骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析

摘要

本文描述了采用甲基化特异性探针扩增法分析经骨肉瘤来源的细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1元件甲基化水平的方法。同时展示了常用于从胎牛血清中分离细胞外囊泡的超速离心法。

摘要

甲基化特异性探针扩增（MSPA）是一种简单且稳健的技术，可用于检测DNA样本中甲基化水平的相对差异。该方法资源利用率高，所需DNA量少，实验操作时间约为4–5小时。在本技术中，首先将DNA样本变性，然后与探针杂交，这些探针分别靶向甲基化位点或作为对照的参考位点。杂交后的DNA被分配到平行反应中：一组仅进行连接反应，另一组在连接后进一步接受HhaI介导的消化，以切割未甲基化的GCGC序列。所得DNA片段通过PCR扩增，并经毛细管电泳分离。甲基化的GCGC位点不会被HhaI切割，因而产生峰信号；而未甲基化的GCGC位点则被切割，不产生峰信号。通过比较各样本消化与未消化版本经对照归一化后的峰信号，可获得DNA样本的甲基化剂量比。本文中，MSPA用于检测骨肉瘤来源的细胞外囊泡（EVs）对间充质干细胞中长散布核元件-1（LINE-1）甲基化状态的影响。LINE-1是重复DNA元件，在癌症中通常发生低甲基化，因此可能作为生物标志物。此外，超速离心也被用作一种经济有效的方法，从生物液体中分离细胞外囊泡（例如，在制备无EV胎牛血清[FBS]以及从骨肉瘤条件培养基中分离EV时采用差速离心法）。在甲基化分析中，设计了定制的LINE-1探针，靶向LINE-1启动子序列中的三个甲基化位点和七个对照位点。本方案展示了MSPA在LINE-1甲基化分析中的应用，并描述了通过超速离心制备无EV FBS的方法。

引言

DNA甲基化是人类细胞中主要的表观遗传修饰之一。DNA甲基化是指甲基基团与CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基共价结合。这类二核苷酸通常成簇存在于基因的5'区，称为CpG岛¹。在正常细胞中，大多数此类二核苷酸处于非甲基化状态，从而允许DNA转录。然而，许多癌症与CpG岛的高甲基化及转录沉默相关²，尤其是在抑癌基因中，这反过来促进了癌症的多种特征性表现³。

另一方面，长散布核元件-1（LINE-1s 或 L1s）是一类重复的可移动DNA元件，通常在CpG岛区域具有高水平的甲基化。LINE-1的甲基化可防止其转位，有助于维持基因组的完整性。在多种癌症中，LINE-1出现低甲基化，导致其被激活，并引发逆转座介导的染色体不稳定性⁴。LINE-1约占人类基因组的17%⁵，其甲基化状态可作为全基因组甲基化水平的潜在指标⁶。全基因组LINE-1低甲基化被认为发生在细胞向肿瘤表型转变之前⁷，因此有望作为癌症早期发生的潜在标志物。

目前，甲基化分析的方法有多种，包括焦磷酸测序、甲基化特异性 PCR、微阵列以及染色质免疫沉淀¹。下一代测序技术的应用也使得全基因组范围的 DNA 甲基化检测成为可能。这些方法大多依赖于亚硫酸氢盐处理的 DNA，其中未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。然而，使用亚硫酸氢盐处理的 DNA 存在若干问题，例如未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的转化不完全、序列扩增存在偏好性以及测序错误等⁸。

在甲基化特异性探针扩增（MSPA）中，由两条寡核苷酸组成的探针靶向含有甲基化敏感限制性内切酶HhaI识别位点（GCGC）的DNA序列⁹。探针与DNA杂交后，每个样本被分为两组。第一组探针直接进行连接反应，第二组探针则在连接后于未甲基化的CGCG位点接受HhaI介导的消化。随后，对两组样本均进行PCR扩增，并通过毛细管电泳分离扩增产物。位于未甲基化位点的探针会被HhaI消化，因此在PCR过程中无法扩增，不产生峰信号；相比之下，位于甲基化位点的探针可免于消化，因而能在PCR中被扩增，从而产生峰信号¹⁰。

