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方法文章

泛素链的平行反应监测分析

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DOI：

10.3791/60702

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2020年6月17日

 ,  , 
1Quantitative Biology Unit, Luxembourg Institute of Health

本文内容

摘要

该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。

摘要

评估蛋白质组中泛素链拓扑结构的全局谱型对于回答多种生物学问题具有重要意义。本方案利用泛素在链中被胰蛋白酶消化后留下的二甘氨酸（-GG）修饰，通过定量这些具有拓扑结构特征的肽段，可确定每种泛素链拓扑结构的相对丰度。本文报告了在考虑泛素链稳定性的前提下，采用平行反应监测实验定量这些肽段所需的步骤，内容包括重标控制样品的制备、细胞裂解、消化过程，以及相应的质谱仪设置和数据分析流程。文中提供了一个泛素拓扑结构发生扰动的示例数据集，并展示了方案优化如何影响实验结果的实例。遵循本方案所述步骤，使用者可在其特定的生物学背景下对泛素拓扑结构图谱进行全面评估。

引言

蛋白质功能与稳定性的严密调控至关重要，因为它们是生物表型控制的主要驱动因素。蛋白质的功能由两个部分构成：其内在的多肽序列以及任何翻译后修饰（PTMs）。目前已鉴定出多种化学性质的翻译后修饰，包括糖基化、磷酸化、乙酰化和甲基化1。1975年，Goldstein 等人2发现了一种小分子蛋白质，并因其广泛存在于各类细胞中而将其命名为泛素（ubiquitin）。研究发现泛素在蛋白质降解过程中具有重要作用3。然而，自此之后人们逐渐认识到，泛素作为信号分子的功能远不止调控蛋白质稳定性。泛素信号通路还参与多种其他生物学过程，如蛋白质稳定、自噬、细胞周期调控以及蛋白质转运4。

对于特定修饰位点，其他蛋白质翻译后修饰通常是二元的（即蛋白质被修饰或保持未修饰状态），而泛素化修饰则不同，它既可以以单体形式修饰蛋白质，也可以形成多聚链结构，其中连接上的泛素分子自身还可被进一步泛素化。此外，这种多聚泛素链可通过多种拓扑结构形成，前一个泛素分子上的泛素化可连接至其八个连接位点之一5,6。泛素通过一个多步酶促过程进行转移（图1），其中泛素的C末端可连接至其七个赖氨酸残基之一（K06、K11、K27、K29、K33、K48 或 K63），或连接至前一个泛素的N末端（称为M1或线性泛素化）5,6。这种泛素链的拓扑结构决定了被修饰蛋白质的命运。例如，K48或K11连接的泛素链修饰会导致被修饰蛋白在蛋白酶体中降解，而线性泛素链则是激活NF-κB信号通路所必需的。因此，这些泛素链拓扑结构的相对分布与多种生物学问题密切相关。

质谱法（MS）在泛素链拓扑结构分析中具有显著优势，因为它不依赖于基于抗体或亲和力的相互作用7,8，而许多此类方法特异性有限，无法区分不同类型的泛素链。另一种检测方法是使用基因修饰的泛素突变体。在此方法中，特定的赖氨酸被精氨酸取代，而精氨酸无法支持泛素修饰。当底物蛋白上缺乏泛素链形成时，即被解释为存在特定拓扑结构的证据9。

基于质谱的泛素化蛋白质鉴定依赖于以下事实：泛素C末端第74位为精氨酸残基，在样品进行质谱分析前的蛋白酶解制备过程中可被胰蛋白酶识别，从而切割并释放C末端的双甘氨酸。该双甘氨酸（-GG）仍连接在底物蛋白赖氨酸残基的ε-氨基上。对于泛素拓扑结构分析，修饰发生在泛素的七个赖氨酸残基之一上，由此产生一组七个特征性肽段，每个肽段均含有一个被GG修饰的赖氨酸残基，且各自对应特定的拓扑结构（图2）。例如，在K06拓扑结构中，氨基酸序列第6位的赖氨酸因带有114 Da的-GG修饰而受到保护，不被胰蛋白酶消化。

