方法文章

通过活体显微镜观察斑马鱼胚胎中分枝杆菌感染期间巨噬细胞的裂解性细胞死亡

DOI：

10.3791/60698

⸱

2019年1月9日

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1Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, 2School of Life Sciences, Bengbu Medical College

本文内容

摘要

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本方案描述了一种在Mycobacterium marinum感染过程中对斑马鱼胚胎内巨噬细胞行为及死亡进行可视化观察的技术。内容包括细菌制备、胚胎感染以及活体显微成像的操作步骤。该技术可应用于类似感染或无菌性炎症情境下细胞行为与死亡的观察。

摘要

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斑马鱼因其在早期发育阶段具有透明特性且仅依赖先天免疫系统，是研究先天免疫细胞行为的优良模式生物。Mycobacterium marinum（M. marinum）感染的斑马鱼模型已被广泛用于研究宿主对分枝杆菌感染的免疫应答。已有研究表明，不同类型的巨噬细胞死亡将导致分枝杆菌感染结局的差异。本文描述了一种利用活体显微镜观察斑马鱼胚胎在M. marinum感染后巨噬细胞死亡的实验方案。通过在中脑或躯干部位进行肌肉内微量注射荧光标记的M. marinum，感染特异性标记巨噬细胞和中性粒细胞的斑马鱼转基因品系。随后将感染后的斑马鱼胚胎固定于低熔点琼脂糖中，并通过共聚焦显微镜在X-Y-Z-T四维维度下进行观察。由于长期活体成像需要使用低激光功率以避免光漂白和光毒性，因此强烈推荐使用荧光表达较强的转基因品系。该方案有助于在体内可视化免疫细胞迁移、宿主与病原体相互作用以及细胞死亡等动态过程。

引言

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已证明分枝杆菌感染可导致宿主免疫细胞死亡1。例如，减毒菌株会诱导巨噬细胞发生凋亡，从而控制感染；而毒力菌株则会引发裂解性细胞死亡，导致细菌扩散1,2。鉴于不同类型的细胞死亡对宿主抗分枝杆菌免疫反应具有重要影响，有必要在体内对分枝杆菌感染过程中巨噬细胞的死亡进行详细观察。

检测细胞死亡的传统方法是使用死细胞染料，例如Annexin V、TUNEL或吖啶橙/碘化丙啶染色3,4,5。然而，这些方法无法揭示体内细胞死亡的动态过程。体外细胞死亡的观察已可通过活细胞成像实现6。但这些结果是否能准确模拟生理条件仍不明确。

斑马鱼是研究宿主抗分枝杆菌反应的优良模型。其免疫系统与人类高度保守，基因组易于操作，且早期胚胎透明，便于进行活体成像7,8,9。感染

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方案

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斑马鱼在符合实验动物福利伦理审查的实验室动物指南（GB/T 35823-2018）的标准条件下饲养。本研究中的所有斑马鱼实验均经批准（2019-A016-01），并在复旦大学附属上海市公共卫生临床中心进行。

1. M. marinum 单细胞接种物的制备（图1）

  1. 从 -80 °C 取出含天蓝色荧光蛋白的 M. marinum 甘油菌种，接种于添加 10% (v/v) OADC、0.25% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H10 琼脂平板上。在 32 °C 下培养约 10 天。
  2. 挑选发出阳性荧光的单菌落，接种至 3 mL 含 10% OADC、0.5% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H9 培养基中。
    1. 在 32 °C、100 转/分钟（rpm）条件下培养 4–6 天，直至菌液进入对数生长期（OD600 = 0.6–1.0）。
    2. 按 1:100 比例转接至 30 mL 新鲜的 7H9 培养基中，培养基含 10% OADC、0.5% 甘油、0.05% Tween-80 和 50 μg/mL 潮霉素，继续培养至 OD600 达到约 1.0。
      注：为获得最佳培养质量，建议在此步骤进行转接培养。根据我们的经验，若直接将菌种接入大体积培养....

