斑马鱼可形成典型的成熟肉芽肿结构，而胚胎斑马鱼则形成类似早期肉芽肿的结构^9,10。此前已在斑马鱼M. marinum感染模型中探讨了先天免疫细胞与细菌相互作用的动态过程^11,12。然而，由于对时空分辨率要求较高，先天免疫细胞死亡的具体细节仍 largely 未明。

本文介绍了如何在体内可视化结核分枝杆菌感染所触发的巨噬细胞溶解性细胞死亡过程。该方案也可用于在发育和炎症过程中体内可视化细胞行为。

方案

斑马鱼在符合实验动物福利伦理审查的实验室动物指南（GB/T 35823-2018）的标准条件下饲养。本研究中的所有斑马鱼实验均经批准（2019-A016-01），并在复旦大学附属上海市公共卫生临床中心进行。

1. M. marinum 单细胞接种物的制备（图1）

1. 从 -80 °C 取出含天蓝色荧光蛋白的 M. marinum 甘油菌种，接种于添加 10% (v/v) OADC、0.25% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H10 琼脂平板上。在 32 °C 下培养约 10 天。
2. 挑选发出阳性荧光的单菌落，接种至 3 mL 含 10% OADC、0.5% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H9 培养基中。
   1. 在 32 °C、100 转/分钟（rpm）条件下培养 4–6 天，直至菌液进入对数生长期（OD₆₀₀ = 0.6–1.0）。
   2. 按 1:100 比例转接至 30 mL 新鲜的 7H9 培养基中，培养基含 10% OADC、0.5% 甘油、0.05% Tween-80 和 50 μg/mL 潮霉素，继续培养至 OD₆₀₀ 达到约 1.0。
      注：为获得最佳培养质量，建议在此步骤进行转接培养。根据我们的经验，若直接将菌种接入大体积培养基中，易导致细菌聚集成团。
3. 按以下步骤收集 M. marinum 菌体。
   1. 以 3,000 x g 离心 10 分钟，收集 M. marinum 菌体沉淀。弃去上清液，仅保留 300 μL 用于重悬菌体沉淀。
   2. 加入含 10% 甘油的 3 mL 7H9 培养基进一步重悬菌体沉淀，随后在水浴中超声处理，设置为 100 W，开启 15 秒，关闭 15 秒，总时长 2 分钟。
      注：超声处理的目的是使接种物形成单细胞均一悬液，以防止微注射针头堵塞。
4. 将细菌悬液转移至 10 mL 注射器中，通过 5 μm 滤膜过滤，以去除任何可能存在的细菌聚集体。
5. 使用分光光度计测定悬液的光密度（OD），并用含 10% 甘油的 7H9 培养基稀释至 OD₆₀₀ = 1.0。将悬液分装为每份 10 μL，保存于 -80 °C 冰箱中以备后续使用。
6. 通过系列稀释法将细菌原液在含 10% (v/v) OADC、0.5% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H10 琼脂平板上进行涂布培养，以确认接种物的细菌浓度（cfu/mL）。

2. 斑马鱼胚胎制备

1. 在产卵前一天，将斑马鱼配对放入繁殖室中进行设置。
   注意：每个繁殖室中仅放入一对斑马鱼。
2. 于次日早晨在受精后1小时内（hpf）收集胚胎。用蒸馏水小心清洗胚胎，并将最多100个胚胎转移至含有30 mL E3培养基的100 mm培养皿中。在28.5 °C条件下孵育。
3. 12小时后，在显微镜下观察，弃去未受精或受损的卵。
4. 在24 hpf时，更换为新鲜的E3培养基，并加入N-苯基硫脲（PTU，终浓度0.2 nM），以抑制色素发育。将胚胎在28.5 °C继续孵育，直至适合显微注射。