MSPA 相较于其他方法具有多项优势。首先，它所需的 DNA 量较少（50–100 ng），非常适合用于分析甲醛固定石蜡包埋样本中的 DNA¹⁰。该方法不需要经亚硫酸氢盐处理的 DNA；事实上，经过此种修饰的 DNA 并不适用于该技术。MSPA 可同时分析多个样本，并且可以设计探针以同时靶向多个基因或序列。此外，由于 HhaI 限制性酶切位点对应于典型的 CpG 岛序列，这些探针对甲基化 DNA 具有高度特异性和灵敏性¹⁰。

本研究探讨了骨肉瘤（OS）来源的细胞外囊泡（EVs）对脂肪组织来源的间充质干细胞（AT-MSCs；图1）中LINE-1甲基化的影响。EVs是由大多数细胞类型分泌的纳米级膜结合囊泡，携带来自亲代细胞的蛋白质、脂质、mRNA、微小RNA及其他分子^11,12。EVs介导细胞间通讯，在多种病理生理过程中发挥重要作用^13,14。最近一项研究表明，肿瘤来源的EVs可能将具有活性的LINE-1转移至受体细胞¹⁵。已有报道指出，HOS-143B细胞系来源的EVs除其他遗传效应外，还可改变MSCs中LINE-1的甲基化状态¹⁶。

在培养用于分离细胞外囊泡（EV）的细胞时，培养基中应使用无细胞外囊泡的胎牛血清 [FBS]，因为FBS来源的EV可能干扰来自其他来源的EV，从而影响实验结果^17,18。超速离心法是去除FBS中EV的常用方法之一，与超滤法或商用无EV胎牛血清等替代方法相比，该方法相对简单且成本较低¹⁹。本文方案同时展示了如何通过超速离心法制备无EV的FBS。

本文介绍了一套详细的操作流程，涵盖了从骨肉瘤细胞系中分离细胞外囊泡（EVs），到对经骨肉瘤来源EV处理的间充质干细胞（MSCs）进行LINE-1甲基化分析的全过程（图1）。

方案

本研究已获得赫尔辛基和新地区医院区伦理委员会的批准（伦理批准编号：D. No. 217/13/03/02/2015）。

1. 通过超速离心法制备无细胞外囊泡的胎牛血清

1. 将FBS加入（超）离心管中，并放入超速离心机的转子桶内。为确保超速离心过程平稳安全，各转子桶之间的重量差应控制在10 mg以内。
2. 将转子桶装载到摆动转子（SW28型，k值为246）上，将转子放入超速离心机中，在4 °C条件下以100,000 × g 离心19小时。
3. 小心吸取上清液中颜色较浅的上层液体（约十分之九），转移至50 mL离心管中。切勿扰动或吸取深棕色沉淀物，因其含有来自FBS的细胞外囊泡（EVs）。
4. 将上清液通过0.22 µm滤膜过滤至新的50 mL离心管中。
5. 在用于分离细胞外囊泡（EV）的细胞培养过程中，将经过滤除菌且去除EV的FBS添加至细胞培养基中。

2. 骨肉瘤来源的EVs的分离

1. 将骨肉瘤细胞（HOS-143B细胞系）接种于T-175培养瓶中，使用含10%正常胎牛血清（FBS）和1%抗生素（100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素）的RPMI 1640培养基，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。
2. 当细胞融合度达到70%–80%时，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后将细胞培养于含10%无细胞外囊泡FBS（以下简称无EV培养基）的培养基中。
   注：在T175培养瓶中接种1 × 10⁶个HOS-143B细胞，约60小时后可达到70%融合度。
3. 在接下来的48小时内，每24小时收集一次骨肉瘤细胞的条件培养基，并更换新鲜的无EV培养基。
4. 将条件培养基在4 °C下以2500 × g离心20分钟，以去除细胞和细胞碎片。将上清液转移至新管中，底部保留约2 mL培养基。
   注：若不立即进行EV分离，上清液可于-80 ᵒC保存。
5. 将上清液倒入超速离心管中，并按前述方法平衡。在4 °C下以100,000 × g离心2小时。
6. 小心弃去上清液，底部保留约1 mL液体。向管中加入约20 mL PBS（0.1 µm滤膜过滤），轻柔吹打以洗涤并重悬EV沉淀。
7. 平衡离心管后，使用相同条件进行第二次超速离心。
8. 小心移除上清液，通过轻柔吹打将EV沉淀重悬于200 µL PBS中。将EV储存于低吸附性离心管中。
   注：EV可立即使用，或储存于-80 °C直至需要时使用。