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结果

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结核分枝杆菌感染可因感染途径不同而引发不同的宿主反应。在本实验方案中，通过显微注射将荧光标记的细菌注入斑马鱼胚胎的中脑或躯干肌肉（图3），并利用共聚焦活体成像进行观察。通过这两种途径感染将使病原体局限于局部，引发先天免疫细胞的募集及随后的细胞死亡。

观察先天免疫细胞死亡的细节具有挑战性。裂解性细胞死亡发生的时间窗口非常短暂，需要高分辨率显微镜才能观察到。此外，先天免疫细胞具有高度运动性，容易迁移出观察区域。在本实验方案中，我们通过并行观察多个胚胎来解决这一问题。可将一排斑马鱼胚胎同时固定在单个玻璃载玻片上进行感染，最多可将10个胚胎固定在同一35 mm玻璃底培养皿中用于活体成像（图4）。利用共聚焦显微镜的实时数据模式，可同时观察多个胚胎。这提高了活体成像的效率，并显著增加了完整捕获整个裂解性细胞死亡过程的概率。

先天免疫系统是抵抗分枝杆菌感染的第一道防线，其中两个关键组分是巨噬细胞和中性粒细胞。本研究利用先前.......

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讨论

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本方案描述了分枝杆菌感染过程中巨噬细胞死亡的可视化方法。根据细胞膜完整性的不同，感染诱导的细胞死亡可分为凋亡和裂解性细胞死亡24,25。与凋亡相比，裂解性细胞死亡对机体的损伤更为严重，因为它会引发强烈的炎症反应24,25。由于需要高时空分辨率、合适的共聚焦显微镜设置以及强效的转基因表达，体内观察裂解性细胞死亡具有较大难度。

正确的显微注射需要多个关键步骤。注射前必须对细菌原液进行充分超声处理，以去除所有团块。我们通过将斑马鱼胚胎置于载玻片上两层低熔点琼脂糖之间进行包埋，从而改进了显微注射时的胚胎固定方法。在覆盖第二层琼脂糖后，应立即将载玻片转移至冰盒或冷表面，以加速凝固并防止琼脂糖脱水。若需将胚胎转移至不同的载玻片，务必通过添加额外的胚胎用水保持顶层琼脂糖湿润。

进行活体成像时，需要使用高分辨率.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢温子龙博士分享斑马鱼品系，Stefan Oehlers 博士和 David Tobin 博士分享 M. marinum 相关资源，何跃鹏在图示制备方面的协助。本工作得到国家自然科学基金（81801977）（B.Y.）、上海市卫生健康委员会优秀青年培养计划（2018YQ54）（B.Y.）、上海市扬帆计划（18YF1420400）（B.Y.）以及上海市结核病重点实验室开放基金（2018KF02）（B.Y.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% Tween-80SigmaP1379
10 mL 注射器SolarbioYA0552
10% OADCBD211886
3-氨基苯甲酸SigmaE10521
5 μm 滤膜Mille XSLSV025LS
50 μg/mL 潮霉素Sangon BiotechA600230
7H10BD262710
7H9BD262310
35 mm 玻璃底培养皿In Vitro ScientificD35-10-0-N
琼脂糖Sangon BiotechA60015
共聚焦显微镜LeicaTCS SP5 II
环境培养箱Pecontemp control 37-2 digital
Eppendorf 微量移液吸头EppendorfNo.5242956003
玻璃显微镜载玻片Bioland Scientific LLC7105P
甘油Sangon BiotechA100854
培养箱KeelreinPH-140(A)
M.marinumATCC BAA-535
显微注射针World Precision InstrumentsIB100F-4
显微注射仪EppendorfFemtojet
显微操作器NARISHIGEMN-151
msp12:cerulean参考文献：PMID 25470057；27760340
酚红SigmaP3532
PTUSigmaP7629
单凹面玻璃显微镜载玻片Sail Brand7103
超声破碎仪SCICNTZJY92-IIDN
分光光度计（OD600）Eppendorf AG22331 Hamburg
体视显微镜OLYMPUSSZX10
Tg(mfap4:eGFP)参考文献：PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)参考文献：PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)参考文献：PMID 27424497；17477879

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
  2. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathw....

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