通过生命内显微镜在斑马鱼胚胎的分孔细菌感染过程中巨噬细胞细胞死亡的可视化

分体菌感染已被证明会导致宿主免疫细胞死亡^1。例如，衰减菌株会触发巨噬细胞凋亡并控制感染。然而，毒株会触发溶血细胞死亡，导致细菌传播^1，2。考虑到这些不同类型的细胞死亡对宿主抗分体细菌反应的影响，需要详细观察体内分管感染期间的巨噬细胞死亡。

测量细胞死亡的常规方法是使用死细胞污渍，如安宁五，TUNEL，或丙氨酸橙/碘化钠染色^3，4，5。然而，这些方法无法揭示体内细胞死亡的动态过程。活成像⁶已经促进了体外细胞死亡的观察。然而，结果是否准确模拟生理状况仍不清楚。

斑马鱼是研究宿主抗分枝杆菌反应的极好模型。它有一个高度保守的免疫系统，类似于人类，一个容易操纵的基因组，和早期胚胎是透明的，允许活成像^7，8，9。感染M.Marinum后，成年斑马鱼形成典型的成熟肉芽肿结构，胚胎斑马鱼形成早期肉芽肿等结构^9，10。先天免疫细胞-细菌相互作用的动态过程在斑马鱼M.Marinum感染模型^11、12中已经探索。然而，由于高时空分辨率要求，有关先天免疫细胞死亡的细节在很大程度上仍未定义。

在这里，我们描述了如何可视化由体内分体细菌感染引发的巨噬细胞细胞死亡过程。此协议也可以应用于可视化发育和炎症期间体内的细胞行为。

斑马鱼是在标准条件下养殖的，符合实验室动物动物福利伦理审查准则（GB/T 35823-2018）。本研究的所有斑马鱼实验均获批（2019-A016-01），在复旦大学上海公共卫生临床中心进行。

1. M. 马里南单细胞接种制剂 （图 1）

1. 从 -80°C 解冻 Cerulean-荧光M. 大麻甘油，用 10% （v/v） OADC、0.25% 甘油和 50 μg/mL 湿霉素接种 7H10 琼脂板。在32°C下孵育板约10天。
2. 选择表达阳性荧光的菌群，用10%OADC、0.5%甘油和50μg/mL湿霉素接种3mL的7H9介质。
   1. 在32°C和每分钟100转（rpm）孵育4~6天，直到培养达到对数阶段（OD₆₀₀ = 0.6±1.0）。
   2. 在 30 mL 的新鲜 7H9 介质中分培养 （1:100），含有 10% OADC、0.5% 甘油、0.05% 补间-80 和 50 μg/mL，直到 OD₆₀₀达到 ±1.0。
      注: 对于最高的文化质量，此时建议执行亚文化步骤。根据我们的经验，将克隆直接添加到大体积的介质中将导致细菌团群的形成。
3. 收集M. Marinum细胞，如下所述。
   1. 在 3，000 x g下离心 10 分钟，以收集M. Marinum作为颗粒。丢弃所有上清液（300 μL）外的所有液，并用它来重新悬浮颗粒。
   2. 加入3 mL的7H9介质与10%甘油进一步重新悬浮颗粒，然后在水浴中以100W在15s ON，15s OFF共2分钟。
      注:声波的目的是实现接种的单细胞均质，这将防止显微注射针堵塞。
4. 将细菌悬浮液转移到10 mL注射器，然后通过5μm过滤器去除任何细菌团块。
5. 使用分光光度计测量悬浮液的光密度 （OD），并用含有 10% 甘油的 7H9 介质将其稀释至 OD₆₀₀ = 1.0。将悬架分成10μL等分，储存在-80°C冷冻室，供将来使用。
6. 通过在含有OADC10%（v/v）、0.5%甘油和50微克/mL的湿霉素的7H10琼脂板上对细菌存量进行连续稀释和电镀，确认接种液（cfu/mL）的细菌浓度。

2. 斑马鱼胚胎制备

1. 产卵前一天，在繁殖室建立了斑马鱼繁殖对。
   注:每个繁殖室只添加一对。
2. 第二天早上在受精后1小时（hpf）内收集胚胎。用蒸馏水仔细清洗胚胎，将多达 100 个胚胎转移到含有 30 m3 培养基的 100 mm 培养皿中。在28.5°C孵育。
3. 12小时后，在显微镜下观察并丢弃未受精或损坏的鸡蛋。
4. 在24 hpf时，用N-苯基尿酸（PTU，0.2 nM最终浓度）将培养基改为新鲜的E3介质，以防止色素的发展。在28.5°C下孵育胚胎，直到胚胎准备好进行显微注射。