通过质谱法鉴定特定预设肽段的方法被称为靶向蛋白质组学，或更具体地称为靶向肽段获取10。根据所用质谱仪的性能，已发展出两种方法：选择反应监测（SRM），也称为多反应监测（MRM），以及平行反应监测（PRM）。SRM需要选定由前体离子质荷比（m/z）和产物离子质荷比（m/z）组成的特定转换反应。相反，PRM仅需指定前体离子的m/z。在前体离子选择后，会对所有产物离子进行完整的全扫描。这种方法的优势在于，无需在测量前针对特定质谱仪预先选定用于定量分析的合适产物离子11。SRM和PRM均可根据仪器情况设置时间调度。调度是指为某一离子分配一个特定的时间窗口，使其在此期间被纳入分析，因为肽段会以确定的保留时间从色谱系统中洗脱出来。在任意给定时间减少被检测的离子数量，可提高该时段内被调度离子的检测频率，从而提升数据的准确性。

通常情况下，靶向蛋白质组学在泛素拓扑结构研究中的应用与其他靶向蛋白质组学实验相同。然而，有两个关键差异值得注意：第一，必须考虑泛素链的稳定性。细胞裂解后，多种强效的去泛素化酶（DUBs）会迅速降解泛素链。泛素特异性蛋白酶可分为两类：硫酯酶和金属蛋白酶。大多数泛素水解酶属于硫酯酶，其活性中心含有一个半胱氨酸残基。通过烷基化该半胱氨酸残基，可使其失活。因此，在实验中使用含有烷基化试剂（如N-乙基马来酰亚胺，NEM）以及强变性化学物质的泛素稳定缓冲液，并始终保持样品处于低温状态，对于成功分析至关重要。第二，与其它靶向实验不同，肽段的选择是固定的。在典型的靶向实验中，可选择具有优良色谱和电离性能的蛋白质组型肽段。对于某些具有拓扑结构特征的肽段（如K48），这些性质表现良好；但对于其他肽段则不够理想。例如，在典型的反相色谱条件下，K33肽段因形成拉长的洗脱峰型而导致色谱性能较差，而K27肽段较差的电离特性则降低了其在质谱检测中的可见性12。

在本方案中，我们描述了如何通过PRM方法对生物样本进行泛素化拓扑结构分析。实验流程的示例数据来自在多种不同细胞类型中使用MG-132抑制剂处理干扰蛋白酶体后的结果。

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方案

1. 重肽标准品的制备

  1. 根据所购重标肽的供应商和质量，可能需要对重标肽进行稀释。本方案使用了表1中列出的肽段序列，其C端氨基酸修饰为赖氨酸（13C615N2-lysine）或精氨酸（13C615N4-arginine）。
    1. 混合重标肽，用50%乙腈（ACN）稀释，制备每种肽浓度为10 µM的肽段混合液。
    2. 将肽段混合液分装成若干 aliquot，于-80 °C保存。

