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方法文章

骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析

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DOI：

10.3791/60705

⸱

2020年2月1日

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了采用甲基化特异性探针扩增法分析经骨肉瘤来源的细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1元件甲基化水平的方法。同时展示了常用于从胎牛血清中分离细胞外囊泡的超速离心法。

摘要

甲基化特异性探针扩增（MSPA）是一种简单且稳健的技术，可用于检测DNA样本中甲基化水平的相对差异。该方法资源利用率高，所需DNA量少，实验操作时间约为4–5小时。在本技术中，首先将DNA样本变性，然后与探针杂交，这些探针分别靶向甲基化位点或作为对照的参考位点。杂交后的DNA被分配到平行反应中：一组仅进行连接反应，另一组在连接后进一步接受HhaI介导的消化，以切割未甲基化的GCGC序列。所得DNA片段通过PCR扩增，并经毛细管电泳分离。甲基化的GCGC位点不会被HhaI切割，因而产生峰信号；而未甲基化的GCGC位点则被切割，不产生峰信号。通过比较各样本消化与未消化版本经对照归一化后的峰信号，可获得DNA样本的甲基化剂量比。本文中，MSPA用于检测骨肉瘤来源的细胞外囊泡（EVs）对间充质干细胞中长散布核元件-1（LINE-1）甲基化状态的影响。LINE-1是重复DNA元件，在癌症中通常发生低甲基化，因此可能作为生物标志物。此外，超速离心也被用作一种经济有效的方法，从生物液体中分离细胞外囊泡（例如，在制备无EV胎牛血清[FBS]以及从骨肉瘤条件培养基中分离EV时采用差速离心法）。在甲基化分析中，设计了定制的LINE-1探针，靶向LINE-1启动子序列中的三个甲基化位点和七个对照位点。本方案展示了MSPA在LINE-1甲基化分析中的应用，并描述了通过超速离心制备无EV FBS的方法。

引言

DNA甲基化是人类细胞中主要的表观遗传修饰之一。DNA甲基化是指甲基基团与CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基共价结合。这类二核苷酸通常成簇存在于基因的5'区，称为CpG岛1。在正常细胞中，大多数此类二核苷酸处于非甲基化状态，从而允许DNA转录。然而，许多癌症与CpG岛的高甲基化及转录沉默相关2，尤其是在抑癌基因中，这反过来促进了癌症的多种特征性表现3。

另一方面，长散布核元件-1（LINE-1s 或 L1s）是一类重复的可移动DNA元件，通常在CpG岛区域具有高水平的甲基化。LINE-1的甲基化可防止其转位，有助于维持基因组的完整性。在多种癌症中，LINE-1出现低甲基化，导致其被激活，并引发逆转座介导的染色体不稳定性4。LINE-1约占人类基因组的17%5，其甲基化状态可作为全基因组甲基化水平的潜在指标6。全基因组LINE-1低甲基化被认为发生在细胞向肿瘤表型转变之前7，因此有望作为癌症早期发生的潜在标志物。

目前，甲基化分析的方法有多种，包括焦磷酸测序、甲基化特异性 PCR、微阵列以及染色质免疫沉淀1。下一代测序技术的应用也使得全基因组范围的 DNA 甲基化检测成为可能。这些方法大多依赖于亚硫酸氢盐处理的 DNA，其中未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。然而，使用亚硫酸氢盐处理的 DNA 存在若干问题，例如未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的转化不完全、序列扩增存在偏好性以及测序错误等8。

在甲基化特异性探针扩增（MSPA）中，由两条寡核苷酸组成的探针靶向含有甲基化敏感限制性内切酶HhaI识别位点（GCGC）的DNA序列9。探针与DNA杂交后，每个样本被分为两组。第一组探针直接进行连接反应，第二组探针则在连接后于未甲基化的CGCG位点接受HhaI介导的消化。随后，对两组样本均进行PCR扩增，并通过毛细管电泳分离扩增产物。位于未甲基化位点的探针会被HhaI消化，因此在PCR过程中无法扩增，不产生峰信号；相比之下，位于甲基化位点的探针可免于消化，因而能在PCR中被扩增，从而产生峰信号10。