3. 通过细菌微注射感染

1. 如参考文献¹³所述，制备硼硅酸盐玻璃微毛细管注射针。
2. 斑马鱼胚胎安装感染
   1. 微波 100 mL 1% （w/v） 和 100 mL 0.5% （w/v） 低熔甘蔗在灭武E3介质，直到甘蔗完全融化。分成1 mL等分管，储存在4°C，供将来使用。
   2. 使用前，在 95°C 加热块中加热角贺金，直到完全熔化。将角贺金置于45°C加热块中，保持液态的角甘蔗（图2）。
   3. 在躯干区域为肌肉内感染安装
      1. 通过将 0.5 mL 的 1% （w/v） 蔗甘蔗均匀浇注到玻璃玻片上，创建底部的甘蔗层。放在冰盒或冷表面上3分钟凝固。
      2. 在安装前用三角鱼（200μg/mL）和PTU在蛋水中麻醉斑马鱼胚胎（48-72 hpf）。将多达60个斑马鱼胚胎放在底部的琼脂草层上，并小心地将它们排列成两排（图2B）。
      3. 用纸巾去除底部角贺玫瑰层上剩余的水，然后加入0.3 mL 0.5%（w/v）角玫瑰，以创建上层。确保胚胎完全嵌入在甘蔗中。再次将玻璃滑块返回到冰盒，以凝固角质，防止脱水。
      4. 用额外的E3蛋水覆盖表面，保持甘蔗的顶层湿润。
   4. 安装中脑感染
      1. 用1%（w/v）角胶覆盖单个凹陷玻璃显微镜滑块的凹槽，然后将4⁄6三硝基麻醉胚胎转移到角胶中。
      2. 用10G针小心地将每个胚胎的头部向上放置（图2C）。
      3. 一旦所有胚胎的位置固定，将玻璃滑块转移到冰盒或冷表面，让角质凝固。
         注:通过尽量减少卵子水与胚胎的转移量，避免稀释低熔化的甘蔗。
3. 细菌准备感染
   1. 将1μL的无菌过滤苯酚红（10x）加入10μL等分的细菌库存（在步骤1中制造），然后通过涡旋短暂混合。
      注:最终浓度可使用无菌PBS调节。
   2. 在 10 s ON 时使用 100 W 的声波准备，10 s OFF 1 分钟，以分解可能形成¹⁴的任何团块。
4. 通过微注射感染
   1. 如前¹³例所述，将显微注射器和显微操作器调整到显微注射的正确位置和设置。
   2. 使用微型装载机将细菌制剂的 3 μL 转移到制备的针头中（参见步骤 3.1）。移液缓慢而小心，以避免形成气泡。
   3. 对于主干区域感染，将100 cfu注射到躯干区域（图3A）。避免将细菌注射到诺托乔德中。
      注: 注射的cfu由配方cfu = 细菌库存浓度x稀释因子x注射液体积估计。通过在含有OADC10%（v/v）、0.5%甘油和50微克/mL的湿霉素的7H10琼脂板上电镀一滴细菌接种，证实了实际的cfu。
   4. 对于中脑感染，将大约500 cfu注射到中脑区域（图3B）。
   5. 微注射后，用塑料移液器小心地将斑马鱼胚胎冲洗到新鲜的蛋水中。
      注:尽快将胚胎植入玻璃底盘中，以覆盖早期先天免疫细胞反应的观察。

4. 感染的现场成像

1. 用于实时成像的鱼安装
   1. 将多达 10 个三叶草麻醉胚胎转移到玻璃底部 35 mm 盘中。丢弃额外的 E3 介质。
   2. 用1%的低熔点琼脂覆盖盘子，用10G针小心地定向斑马鱼胚胎。在冰上孵育玻璃底盘10s，以凝固角质。
      注:对于中脑注射，胚胎应安装在带朝上头部的囊中（图4A）。对于躯干区域肌肉内感染，胚胎应横向安装在肌蔗内（图4B）。
   3. 一旦它完全凝固，用一层蛋水覆盖角胶（加上1 x三叶草和PTU）。
2. 三色高分辨率时移共聚焦显微镜
   注:以下步骤在配备 63.0x 1.40 油紫外线物镜的共聚焦显微镜上操作。
   1. 将环境室的温度设置为 28.5 °C。在腔室内放置一些湿纸巾，以提供湿度并防止蛋水蒸发（补充图1）。
   2. 将 35 mm 玻璃底盘与斑马鱼放在环境室中。
   3. 打开共聚焦软件并初始化舞台。切换到 63.0 x 1.40 油紫外线目标，并使用带差分干涉对比度 （DIC） 过滤器的明亮场通道定位斑马鱼。
   4. 打开 405 二极管、Argon（20% 功率）和 DPSS 561 nm 激光器。设置适当的激光功率和频谱设置。
      注:以下是Cerulean的频谱设置（激励= 405 nm;发射 = +456–499 nm）、eGFP（激励 = 488 nm;发射 = +500*550 nm）、DsRed2（激励 = 561 nm;发射 = +575–645 nm）（补充图2B）。
   5. 选择"XYZ""顺序扫描"采集模式，并将图像格式设置为"512 x 512像素"（补充图2A）。
   6. 切换到"实时数据模式"。瞄准第一条斑马鱼的位置，并标记"开始"和"结束"Z位置。对每个剩余的胚胎重复此过程。可以在程序末尾添加"暂停"（补充图2C）。
   7. 定义程序的循环和周期。
   8. 保存文件。