2. 样品制备

  1. 样品裂解
    注意：在样品制备过程中必须考虑泛素链的稳定性。保持生物样品和缓冲液在 4 °C 下冷藏，并尽快将样品加入泛素稳定缓冲液中。
    1. 配制 1 M NH4HCO3（碳酸氢铵）水溶液，并用 1 M NaOH 将 pH 调至 8。
    2. 配制 200 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）水溶液。
    3. 使用含 8 M 尿素的 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM 配制泛素稳定缓冲液。该缓冲液必须每次新鲜配制。
      注意：由于尿素在饱和溶液中会导致水体积膨胀，配制 5 mL 的 8 M 尿素溶液所需水量远少于 5 mL。
      警告：不要在高于 50 °C 的条件下配制缓冲液，因为尿素在高温下易形成聚脲。
    4. 将待检测的生物样品重悬于泛素稳定缓冲液中，目标蛋白浓度为 0.5 µg/µL，并采用适合样品类型的适当方法进行细胞裂解。本方案中使用的细胞系采用超声处理法：使用 SFX 150 Branson 超声破碎仪，以 70% 强度进行三次、每次 10 秒的脉冲处理，每次脉冲之间在冰上间隔 10 秒。
    5. 在台式离心机中，4 °C 下以 18,000 x g 离心 10 分钟。
    6. 将上清液转移至新的低蛋白结合微离心管中。如需保存，样品可在此阶段储存于 -20 °C。
  2. 样品与对照的准备
    1. 若样品为冷冻状态，在解冻过程中混合（例如使用温控混匀仪），以快速溶解尿素。
      警告：不要使用高于 50 °C 的温度，因为尿素在高温下易形成聚脲。
    2. 在台式离心机中，4 °C 下以 18,000 x g 离心 10 分钟。
    3. 取 20 µg 样品转移至新的低吸附微离心管中，并用泛素稳定缓冲液调整体积至 50 µL。
    4. 使用等体积的泛素稳定缓冲液（50 µL）建立阴性对照。该样品中不应含有任何轻链版本的肽段，以便观察由内标重链肽段引入的任何轻链污染。该阴性对照也用于第 3.1 节所述 PRM 方法的保留时间调度。
    5. 同时建立阳性对照：在等体积泛素稳定缓冲液（50 µL）中加入 commercially available 链类型。常见的链类型包括 K63、K48 和 M1。在代表性结果中，使用了 20 ng 的 K48、K63 和 M1 链。
  3. 还原、烷基化与消化
    1. 配制 50 mM 碳酸氢铵（NH4HCO3）水溶液，并用 1 M NaOH 将样品 pH 调至 8。
    2. 将 LB 培养基中培养的 E. coli 菌液在 5,000 x g 条件下离心 5 分钟形成菌体沉淀，用 PBS 洗涤两次后，重悬于泛素稳定缓冲液中，浓度为 5 μg/μL。
    3. 向每个样品和对照中加入 1 µg E. coli 裂解物。本方案使用 E. coli（DH10B），但任何不含泛素的复杂裂解物均可使用。需注意，泛素存在于所有真核生物中。
      注意：使用 E. coli 裂解物基质可减少肽段因非特异性吸附至塑料器皿而造成的损失。这一效应在阴性对照或蛋白含量较低的样品中尤为明显，对 K6312 的检测具有显著影响。
    4. 配制 500 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）的质谱级水溶液（可使用 DTT 作为替代）。
    5. 通过加入 TCEP 将样品和对照的终浓度调整为 50 mM 进行还原。短暂涡旋混匀后，在室温（RT）孵育 30 分钟。若使用 DTT，则需将孵育温度升至 50 °C。
      警告：不要使用高于 50 °C 的温度，因为尿素在高温下易形成聚脲。
    6. 配制 550 mM 氯乙酰胺（CAA）的 NH4HCO3 溶液，避光保存。
    7. 通过加入 CAA 将样品和对照的终浓度调整为 55 mM 进行烷基化。短暂涡旋混匀后，在室温避光条件下孵育 20 分钟。
      注意：使用 CAA 而非碘乙酰胺作为还原剂，是为了降低赖氨酸残基上发生双重羧氨甲基化修饰（114.0429）被误认为 -GG 修饰（114.0429）的可能性13。
    8. 按蛋白含量 1:25（w/w）的比例向样品中加入内切蛋白酶 LysC，在 37 °C 孵育 3 小时。
    9. 用 200 µL 的 50 mM NH4HCO3（pH = 8）稀释样品和对照（1:5 v/v）。
    10. 按蛋白含量 1:25（w/w）的比例向样品中加入胰蛋白酶，在 37 °C 孵育 12 小时。
    11. 向每个样品和对照样品中加入 10% 的甲酸（FA）质谱级水溶液（v/v 1:10）。在进行 C18 净化前，检查 pH 是否 <3），必要时补充甲酸。
    12. 向每个样品和对照中加入 0.5 µL 第 1 节中制备的重链肽标准品。
  4. 肽段净化
    1. 多家厂商提供 C18 净化小柱或板。请遵循所用产品的制造商说明操作，并将洗脱的肽段在真空离心浓缩仪中干燥，以备质谱分析。