3. 通过细菌显微注射进行感染

1. 按照参考文献¹³中所述方法制备硼硅酸盐玻璃微毛细管注射针。
2. 斑马鱼胚胎感染前的固定
   1. 将100 mL的1%（w/v）和100 mL的0.5%（w/v）低熔点琼脂糖加入灭菌E3培养基中，微波加热至琼脂糖完全溶解。分装为每管1 mL，置于4 °C保存以备后续使用。
   2. 使用前，将琼脂糖置于95 °C加热块中加热至完全融化，并转移至45 °C加热块中维持液态（图2）。
   3. 躯干区域肌肉内感染的固定
      1. 取0.5 mL的1%（w/v）琼脂糖均匀铺在载玻片上形成底层琼脂糖。将载玻片置于冰盒或冷表面上3分钟，使其凝固。
      2. 在固定前5分钟，将斑马鱼胚胎（48–72 hpf）置于含三卡因（200 µg/mL）和PTU的卵水中进行麻醉。将最多60个斑马鱼胚胎放置于底层琼脂糖上，并小心排列成两行（图2B）。
      3. 加入0.3 mL的0.5%（w/v）琼脂糖形成上层前，用纸巾吸除底层琼脂糖表面残留的水分。确保胚胎完全包埋于琼脂糖中。再次将载玻片放回冰盒中，使琼脂糖凝固并防止脱水。
      4. 通过在琼脂糖表面覆盖额外的E3卵水，保持上层琼脂糖湿润。
   4. 中脑感染的固定
      1. 用1%（w/v）琼脂糖覆盖单凹槽载玻片的凹槽，然后将4–6个经三卡因麻醉的胚胎转移至琼脂糖中。
      2. 使用10 G针头小心将每个胚胎的头部朝上定位（图2C）。
      3. 待所有胚胎位置固定后，将载玻片转移至冰盒或冷表面，使琼脂糖凝固。
         注：为避免低熔点琼脂糖被稀释，应尽量减少随胚胎转移的卵水体积。
3. 用于感染的细菌制备
   1. 取1 μL无菌过滤的酚红（10倍浓度）加入10 μL细菌储备液（步骤1制备）中，短暂涡旋混匀。
      注：可通过无菌PBS调节最终浓度。
   2. 使用100 W超声处理1分钟（开启10秒，关闭10秒），以打散可能形成的菌团¹⁴。
4. 通过显微注射进行感染
   1. 按照先前报道的方法¹³，调整显微注射仪和显微操作器至合适的注射位置和参数。
   2. 使用微量加样器将3 µL细菌悬液转移至已准备好的注射针中（见步骤3.1）。缓慢且小心地移液，避免产生气泡。
   3. 进行躯干区域感染时，向躯干区域注射100 cfu（图3A）。避免将细菌注入脊索中。
      注：注射的cfu数可通过公式估算：cfu = 细菌储备液浓度 × 稀释倍数 × 注射液滴体积。实际cfu数通过将一滴细菌接种物涂布于含10%（v/v）OADC、0.5%甘油和50 μg/mL潮霉素的7H10琼脂平板上进行确认。
   4. 进行中脑感染时，向中脑区域注射约500 cfu（图3B）。
   5. 显微注射后，使用塑料移液器小心将斑马鱼胚胎冲洗至新鲜卵水中。
      注：应尽快将胚胎固定于玻璃底培养皿中，以便观察早期先天免疫细胞反应。

4. 感染过程的活体成像

1. 用于活体成像的斑马鱼固定
   1. 将最多10个经三卡因麻醉的胚胎转移至玻璃底35 mm培养皿中央。弃去多余的E3培养基。
   2. 用1%低熔点琼脂糖覆盖培养皿，并使用10 G针头小心调整斑马鱼胚胎的方向。将玻璃底培养皿置于冰上孵育10秒，使琼脂糖凝固。
      注意：进行中脑注射时，应将胚胎以头部朝上的方向包埋于琼脂糖中（图4A）；进行躯干区域肌肉内感染时，应将胚胎侧向包埋于琼脂糖中（图4B）。
   3. 待琼脂糖完全凝固后，覆盖一层卵水（含1 × 三卡因和PTU）。
2. 三色高分辨率延时共聚焦显微镜成像
   注意：以下步骤在配备63.0× 1.40油浸UV物镜的共聚焦显微镜上操作。
   1. 将环境控制腔室温度设置为28.5 °C。在腔室内放置一些湿润的纸巾以提供湿度，防止卵水蒸发（补充图1）。
   2. 将装有斑马鱼的35 mm玻璃底培养皿放入环境控制腔室中。
   3. 打开共聚焦软件并初始化载物台。切换至63.0 × 1.40油浸UV物镜，使用明场通道配合微分干涉差（DIC）滤光片定位斑马鱼。
   4. 开启405二极管激光器、氩离子激光器（20%功率）和DPSS 561 nm激光器。设置合适的激光功率和光谱参数。
      注意：Cerulean的光谱设置为激发波长= 405 nm，发射波长≈ 456–499 nm；eGFP为激发波长= 488 nm，发射波长≈ 500–550 nm；DsRed2为激发波长= 561 nm，发射波长≈ 575–645 nm（补充图2B）。
   5. 选择"XYZ" "逐帧扫描"采集模式，并将图像格式设置为"512 × 512像素"（补充图2A）。
   6. 切换至"实时数据模式"。定位第一个斑马鱼的位置，并标记"开始"和"结束"的Z轴位置。对剩余每个胚胎重复此过程。可在程序末尾添加"暂停"（补充图2C）。
   7. 定义程序的循环次数和周期。
   8. 保存文件。