5. 单细胞紫外线照射诱导凋亡和活成像

1. 如步骤 4.1 所述，安装鱼。
2. 成像中脑区域3天后受精（dpf）巨噬细胞特异性转基因Tg（mfap4-eGFP）胚胎¹⁵
3. 选择单个荧光标记巨噬菌体的感兴趣区域，以 400 Hz 速度扫描，以 6% 的紫外线激光功率扫描 50 s。
   注:扫描速度和时间应根据单个显微镜进行优化。扫描时间应加以优化，以引起广泛的DNA损伤，进而导致目标细胞凋亡，但不会对整个细胞进行光漂白。
4. 重复上述步骤，照射更多目标细胞。
5. 如第 4 节所述，对中脑区域执行时差成像。

6. 图像处理

1. 对采集的图像执行"最大投影"。
2. 在"最大投影"视图下查找并标记目标单元格的 XY 位置和时间。
3. 返回标准视图以查找并标记目标单元格的 Z 位置。
4. 裁剪目标单元格的单层图像。
5. 以 AVI 格式将叠加通道和明亮字段导出为视频。
6. 在 ImageJ 中裁剪叠加通道和明亮字段的感兴趣区域。
7. 将最后一步中的两个视频垂直合并，并将其另存为 ImageJ 中的一个 AVI 格式视频。

分枝杆菌感染可以触发不同的宿主响应，根据感染途径。在此协议中，斑马鱼胚胎通过肌肉内微注射荧光标记的细菌进入中脑或躯干（图3），并通过共聚焦活成像进行观察。通过这两种途径的感染将局部限制感染，导致先天免疫细胞招募和随后的细胞死亡。

可视化先天免疫细胞死亡的细节是具有挑战性的。溶血细胞死亡发生在很短的时间窗口，需要高分辨率显微镜观察。此外，先天免疫细胞的高运动性允许它们迁移到观察区域。在这个协议中，我们通过同时观察多个胚胎来解决这个问题。一系列斑马鱼胚胎可以安装在单个玻璃显微镜幻灯片上进行感染，最多10个胚胎可以安装在同一个35毫米玻璃底盘上进行活成像（图4）。通过利用共聚焦显微镜的实时数据模型，可以同时观察到多个胚胎。这提高了活成像的效率，并大大增加了捕获整个溶血细胞死亡过程的概率。

先天免疫系统是预防分组细菌感染的第一道防线，两个关键组成部分是巨噬细胞和嗜中性粒细胞。在这里，我们利用以前报道的Tg（coro1a:eGFP;lyzDsRed2）和Tg（mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP）来区分体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞16、17、18。大量细菌的巨噬细胞变圆，显示出运动性下降，最终导致细胞质肿胀，细胞膜破裂，细胞质含量迅速传播。这些事件是溶血细胞死亡的典型形态变化，如先前报告（图5A）16所示。紫外线照射已被用来触发细胞在斑马鱼20，21细胞凋亡。与这一概念一致，紫外线辐照巨噬细胞表现出典型的细胞表型，如细胞收缩、核碎片和染色质凝结（图5B）22、23。结合Cerulean-荧光M.Marinum19的使用，在体内实现了巨噬细胞、嗜中性粒细胞和M.马里南三种颜色的活成像。我们还观察到巨噬细胞可以积极地噬菌体和传播M.Marinum（补充图3A）。然而，嗜中性粒细胞的吞噬能力有限，并迅速进行溶血细胞死亡，没有明显的细菌感染（补充图3B）。中性粒细胞可能由少数不表达Cerulean-荧光的死马那的噬菌体，或仅仅是由有限的死细胞碎片的噬菌体引起的。