3. 采用液相色谱-串联质谱法进行分析

  1. 以非预定方式对重肽标准品进行初始 PRM 分析。
    1. 用 10 µL 的质谱上样缓冲液（含 2% 乙腈和 0.05% 三氟乙酸，ACN/0.05% TFA）重悬干燥样品。
    2. 在高效液相色谱仪上配备用于纳流质谱分析的反相 C18 分析柱（75 µm × 15 cm，2 µm，100 Å C18 填料），并建立线性梯度洗脱程序，使用含 0.1% 甲酸（FA）的质谱级水与含 0.1% FA 的乙腈（ACN）进行梯度洗脱。此处使用了一根牺牲式捕获柱（75 µm × 2 cm，3 µm，100 Å C18 填料）以延长分析柱寿命，但该步骤并非必需。
    3. 将分析柱的流出液连接至高分辨质谱仪上的纳米电喷雾离子源（nano-ESI）。
    4. 为质谱仪设置合适的靶向蛋白质组学方法。例如，在 Q-Exactive Plus 仪器上采用双实验方法，交替运行全扫描质谱（Full MS）和 PRM 实验。在全扫描质谱实验中，分辨率设为 120,000，自动增益控制（AGC）目标值为 1e6，最大离子注入时间（Maximum IT）为 240 ms；在 PRM 实验中，使用相同的 AGC 目标值和最大离子注入时间，分辨率为 60,000，隔离窗口为 1.2 m/z。
    5. 通过高效液相色谱自动进样器将 200 ng 的阴性对照样品注入分析柱，并在分析柱上施加线性梯度洗脱程序，使乙腈浓度在约 45 分钟内从 2% 升至 25%。
      注：由于典型的泛素拓扑结构特征性肽段亲水性较低，因此此处使用的 25% 乙腈浓度低于常规蛋白质组学分析。若需定量其他肽段，可能需要更高的乙腈浓度以实现良好的目标分离。
    6. 按照第 4.2 节所述方法分析预定运行结果，生成预定包含列表（scheduled inclusion list）。
  2. 样品分析
    1. 除使用第 4.2 节中生成的预定包含列表外，其余操作均按照 3.1 节所述的预定运行方法对剩余样品进行分析。
      注：在阳性对照之后必须运行一次空白样品，以确保后续样品中未检测到来自前一次运行的残留信号（carryover）。

4. 软件分析

  1. 为所使用的质谱仪创建适当格式的包含列表。本方案使用开源软件 Skyline（版本 19.1.0.193）（https://skyline.ms），该软件提供完善的文档支持与帮助功能。可利用导出隔离列表功能为多种质谱仪创建包含列表。
    1. 打开一个新的 Skyline 文档。
    2. 根据重同位素标记的拓扑特征肽选择相应的重同位素修饰。在 设置|肽段设置 的 修饰 选项卡下，点击名称字段以查看可能的修饰选项。选择依据为所购重肽的同位素状态。在本示例中，使用了在C末端携带重赖氨酸（13C615N2-赖氨酸）或重精氨酸（13C615N4-精氨酸）的合成肽段。相应的标签应为：“Label:13C(6)15N(2) (C-term K)” 和 “Label:13C(6)15N(4) (C-term R)”。
    3. 选择 设置|过渡离子。在 筛选 选项卡中包含 前体电荷 2、3、4。
    4. 通过选择 编辑|插入|肽段 来插入肽段。
    5. 填写相关字段，包括拓扑特征肽序列和蛋白质名称（例如，"Chain–K63"）。
    6. 展开 目标 面板中显示的每个肽段，删除不需要的电荷态。每种拓扑特征肽的首选电荷态和碰撞能量可能因所用质谱仪不同而异，具体见 表 1。
    7. 对于每个拓扑特征肽（M1 除外，其 GG 已包含在序列中），右键点击序列并选择 修饰。通过点击名称字段并选择 <显示全部…>，然后选择 "GlyGly (K)"，将 GG 作为结构修饰添加。
    8. 导出隔离列表：文件|导出|隔离列表，选择仪器类型，并将方法类型设为 标准。点击 确定 将弹出保存对话框，生成一个可用于创建 PRM 方法的 *.csv 文件。
  2. 基于使用开源 Skyline 软件进行的重肽调度运行结果，创建一个定时包含列表。
    1. 按照第 4.1 节所述创建目标列表。
    2. 通过选择 文件|导入|结果 导入第 3.1 步中的调度运行数据。
    3. 检查鉴定结果。通过点击每条重肽条目的质荷比，可观察到每条肽段的重链信号。峰的正确识别通常由软件自动完成，但有时需要在横轴下方通过点击并拖动的方式手动校正峰的选择。
    4. 为重链变体选择的保留时间同样应用于轻链版本，从而为 PRM 创建时间调度。可通过 设置|肽段设置 中的 预测 选项卡修改调度窗口，调整 时间窗口 参数。
    5. 现在可通过 文件|导出|隔离列表 导出定时包含列表，并选择适当的仪器类型，将方法类型设为 定时。
  3. 分析数据。
    1. 以与第 4.2 节中调度运行分析相同的方式导入样品。
    2. 在完成所有样品的完整导入后，建议对过渡离子进行人工校正。此过程用于去除存在干扰或信噪比较差的过渡离子。校正前后的色谱图示例见 图 4。
    3. 现在可以通过右键点击相关图表并选择 复制数据，或通过选择 文件|导出|结果 来导出数据。