5. 单细胞紫外照射诱导凋亡及活体成像

1. 按照步骤 4.1 所述固定斑马鱼。
2. 对受精后 3 天（dpf）的巨噬细胞特异性转基因 Tg(mfap4-eGFP) 胚胎的中脑区域进行成像¹⁵。
3. 选择单个荧光标记的巨噬细胞作为感兴趣区域，以 400 Hz 的扫描速度和 6% 的紫外激光功率扫描 50 秒。
   注意：扫描速度和时间应根据所使用的具体显微镜进行优化。扫描时间应优化至足以引起严重的 DNA 损伤，从而导致靶细胞发生凋亡，但不会使整个细胞的荧光完全淬灭。
4. 重复上述步骤以照射更多靶细胞。
5. 按照第 4 节所述方法对中脑区域进行延时成像。

6. 图像处理

1. 对获取的图像执行"最大投影"。
2. 在"最大投影"视图下，查找并标记目标细胞的 XY 位置和时间。
3. 返回标准视图，查找并标记目标细胞的 Z 位置。
4. 裁剪目标细胞的单层图像。
5. 将叠加通道和明场图像导出为 AVI 格式的视频。
6. 在 ImageJ 中裁剪叠加通道和明场图像的兴趣区域。
7. 在 ImageJ 中将上一步得到的两个视频垂直合并，并保存为一个 AVI 格式的视频。

结果

结核分枝杆菌感染可因感染途径不同而引发不同的宿主反应。在本实验方案中，通过显微注射将荧光标记的细菌注入斑马鱼胚胎的中脑或躯干肌肉（图3），并利用共聚焦活体成像进行观察。通过这两种途径感染将使病原体局限于局部，引发先天免疫细胞的募集及随后的细胞死亡。

观察先天免疫细胞死亡的细节具有挑战性。裂解性细胞死亡发生的时间窗口非常短暂，需要高分辨率显微镜才能观察到。此外，先天免疫细胞具有高度运动性，容易迁移出观察区域。在本实验方案中，我们通过并行观察多个胚胎来解决这一问题。可将一排斑马鱼胚胎同时固定在单个玻璃载玻片上进行感染，最多可将10个胚胎固定在同一35 mm玻璃底培养皿中用于活体成像（图4）。利用共聚焦显微镜的实时数据模式，可同时观察多个胚胎。这提高了活体成像的效率，并显著增加了完整捕获整个裂解性细胞死亡过程的概率。

先天免疫系统是抵抗分枝杆菌感染的第一道防线，其中两个关键组分是巨噬细胞和中性粒细胞。本研究利用先前...

讨论

本方案描述了分枝杆菌感染过程中巨噬细胞死亡的可视化方法。根据细胞膜完整性的不同，感染诱导的细胞死亡可分为凋亡和裂解性细胞死亡^24,25。与凋亡相比，裂解性细胞死亡对机体的损伤更为严重，因为它会引发强烈的炎症反应^24,25。由于需要高时空分辨率、合适的共聚焦显微镜设置以及强效的转基因表达，体内观察裂解性细胞死亡具有较大难度。

正确的显微注射需要多个关键步骤。注射前必须对细菌原液进行充分超声处理，以去除所有团块。我们通过将斑马鱼胚胎置于载玻片上两层低熔点琼脂糖之间进行包埋，从而改进了显微注射时的胚胎固定方法。在覆盖第二层琼脂糖后，应立即将载玻片转移至冰盒或冷表面，以加速凝固并防止琼脂糖脱水。若需将胚胎转移至不同的载玻片，务必通过添加额外的胚胎用水保持顶层琼脂糖湿润。

进行活体成像时，需要使用高分辨率...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% Tween-80	Sigma	P1379
10 mL 注射器	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
3-氨基苯甲酸	Sigma	E10521
5 μm 滤膜	Mille X	SLSV025LS
50 μg/mL 潮霉素	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
35 mm 玻璃底培养皿	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
琼脂糖	Sangon Biotech	A60015
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP5 II
环境培养箱	Pecon	temp control 37-2 digital
Eppendorf 微量移液吸头	Eppendorf	No.5242956003
玻璃显微镜载玻片	Bioland Scientific LLC	7105P
甘油	Sangon Biotech	A100854
培养箱	Keelrein	PH-140(A)
M.marinum			ATCC BAA-535
显微注射针	World Precision Instruments	IB100F-4
显微注射仪	Eppendorf	Femtojet
显微操作器	NARISHIGE	MN-151
msp12:cerulean			参考文献：PMID 25470057；27760340
酚红	Sigma	P3532
PTU	Sigma	P7629
单凹面玻璃显微镜载玻片	Sail Brand	7103
超声破碎仪	SCICNTZ	JY92-IIDN
分光光度计（OD600）	Eppendorf AG	22331 Hamburg
体视显微镜	OLYMPUS	SZX10
Tg(mfap4:eGFP)			参考文献：PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)			参考文献：PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)			参考文献：PMID 27424497；17477879