3. OS-EVs 的表征

注意：纯化的细胞外囊泡（EVs）可通过蛋白质印迹（WB）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）进行表征¹⁶。

1. 按照标准方案进行WB检测，使用EV标志物CD63、TSG101和Hsp70，以及calnexin作为阴性对照，以评估EV样本的纯度¹⁶²⁰。
2. 进行NTA检测时，首先将EV样本用0.1 µm滤膜过滤的Dulbecco's PBS稀释，使每帧图像中（理想情况下）包含30–100个颗粒。
   1. 取约500 µL样本加入1 mL注射器中，并注入NTA仪器的进样口。检查每帧图像中的颗粒数量是否充足，以确保测量准确。
   2. 打开NTA软件，在室温下采集5段时长为60秒的视频，相机强度设为13。分析时，检测阈值设为5，增益设为10。
3. 按照先前描述的方法通过TEM分析EV样本²¹。

4. AT-MSC 培养

注意：用于间充质干细胞分离的人类脂肪组织由整形外科（芬兰 Laser Tilkka 有限公司）提供，为抽脂术吸出物。所有提供抽脂物的捐赠者均接受了择期抽脂手术，并已签署书面知情同意书。

1. 采用标准的机械法和酶解法从吸脂术抽吸物中分离脂肪组织来源的间充质干细胞（AT-MSCs）²²。
   注：也可使用其他来源的间充质干细胞（包括商业细胞系）。
2. 将细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的DMEM/F-12培养基中。

5. 用OS-EVs处理MSCs

1. 在24孔板中每孔接种15,000个AT-MSCs。
2. 24小时后，弃去旧培养基，用PBS洗涤细胞，并更换为无EV的培养基。
3. 在第1天（细胞贴壁后24小时）、第3天（第1天后48小时）和第5天（第1天后96小时）用OS-EVs处理细胞（EV颗粒浓度为每细胞1 × 10⁶个颗粒）。
   1. 对于时间点（TP）0的样本，在第1天停止OS-EV处理；对于TP 3的样本，在第3天停止处理；对于TP 7的样本，在第7天（第5天后48小时）停止处理。
      注：也可根据实验设计采用其他时间点方案。
4. 采用适当方法从MSCs中提取DNA，并在数据分析时包括阳性和阴性对照样本。

6. LINE-1 甲基化检测

1. 设计定制的LINE-1探针引物，方法如Pavicic等先前所述²³。对于甲基化探针，从LINE-1启动子区域中选择包含HhaI限制性酶切位点的三个序列；对于对照探针，从LINE-1序列其余部分中选择七个不含HhaI限制性酶切位点的序列。
   注：LINE-1序列可在GenBank数据库中获取²⁴（L1.2，登录号AH005269.2）。请参照MSPA试剂盒制造商提供的说明进行探针设计²⁵。
2. 将70 ng DNA样本用TE缓冲液稀释至5 µL体积。
3. 按照表1所述条件进行后续热循环和PCR步骤。将样本在98 °C加热10分钟，然后冷却至25 °C。
4. 向每个样本中加入3 µL探针杂交混合液，并运行热循环仪，使探针与DNA杂交。
5. 在室温（RT）下，向每个样本中加入13 µL杂交后混合液，然后将10 µL转移至第二个管中。
6. 将两组样本管放入热循环仪中，在48 °C孵育至少1分钟。
   1. 当样本处于48 °C时，向第一组管（未消化系列）中加入10 µL连接混合液，向第二组管（消化系列）中加入10 µL连接-消化混合液。运行下一热循环程序。
7. 短暂离心收集液体，并同时将热循环仪设定为72 °C。
8. 向每管中加入5 µL聚合酶混合液，将各管放入热循环仪中，运行PCR程序。
9. 在PCR程序运行期间，准备含有2.5 µL片段大小标准品的1 mL甲酰胺溶液。用移液器将10 µL该溶液加入带条形码的光学96孔板的每个孔中。
10. PCR结束后，将未消化和已消化的样本分别用超纯水稀释至1:100和1:200。取2 µL稀释后的PCR产物加入96孔板中。以200 x g离心15–20秒，以去除气泡。
11. 通过毛细管电泳对样本进行片段分析。
    注：分析前，应将96孔板避光保存于4 °C。