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结果

为了展示通过PRM进行泛素链分析的应用，选择了三种细胞系：小鼠黑色素瘤细胞系B16，以及两种常用的人源细胞系A549（腺癌肺泡基底上皮细胞）和HeLa（宫颈癌细胞）。这些细胞在各自适宜的培养基中生长至对数中期，随后在收获前分别用0、10或100 mM MG-132处理4小时。MG-132是一种蛋白酶体抑制剂，可阻止蛋白酶体降解泛素偶联的蛋白质14。因此，该处理条件适用于演示泛素链分析。K48链的相应增加可见于图3。蛋白酶体抑制剂处理导致K48链水平上升15。

如引言所述，与SRM或MRM不同，PRM在选择前体离子后会进行完整的产物离子扫描。这意味着在运行前无需预先指定产物离子，但仍需在运行后对产物离子进行筛选。筛选是指选择最能代表目标肽段的真实转换离子的过程。图4展示了K48在筛选前后产物离子的色谱图。那些由于干扰导致洗脱曲线不一致的产物离子信号已被剔除。随后，低强度的...

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讨论

对蛋白质组中泛素化状态的分析在越来越多的生物学问题中具有重要意义。对样品泛素化状态的描述，不仅需要关注被泛素化修饰的蛋白质谱，还需关注这些泛素化修饰的拓扑结构。如本文所述，通过靶向质谱法对这种拓扑结构进行评估，在广泛的生物学研究中具有重要作用。

应当理解，此处所述方案提供的是泛素链的全局拓扑谱型。采用自下而上的蛋白质组学方法可鉴定发生泛素化的肽段，包括泛素自身肽段。通过检测泛素肽段的泛素化修饰，可推断泛素链的连接拓扑结构，但此时泛素链与原始靶蛋白之间的连接信息已丢失。因此，无法确定特定蛋白质上具体的泛素链拓扑结构，而仅能获得整体的拓扑谱型。该方法还可结合富集策略以获得更具针对性的结果。此类富集策略必须考虑泛素链的稳定性及其在富集后的丰度。链拓扑结构的检测受限于富集策略所提供的纯度，因为无法区分与污染蛋白相连的泛素拓扑结构和与目标蛋白相连的泛素拓扑结构。本方案中的关键步骤在于，在消化泛素蛋白的同时保持泛素链的完整性，这是实现成功分析的前提。这一过程具有挑战性，原因在于泛素链易于降解，而泛素蛋白本身又对酶解具有较强抗性。此外，由于某些具有拓扑特征的肽段在液相色谱-质谱联用分析中的表现不...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢Céline Jeanty在制备经MG-132处理的细胞沉淀（如代表性结果中所述）过程中提供的帮助，以及Elise Mommaerts为本方案提供的大肠杆菌（E. coli）沉淀。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈（ACN）Merck100029
碳酸氢铵（ABC）Fluka9830
离心机Beckman CoulterMicrofuge 16
氯乙酰胺（CAA）Sigma22790
Eppendorf LoBindEppendorf22431081
甲酸（FA）Thermo Fisher Scientific85178
重链肽（Heavy Peptides）JPT Peptide Technologies
高效液相色谱仪（HPLC）DionexUlitimate 3000
液相色谱柱（LC Column）Thermo Fisher Scientific160321
Lys CWako125-05061
质谱仪Thermo Fisher ScientificQ-Exactive Plus
N-乙基马来酰亚胺（NEM）ACROS Organics156100050
阳性对照链 K48Boston BiochemUC-240
阳性对照链 K63Boston BiochemUC-340-100
阳性对照链 M1Boston BiochemUC-710B-025
氢氧化钠（NaOH）SigmaS5881
超声破碎仪Branson sonifierSFX 150
温控混匀仪EppendorfThermomixer Comfort
三氟乙酸（TFA）SigamT6508
三(2-羧乙基)膦（TCEP）Thermo Fisher Scientific77720
胰蛋白酶PromegaV1511A
尿素Sigma51456
Waters μElution C18 板Waters186002318

参考文献

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