该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。
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本文内容
摘要
摘要
评估蛋白质组中泛素链拓扑结构的全局谱型对于回答多种生物学问题具有重要意义。本方案利用泛素在链中被胰蛋白酶消化后留下的二甘氨酸（-GG）修饰，通过定量这些具有拓扑结构特征的肽段，可确定每种泛素链拓扑结构的相对丰度。本文报告了在考虑泛素链稳定性的前提下，采用平行反应监测实验定量这些肽段所需的步骤，内容包括重标控制样品的制备、细胞裂解、消化过程，以及相应的质谱仪设置和数据分析流程。文中提供了一个泛素拓扑结构发生扰动的示例数据集，并展示了方案优化如何影响实验结果的实例。遵循本方案所述步骤，使用者可在其特定的生物学背景下对泛素拓扑结构图谱进行全面评估。
引言
蛋白质功能与稳定性的严密调控至关重要，因为它们是生物表型控制的主要驱动因素。蛋白质的功能由两个部分构成：其内在的多肽序列以及任何翻译后修饰（PTMs）。目前已鉴定出多种化学性质的翻译后修饰，包括糖基化、磷酸化、乙酰化和甲基化1。1975年，Goldstein 等人2发现了一种小分子蛋白质，并因其广泛存在于各类细胞中而将其命名为泛素（ubiquitin）。研究发现泛素在蛋白质降解过程中具有重要作用3。然而，自此之后人们逐渐认识到，泛素作为信号分子的功能远不止调控蛋白质稳定性。泛素信号通路还参与多种其他生物学过程，如蛋白质稳定、自噬、细胞周期调控以及蛋白质转运4。
对于特定修饰位点，其他蛋白质翻译后修饰通常是二元的（即蛋白质被修饰或保持未修饰状态），而泛素化修饰则不同，它既可以以单体形式修饰蛋白质，也可以形成多聚链结构，其中连接上的泛素分子自身还可被进一步泛素化。此外，这种多聚泛素链可通过多种拓扑结构形成，前一个泛素分子上的泛素化可连接至其八个连接位点之一5,6。泛素通过一个多步酶促过程进行转移（图1），其中泛素的C....
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方案
1. 重肽标准品的制备
- 根据所购重标肽的供应商和质量，可能需要对重标肽进行稀释。本方案使用了表1中列出的肽段序列，其C端氨基酸修饰为赖氨酸（13C615N2-lysine）或精氨酸（13C615N4-arginine）。
- 混合重标肽，用50%乙腈（ACN）稀释，制备每种肽浓度为10 µM的肽段混合液。
- 将肽段混合液分装成若干 aliquot，于-80 °C保存。
2. 样品制备
- 样品裂解
注意：在样品制备过程中必须考虑泛素链的稳定性。保持生物样品和缓冲液在 4 °C 下冷藏，并尽快将样品加入泛素稳定缓冲液中。- 配制 1 M NH4HCO3（碳酸氢铵）水溶液，并用 1 M NaOH 将 pH 调至 8。
- 配制 200 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）水溶液。
- 使用含 8 M 尿素的 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM 配制泛....
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结果
为了展示通过PRM进行泛素链分析的应用，选择了三种细胞系：小鼠黑色素瘤细胞系B16，以及两种常用的人源细胞系A549（腺癌肺泡基底上皮细胞）和HeLa（宫颈癌细胞）。这些细胞在各自适宜的培养基中生长至对数中期，随后在收获前分别用0、10或100 mM MG-132处理4小时。MG-132是一种蛋白酶体抑制剂，可阻止蛋白酶体降解泛素偶联的蛋白质14。因此，该处理条件适用于演示泛素链分析。K48链的相应增加可见于图3。蛋白酶体抑制剂处理导致K48链水平上升15。
如引言所述，与SRM或MRM不同，PRM在选择前体离子后会进行完整的产物离子扫描。这意味着在运行前无需预先指定产物离子，但仍需在运行后对产物离子进行筛选。筛选是指选择最能代表目标肽段的真实转换离子的过程。图4展示了K48在筛选前后产物离子的色谱图。那些由于干扰导致洗脱曲线不一致的产物离子信号已被剔除。随后，低强度的.......
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讨论
对蛋白质组中泛素化状态的分析在越来越多的生物学问题中具有重要意义。对样品泛素化状态的描述，不仅需要关注被泛素化修饰的蛋白质谱，还需关注这些泛素化修饰的拓扑结构。如本文所述，通过靶向质谱法对这种拓扑结构进行评估，在广泛的生物学研究中具有重要作用。
应当理解，此处所述方案提供的是泛素链的全局拓扑谱型。采用自下而上的蛋白质组学方法可鉴定发生泛素化的肽段，包括泛素自身肽段。通过检测泛素肽段的泛素化修饰，可推断泛素链的连接拓扑结构，但此时泛素链与原始靶蛋白之间的连接信息已丢失。因此，无法确定特定蛋白质上具体的泛素链拓扑结构，而仅能获得整体的拓扑谱型。该方法还可结合富集策略以获得更具针对性的结果。此类富集策略必须考虑泛素链的稳定性及其在富集后的丰度。链拓扑结构的检测受限于富集策略所提供的纯度，因为无法区分与污染蛋白相连的泛素拓扑结构和与目标蛋白相连的泛素拓扑结构。本方案中的关键步骤在于，在消化泛素蛋白的同时保持泛素链的完整性，这是实现成功分析的前提。这一过程具有挑战性，原因在于泛素链易于降解，而泛素蛋白本身又对酶解具有较强抗性。此外，由于某些具有拓扑特征的肽段在液相色谱-质谱联用分析中的表现不.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者感谢Céline Jeanty在制备经MG-132处理的细胞沉淀（如代表性结果中所述）过程中提供的帮助，以及Elise Mommaerts为本方案提供的大肠杆菌（E. coli）沉淀。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈（ACN） | Merck | 100029 | |
| 碳酸氢铵（ABC） | Fluka | 9830 | |
| 离心机 | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| 氯乙酰胺（CAA） | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| 甲酸（FA） | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| 重链肽（Heavy Peptides） | JPT Peptide Technologies | ||
| 高效液相色谱仪（HPLC） | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| 液相色谱柱（LC Column） | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-乙基马来酰亚胺（NEM） | ACROS Organics | 156100050 | |
| 阳性对照链 K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| 阳性对照链 K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| 阳性对照链 M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma | S5881 | |
| 超声破碎仪 | Branson sonifier | SFX 150 | |
| 温控混匀仪 | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| 三氟乙酸（TFA） | Sigam | T6508 | |
| 三(2-羧乙基)膦（TCEP） | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V1511A | |
| 尿素 | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 板 | Waters | 186002318 |
参考文献
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
- Goldstein, G., et al.
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