7. 片段数据分析

1. 在毛细管电泳分析软件中打开电泳图谱结果。
   1. 在Panel列中，为其中一个样本从菜单中选择MLPA。点击Panel标题并按Ctrl+D，将MLPA应用到所有样本。
   2. 以相同方式，将所有样本的Analysis method设置为Microsatellite default。
   3. 选择所有样本，然后点击Green play按钮，根据所选设置分析样本。
   4. 选择所有样本，然后点击Graph按钮，以可视化探针峰。
   5. 放大峰区域，以获得更高分辨率的单个探针峰。确保与LINE-1探针混合物对应的全部10个峰均已标注。舍弃额外的峰（<95 bp 和 >160 bp）。
   6. 在Genotypes标签页中，将结果导出为逗号分隔值（CSV）格式。
2. 在数据分析软件中打开CSV文件，并将数据整理为列。
   1. 根据三个甲基化位点峰的大致大小对它们进行标注（L1-1m位于153 bp，L1-2m位于119 bp，L1-3m位于133 bp）。其余七个峰对应于对照探针。
      注：此处使用L1-2m探针峰的数值，其大小为117 bp，因为该区域在大多数LINE-1甲基化检测中已被广泛使用²³。
   2. 对于每个样本（未消化和已消化），计算全部七个对照探针的总峰面积。将每个LINE-1探针的峰面积除以该总和。
   3. 对于每个DNA样本，将已消化样本的数值除以未消化样本的数值，以计算甲基化剂量比（D_M），公式如下：
      
      其中：D_M为甲基化剂量比，A_x为峰x（例如L1-2m峰）下的面积，A_ctrl为全部七个对照探针的总峰面积。

结果

The main goal of this study was to evaluate the epigenetic effects of OS-EVs on MSCs. OS-EVs were isolated from HOS-143B cells using the standard differential centrifugation method. Expression of the typical EV markers CD63, Hsp70, and TSG101 by western blotting confirmed the presence of OS-EVs. (Figure 2A). Absence of calnexin signal indicated purity of the OS-EV isolate. Additional indication of purity was observed with TEM, with intact vesicles of various sizes being pres...

讨论

本研究展示了如何利用MSPA检测和定量特定遗传元件的甲基化状态。本文以LINE-1为研究对象，但探针可设计用于靶向多种基因和序列。此外，目前已有越来越多适用于不同应用的探针混合物可供选择。MSPA是一种简单且稳健的DNA甲基化分析技术，无需进行亚硫酸氢盐转化¹⁰。从样本制备到数据分析的完整流程约需2天，实际操作时间仅需4–5小时。该方法适用于微量DNA（低至70 ng），本文已对此进行了验证。

甲基化分析实验方案中最重要的部分是定制探针混合物的制备，例如本研究中的 LINE-1 探针混合物。由于长度不同，LINE-1 探针的寡核苷酸合成浓度范围为 4–40 nM，因此必须严格按照生产商的说明小心进行溶解步骤及后续稀释²⁵。本研究所采用的 PCR 及多个热循环程序，与原始生产商提供的版本有所不同。