MSPA 相较于其他方法具有多项优势。首先，它所需的 DNA 量较少（50–100 ng），非常适合用于分析甲醛固定石蜡包埋样本中的 DNA10。该方法不需要经亚硫酸氢盐处理的 DNA；事实上，经过此种修饰的 DNA 并不适用于该技术。MSPA 可同时分析多个样本，并且可以设计探针以同时靶向多个基因或序列。此外，由于 HhaI 限制性酶切位点对应于典型的 CpG 岛序列，这些探针对甲基化 DNA 具有高度特异性和灵敏性10。

本研究探讨了骨肉瘤（OS）来源的细胞外囊泡（EVs）对脂肪组织来源的间充质干细胞（AT-MSCs；图1）中LINE-1甲基化的影响。EVs是由大多数细胞类型分泌的纳米级膜结合囊泡，携带来自亲代细胞的蛋白质、脂质、mRNA、微小RNA及其他分子11,12。EVs介导细胞间通讯，在多种病理生理过程中发挥重要作用13,14。最近一项研究表明，肿瘤来源的EVs可能将具有活性的LINE-1转移至受体细胞15。已有报道指出，HOS-143B细胞系来源的EVs除其他遗传效应外，还可改变MSCs中LINE-1的甲基化状态16。

在培养用于分离细胞外囊泡（EV）的细胞时，培养基中应使用无细胞外囊泡的胎牛血清 [FBS]，因为FBS来源的EV可能干扰来自其他来源的EV，从而影响实验结果17,18。超速离心法是去除FBS中EV的常用方法之一，与超滤法或商用无EV胎牛血清等替代方法相比，该方法相对简单且成本较低19。本文方案同时展示了如何通过超速离心法制备无EV的FBS。

本文介绍了一套详细的操作流程，涵盖了从骨肉瘤细胞系中分离细胞外囊泡（EVs），到对经骨肉瘤来源EV处理的间充质干细胞（MSCs）进行LINE-1甲基化分析的全过程（图1）。

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方案

本研究经赫尔辛基和新地区医院区伦理委员会批准（伦理批准号 D. No. 217/13/03/02/2015）。

1. 通过超速离心法去除胎牛血清中的细胞外囊泡

  1. 将FBS加入（超速）离心管中，并放入超速离心机的离心桶内。为确保超速离心过程平稳安全地进行，各离心桶之间的质量需相互平衡，差异不得超过10 mg。
  2. 将离心桶装入摆动转子（型号SW28，k值为246）中。将转子放入超速离心机，于4 °C下以100,000 × g 离心19小时。
  3. 小心吸取上清液中颜色较浅的上层液体（约十分之九），转移至一个新的50 mL离心管中。切勿扰动或吸取底部深棕色沉淀物，因其含有来自FBS的细胞外囊泡（EVs）。
  4. 将上清液通过0.22 µm滤膜过滤至新的50 mL离心管中。
  5. 在进行细胞外囊泡（EV）分离的细胞培养时，将经过滤除菌且去除EV的FBS加入细胞培养基中。

2. 骨肉瘤来源的细胞外囊泡的分离

  1. 将骨肉瘤细胞（HOS-143B细胞系）以RPMI 1640培养基接种于T-175培养瓶中，培养基中添加10%正常胎牛血清（FBS）和1%抗生素（100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素）。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  2. 当培养瓶中细胞融合度达到70%–80%时，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后将细胞培养于含10%外泌体耗竭型胎牛血清（以下简称外泌体耗竭型培养基）的培养基中。
    注：在T175培养瓶中接种1 × 106个HOS-143B细胞，约60小时后可达到70%融合度。
  3. 在接下来的48小时内，每隔24小时收集一次骨肉瘤细胞的条件培养基，并补充新鲜的外泌体耗竭型培养基。
  4. 将收集的条件培养基于4 °C以2500 × g离心20分钟，以去除细胞及细胞碎片。将上清液转移至新离心管中，底部保留约2 mL培养基。
    注：若不立即进行外泌体分离，可将上清液于-80 °C保存。
  5. 将上清液倒入超速离心管中，并按前述方法平衡。于4 °C以100,000 × g超速离心2小时。
  6. 小心弃去上清液，底部保留约1 mL液体。向管中加入约20 mL PBS（0.1 µm滤膜过滤），轻柔吹打以洗涤并重悬外泌体沉淀。
  7. 平衡离心管后，使用相同条件进行第二轮超速离心。
  8. 小心移除上清液，通过轻柔吹打将外泌体沉淀重悬于200 µL PBS中。将外泌体储存于低吸附离心管中。
    注：外泌体可立即使用，或于-80 °C保存至需要时使用。