图1:单细胞细菌制备的原理图。单细胞 Cerulean-荧光M. 马里南股票是在所述过程之后生成的。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:用于显微注射的斑马鱼胚胎安装图。（A） 安装过程的原理图.（B） 斑马鱼胚胎被横向安装，以感染躯干区域.（C） 斑马鱼胚胎被安装，其头部朝上，以感染中脑。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:显微注射定位。（A） 红色箭头表示主干区域感染的注射部位。（B） 红色箭头表示中脑感染的注射部位。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:安装斑马鱼胚胎进行活体成像。（A） 对于中脑感染，斑马鱼胚胎的安装方向朝下。（B） 对于躯干区域感染，斑马鱼胚胎被横向安装，注射部位靠近玻璃底盘的底部。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:M.Marinum感染的典型形态变化诱发巨噬细胞死亡和紫外线诱发巨噬细胞凋亡。（A） 一个巨噬细胞（Mac）经历的溶血细胞死亡，一旦它被严重包裹在M.Marinum的时移成像。3 dpf Tg（coro1a:eGFP;lyzDsRed2）斑马鱼胚胎的中脑通过显微注射感染了Cerulean-荧光M.Marinum（+500 cfu）。提供叠加通道（上面板）和 DIC 通道（下面板）的图像。T 00:00 是感染后 5 小时 20 分钟。白色虚线 = 细胞膜的轮廓;黑色虚线 = 膨胀细胞质;黑色箭头 = 破裂的细胞膜;红色虚线 = 迅速失去细胞质含量。（B） 紫外线辐照巨噬菌体的时差成像.3 dpf Tg（mfap4:eGFP）中脑区域的一个GFP+细胞受到紫外线照射，随后进行时差成像。白色虚线 = 细胞膜的轮廓;黑色箭头 = 核碎片和染色质凝结。刻度条 = 15 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

补充图1:为实时成像设置的环境室。（A） 设置数字控制器，使温度保持在 28.5 °C。（B） 在室内设置湿巾，以提供湿度，防止蛋水蒸发。（C） 关闭造型室的盖板，等待至少 30 分钟，以稳定温度，然后再开始实时成像。请点击此处查看此图的较大版本。

补充图 2:用于实时成像的共聚焦面板设置。（A） 采集面板设置的表示。（B） 激光功率和频谱设置的表示。（C） 表示实时数据模式下的多个作业和循环设置。请点击此处查看此图的较大版本。

补充图3:巨噬细胞传播感染，中性粒细胞在M.Marinum感染后发生溶血细胞死亡。（A） 巨噬菌体在 2 dpf Tg（coro1a:eGFP;lyz:DsRed2）斑马鱼胚胎的躯干中传播M. Marinum（+100 cfu）。 （B） 中性粒细胞 （Neu） 通过显微注射在 3 dpf Tg（mpeg1:LRLG;lyz:eGFP）斑马鱼胚胎的躯干区域中发生无明显的M. Marinum载症的溶血细胞死亡。 绿色分配给LRLG，红色分配给eGFP，以便更好地可视化溶酶细胞死亡过程。青色中的箭头表示目标细胞。红色箭头指向即将释放下一帧中细胞质内容物的细胞。绿色箭头指向刚刚失去细胞质含量的死细胞。刻度条 = 25 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

视频1:一个巨噬细胞重满载M.Marinum经历溶血细胞死亡，与图5A有关。延时成像（63x物镜）9分钟和18秒，以3帧每秒（fpss）的中脑区域的3dpf Tg（coro1a:eGFP;lyzDsRed2）斑马鱼胚胎感染Cerulean-荧光M.马里南。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

视频2:巨噬细胞在紫外线照射后凋亡，与图5B有关。在3dpf Tg（mfap4:eGFP）斑马鱼胚胎的中脑区域6fps处，延时成像（63x物镜）为74分钟。胚胎中脑区域的一个GFP®细胞受到紫外线照射，然后进行时差成像。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

视频3:巨噬菌体传播M.Marinum，与补充图3A相关。在2 dpf Tg（coro1a:eGFP;lyz:DsRed2）斑马鱼胚胎感染Cerulean-荧光M.马里纳姆的躯干区域3fps处，24分钟（63x物镜）的延时成像（63x物镜）请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

视频4:与补充图3B相关的中性粒细胞经历溶血细胞死亡，没有明显的M.Marinum灌注。延时成像（63x目标）7分30秒在3dpf Tg（mpeg1:LRLG;lyz:eGFP）斑马鱼胚胎感染Cerulean-荧光M.马里纳姆的躯干区域3fps。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

作者没有什么可透露的。