关于 HhaI 酶，有几点注意事项。首先，连接-消化反应体系中所用酶的体积取决于生产厂家，且对热失活具有抗性的酶版本不适...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	Terumo	SS+01T1	用于 NTA
24 孔板	康宁	3524	MSC 细胞培养
3730xl DNA 分析仪	Applied Biosystems、ThermoFisher Scientific	3730XL
50 mL 离心管	康宁	430829
Beckman Optima LE-80K 超速离心机	Beckman
BlueStar 预染蛋白标记	Nippon Genetics	MWP03	WB：蛋白标记
物 Calnexin（克隆 C5C9）	Cell Signaling Technology	2679	WB，稀释度 1：800
CD63（克隆 H5C6）	BD Biosciences	556019	WB，稀释度 1：1000
离心机 5702 R	Eppendorf	5703000010	用于条件培养基和细胞
离心机 5810	Eppendorf	5810000010	用于离心 96 孔板
离心管（多聚异体，14 x 95 mm）	Beckman	331374	超速离心
DMEM/F-12 + GlutaMAX 培养基	Gibco，Life Technologies	31331-028	用于 AT-MSC 培养
胎牛血清	Gibco，Life Technologies	10270-106
GeneScan 500 LIZ 分子量标准	应用Biosystems， Life Technologies	4322682	用于毛细管电泳
GenomePlex 完整全基因组扩增 （WGA） 试剂盒	Sigma	WGA2-10RXN	用于 MSPA 阴性对照
Hi-Di 甲酰胺	Applied Biosystems， Life Technologies	4311320	用于毛细管电泳
HOS-143B 细胞系 ATCC		CRL-8303
Hsp70（克隆 5G10）	BD Biosciences 554243		WB，稀释度 1：1000
IRDye 800CW 山羊抗小鼠	Li-Cor	926-32210	WB：二级
IRDye 800CW 山羊抗兔	Li-Cor	926-32211	WB：二级
LINE-1 探针混合物引物	表 1 中的	IDT
MicroAmp 光学 96 孔反应板，带条形码	Applied Biosystems，Life Technologies	4306737	还需要密封膜
Micro BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23235	测量蛋白浓度
MiniProtean TGX 10% 凝胶	Bio-Rad	456-1034	WB：凝胶电泳
NanoSight LM14C	用于	NTA
;m	Bio-Rad	1620112	WB：蛋白质转移
NucleoSpin 组织 XS	Macherey-Nagel	740901.50	用于 DNA 提取
Odyssey 封闭缓冲液	Li-Cor	927-40000	WB：封闭、抗体
PBS、1X	康宁	21-040-CVR
青霉素-链霉素	Gibco、Life Technologies	DE17-602E	抗生素培养基
蛋白 LoBind 管，0.5 mL	Eppendorf	22431064	用于储存
EVS REVERT 总蛋白染色和洗涤液试剂盒	Li-Cor	926-11015	WB：总蛋白染色
RKO 细胞系	ATCC	CRL-2577	，用于 MSPA 阳性对照
RPMI 培养基 1640 + GlutaMAX	Gibco，Life Technologies	61870-010	用于 HOS-143B 细胞培养
SALSA MLPA HhaI 酶	MRC-Holland	SMR50
SALSA MLPA 试剂盒	MRC-Holland	EK1-FAM
SALSA MLPA P300 探针混合物	MRC-Holland	P300-100R
摆动转子 SW-28	贝克曼库尔特	342207	超速
离心注射器过滤器，0.22 µm	Jet Biofil	FPE-204-030	过滤FBS
Tecnai 12	FEI公司		配备Gatan Orius SC 1000B CCD相机 （Gatan Inc.，美国）;用于TEM
TBS，1X片	剂Medicago	09-7500-100	WB：缓冲液
Trans-Blot Turbo	Bio-Rad		WB：转移
热循环仪	ThermoFisher Scientific
TrypLE Express	Gibco	12604-021
TSG101（克隆 4A10）	Sigma	SAB2702167	稀释度为 1：500