3. OS-EVs 的表征

注意：纯化的细胞外囊泡（EVs）可通过蛋白质印迹（WB）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）进行表征16。

  1. 按照标准方案进行WB检测，使用EV标志物CD63、TSG101和Hsp70，并以calnexin作为阴性对照，以评估EV样本的纯度1620。
  2. 进行NTA检测时，首先将EV样本用0.1 µm滤膜过滤的Dulbecco's PBS稀释，使每帧图像中（理想情况下）包含30–100个颗粒。
    1. 取约500 µL样本加入1 mL注射器中，并注入NTA仪器的进样口。检查每帧图像中的颗粒数量是否充足，以确保测量的准确性。
    2. 打开NTA软件，在室温下采集5段时长为60 s的视频，相机强度设为13。分析时，检测阈值设为5，增益设为10。
  3. 按照先前描述的方法通过TEM分析EV样本21。

4. AT-MSC 培养

注意：用于间充质干细胞分离的人类脂肪组织由整形外科（芬兰 Laser Tilkka 有限公司）提供，为抽脂术吸出物。所有提供抽脂物的捐赠者均接受了择期抽脂手术，并已签署书面知情同意书。

  1. 采用标准的机械和酶消化分离方法，从抽脂术吸出物中分离AT-MSCs22。
    注：也可使用其他来源的MSCs（包括商业细胞系）。
  2. 将细胞培养于添加10% FBS和1%抗生素的DMEM/F-12培养基中。

5. 用 OS-EVs 处理 MSCs

  1. 在24孔板中每孔接种15,000个AT-MSCs。
  2. 24小时后，弃去旧培养基，用PBS洗涤细胞，并更换为无EV的培养基。
  3. 在第1天（细胞贴壁后24小时）、第3天（第1天后48小时）和第5天（第1天后96小时）用OS-EVs处理细胞（EV颗粒浓度为每细胞1 × 106个EVs）。
    1. 对于时间点（TP）0的样本，在第1天终止OS-EV处理；对于TP 3的样本，在第3天终止处理；对于TP 7的样本，在第7天（第5天后48小时）终止处理。
      注意：也可根据实验计划采用其他时间点方案。
  4. 采用适当方法从MSCs中提取DNA，并在数据分析时包括阳性和阴性对照样本。

6. LINE-1 甲基化检测

  1. 参照 Pavicic 等人先前的方法设计定制的 LINE-1 探针引物23。对于甲基化探针，从 LINE-1 启动子区域中选择包含 HhaI 限制性酶切位点的三个序列；对于对照探针，从 LINE-1 序列其余部分中选择七个不含 HhaI 限制性酶切位点的序列。
    注意：LINE-1 序列可在 GenBank 数据库中获取24（L1.2，登录号 AH005269.2）。请参照 MSPA 试剂盒制造商提供的说明进行探针设计25。
  2. 将 70 ng DNA 样本用 TE 缓冲液稀释至 5 µL 体积。
  3. 按照 表 1 中所述条件进行后续的热循环和 PCR 步骤。先将样本在 98 °C 下加热 10 分钟，然后冷却至 25 °C。
  4. 向每个样本中加入 3 µL 探针杂交混合液，并运行热循环仪，使探针与 DNA 充分杂交。
  5. 在室温（RT）下，向每个样本中加入 13 µL 杂交后混合液，然后将其中 10 µL 转移至另一新管中。
  6. 将两组试管同时放入热循环仪中，在 48 °C 下孵育至少 1 分钟。
    1. 当样本处于 48 °C 时，向第一组试管（未消化系列）中加入 10 µL 连接反应混合液，向第二组试管（消化系列）中加入 10 µL 连接-消化混合液。运行下一热循环程序。
  7. 短暂离心收集管壁液体，同时将热循环仪温度设为 72 °C。
  8. 向每管中加入 5 µL 聚合酶混合液，并将试管放入热循环仪中，运行 PCR 程序。
  9. 在 PCR 程序运行期间，准备含 2.5 µL 片段长度标准品的 1 mL 甲酰胺溶液。用移液器将 10 µL 该溶液加入光学 96 孔板（带条形码）的每一孔中。
  10. PCR 结束后，将未消化和已消化的样本分别用超纯水稀释至 1:100 和 1:200。向 96 孔板中每孔加入 2 µL 稀释后的 PCR 产物。以 200 x g 离心 15–20 秒，以去除气泡。
  11. 通过毛细管电泳对样本进行片段分析。
    注意：分析前，96 孔板应避光保存于 4 °C。

7. 片段数据分析

  1. 在毛细管电泳分析软件中打开电泳图谱结果。
    1. 在Panel列中，为其中一个样本从菜单中选择MLPA。点击Panel标题并按Ctrl+D，将MLPA应用到所有样本。
    2. 以相同方式，将所有样本的Analysis method设置为Microsatellite default。
    3. 选择所有样本，然后点击Green play按钮，根据所选设置分析样本。
    4. 选择所有样本，然后点击Graph按钮，以可视化探针峰。
    5. 放大峰区域，以获得更高分辨率的单个探针峰。确保与LINE-1探针混合物对应的全部10个峰均已标注。舍弃额外的峰（<95 bp 和 >160 bp）。
    6. 在Genotypes标签页中，将结果导出为逗号分隔值（CSV）格式。
  2. 在数据分析软件中打开CSV文件，并将数据整理为列。
    1. 根据三个甲基化位点峰的大致大小进行标注（L1-1m 在 153 bp，L1-2m 在 119 bp，L1-3m 在 133 bp）。其余七个峰对应于对照探针。
      注：此处使用L1-2m探针峰的数值，其大小为117 bp，因为该区域已在大多数LINE-1甲基化检测中被采用23。
    2. 对于每个样本（未消化和已消化），计算全部七个对照探针的总峰面积。将每个LINE-1探针的峰面积除以该总和。
    3. 对于每个DNA样本，将已消化样本的数值除以未消化样本的数值，得到甲基化剂量比（DM），使用以下公式：
      DNA消化分析方程，吸光度比值，用于实验数据比较的公式。
      其中：DM为甲基化剂量比，Ax为峰x下的面积（例如L1-2m峰），Actrl为全部七个对照探针的总峰面积。

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结果

本研究的主要目标是评估骨肉瘤细胞来源的细胞外囊泡（OS-EVs）对间充质干细胞（MSCs）的表观遗传学影响。OS-EVs 采用标准的差速离心法从 HOS-143B 细胞中分离获得。通过 Western 印迹检测典型的细胞外囊泡标志物 CD63、Hsp70 和 TSG101 的表达，证实了 OS-EVs 的存在（图 2A）。未检测到内质网标志蛋白 calnexin 的信号，表明 OS-EVs 制剂具有较高的纯度。透射电子显微镜（TEM）观察进一步验证了其纯度，结果显示存在多种尺寸的完整囊泡结构（图 2B）。OS-EVs 的平均颗粒浓度为 7.63×1011/mL（图 2C）。EVs 的粒径分布范围为 50–500 nm，其中约 80% 的颗粒粒径集中在 50–200 nm 范围内（图 2

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讨论

本研究展示了如何利用MSPA检测和定量特定遗传元件的甲基化状态。本文以LINE-1为研究对象，但探针可设计用于靶向多种基因和序列。此外，目前已有越来越多适用于不同应用的探针混合物可供选择。MSPA是一种简单且稳健的DNA甲基化分析技术，无需进行亚硫酸氢盐转化10。从样本制备到数据分析的完整流程约需2天，实际操作时间仅需4–5小时。该方法适用于微量DNA（低至70 ng），本文已对此进行了验证。

甲基化分析实验方案中最重要的部分是定制探针混合物的制备，例如本研究中的 LINE-1 探针混合物。由于长度不同，LINE-1 探针的寡核苷酸合成浓度范围为 4–40 nM，因此必须严格按照生产商的说明小心进行溶解步骤及后续稀释25。本研究所采用的 PCR 及多个热循环程序，与原始生产商提供的版本有所不同。

关于 HhaI 酶，有几点注意事项。首先，连接-消化反应体系中所用酶的体积取决于生产厂家，且对热失活具有抗性的酶版本不适...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由赫尔辛基大学项目资助（WBS490302，WBS73714112）、赫尔辛基大学医院大学级健康研究国家资助（Y1014SUL05，TYH2016130）、芬兰-挪威医学基金会以及塞尔玛和玛雅-丽莎·塞尔兰德基金（明娜瓦基金会）提供支持。我们感谢Walter Pavicic提供了改进的MSPA方案及相关技术支持。我们感谢Teemu Masalin（赫尔辛基大学）在视频制作方面给予的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器TerumoSS+01T1用于纳米颗粒跟踪分析（NTA）
24 孔板Corning3524间充质干细胞（MSC）培养
3730xl DNA 分析仪Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
50 mL 离心管Corning430829
Beckman Optima LE-80K 超速离心机Beckman
BlueStar 预染蛋白 MarkerNippon GeneticsMWP03WB：蛋白 Marker
Calnexin（克隆 C5C9）Cell Signaling Technology2679WB，稀释比例 1:800
CD63（克隆 H5C6）BD Biosciences556019WB，稀释比例 1:1000
Centrifuge 5702 REppendorf5703000010用于条件培养基和细胞
Centrifuge 5810Eppendorf5810000010用于离心 96 孔板
离心管（聚烯烃材质，14×95 mm）Beckman331374超速离心
DMEM/F-12 + GlutaMAX 培养基Gibco, Life Technologies31331-028用于 AT-MSC 培养
胎牛血清Gibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ 片段大小标准品Applied Biosystems, Life Technologies4322682用于毛细管电泳
GenomePlex 完整基因组扩增（WGA）试剂盒SigmaWGA2-10RXN用于 MSPA 阴性对照
Hi-Di 去离子甲酰胺Applied Biosystems, Life Technologies4311320用于毛细管电泳
HOS-143B 细胞系ATCCCRL-8303
Hsp70（克隆 5G10）BD Biosciences554243WB，稀释比例 1:1000
IRDye 800CW 山羊抗小鼠二抗Li-Cor926-32210WB：二抗
IRDye 800CW 山羊抗兔二抗Li-Cor926-32211WB：二抗
LINE-1 探针混合引物IDT序列见表1
带条形码的 MicroAmp 光学 96 孔反应板Applied Biosystems, Life Technologies4306737还需配备封板膜
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒ThermoFisher Scientific23235测定蛋白浓度
MiniProtean TGX 10% 凝胶Bio-Rad456-1034WB：凝胶电泳
NanoSight LM14CMalvern Instruments用于纳米颗粒跟踪分析（NTA）
硝酸纤维素膜，0.2 µmBio-Rad1620112WB：蛋白转膜
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50用于 DNA 提取
Odyssey 封闭缓冲液Li-Cor927-40000WB：封闭，抗体孵育
PBS，1×Corning21-040-CVR
青霉素-链霉素Gibco, Life TechnologiesDE17-602E培养基用抗生素
蛋白 LoBind 管，0.5 mLEppendorf22431064用于储存细胞外囊泡（Evs）
REVERT 总蛋白染色与洗涤试剂盒Li-Cor926-11015WB：总蛋白染色
RKO 细胞系ATCCCRL-2577用于 MSPA 阳性对照
RPMI 1640 + GlutaMAX 培养基Gibco, Life Technologies61870-010用于 HOS-143B 细胞培养
SALSA MLPA HhaI 酶MRC-HollandSMR50
SALSA MLPA 试剂盒MRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 探针混合液MRC-HollandP300-100R
SW-28 摆动转子Beckman Coulter342207超速离心
注射器滤器，0.22 µmJet BiofilFPE-204-030用于胎牛血清（FBS）无菌过滤
Tecnai 12FEI Company配备 Gatan Orius SC
1000B CCD 相机
（Gatan Inc., USA）；用于透射电子显微镜（TEM）
TBS，1× 片剂Medicago09-7500-100WB：缓冲液
Trans-Blot TurboBio-RadWB：转膜
热循环仪ThermoFisher ScientificTCA0096
TrypLE ExpressGibco12604-021用于细胞消化
TSG101（克隆 4A10）SigmaSAB2702167WB，稀释比例 1:500

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