癌细胞逃避免疫系统中自然杀伤（NK）细胞介导的清除作用，对癌症的发生和进展至关重要。本文介绍了两种基于非放射性的实验方案，用于评估NK细胞对肝肿瘤细胞的细胞毒性作用。此外，还提供了一种第三种方案，用于分析NK细胞的迁移能力。
本文内容
摘要
摘要
自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统中细胞毒性淋巴细胞的一个亚群，通过清除病原体感染、恶性转化及应激状态的细胞，参与机体的第一道防御防线。NK细胞清除癌细胞的能力使其成为抗癌斗争中的重要工具。目前已有多种基于免疫的新疗法正在研究中，这些疗法依赖于增强NK细胞的活性，或提高癌细胞对NK细胞介导清除作用的敏感性。然而，为了有效开发这些治疗策略，还需要成本效益高且可在体外监测NK细胞毒性和迁移能力的实验方法。本文介绍了两种体外实验方案，可稳定、可重复地监测NK细胞对癌细胞（或其他靶细胞）的细胞毒性作用。这些方案不涉及放射性物质，操作简便，并可扩展用于高通量筛选。此外，我们还提供了一种基于流式细胞术的定量检测NK细胞迁移能力的方案，同样适用于高通量筛选。总体而言，这三种方案可用于监测NK细胞活性的关键方面，这些方面对于NK细胞清除功能异常靶细胞的能力至关重要。
引言
人体识别非自身成分并清除外来物质的能力是抵御病原体和恶性肿瘤的关键，对人类生存至关重要1。在此过程中，人体免疫反应发挥着最重要的作用2,3,4。根据关键特征和功能，人体免疫系统大致可分为两大功能类别：适应性免疫系统和先天性免疫系统。适应性免疫系统通常针对特定病原体，具有免疫记忆功能，因此其效应持久，并能在同一病原体再次感染时迅速响应5,6,7,8,9。相比之下，先天性免疫的靶向清除范围更广，特异性相对较低。因此，先天性免疫反应通常作为免疫防御的第一道防线10。自然杀伤（NK）细胞属于先天性免疫系统，占循环淋巴细胞总数的10−15%11。NK细胞通过两种主要机制清除靶细胞：首先，当与表达激活配体的靶细胞结合后，NK细胞通过胞吐作用释放破坏细胞膜的穿孔素（perforin）和丝氨酸蛋白酶颗粒酶（granzymes），共同诱导靶细胞发生凋亡12,13,14,15。此外，表达FasL和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的NK细胞可与表达死亡受体（Fas/CD95）的靶细胞相互作用，引发caspase依赖性的细胞凋亡16。最重要的是，NK细胞无需预先刺激（如抗原呈递）即可清除病原体感染细胞或恶性细胞，因此通常处于随时可杀伤的状态17,18。为了抑制肿瘤的发生和发展并清除癌细胞，NK细胞必须迁移至肿瘤部位，并在进入肿瘤微环境后识别并攻击靶细胞。
过去，NK细胞效应功能主要通过脱颗粒和细胞毒性实验进行监测19,20,21。NK细胞的细胞毒性也可通过51铬释放实验来测定22,23,24,25。然而，该实验具有一些特定要求，包括需要使用γ计数器，且基于放射性物质，因此需要接受放射性材料操作和处置的培训，并对使用者存在一定风险。因此，目前已开发并采用多种新型非放射性实验方法用于研究NK细胞活性。
本文介绍了两种此类实验方案：基于比色法乳酸脱氢酶（LDH）检测的自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒作用检测方法，以及基于钙黄绿素乙酰甲酯（AM）染色的显微镜检测方法，用于评估NK细胞对癌细胞的清除作用。这些检测方法无需使用放射性同位素，操作简便、灵敏度高，且可重复地鉴定调控NK细胞功能的因素。此外，由于在不监测NK细胞迁移变化的情况下无法全面评估其功能，我们还提供了一种基于流式细胞术的定量方法，用于监测NK细胞的迁移能力。
方案
1. 自然杀伤细胞与肝肿瘤细胞培养基的制备
- 使用人自然杀伤细胞（例如 NK92MI）和人肝癌细胞系（例如 SK-HEP-1）。
- 通过向 500 mL 不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的伊格尔最低必需培养基 α（minimum essential medium Eagle alpha）中添加以下组分，配制适用于 NK92MI 人自然杀伤细胞的培养基，使其终浓度如下：0.02 mM 叶酸（100 µL 的 100 mM 叶酸）、0.2 mM 肌醇（500 µL 的 200 mM 肌醇）、0.1 mM β-巯基乙醇（3.5 µL 的 14.3 M β-巯基乙醇）、2 mM L-谷氨酰胺（5 mL 的 200 mM L-谷氨酰胺）、1% 青霉素/链霉素（5 mL 的 100x 青霉素/链霉素）、12.5% 胎牛血清（FBS）和 12.5% 马血清。混匀后使用 0.22 µm 无菌滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。
- 通过向含 2 mM L-谷氨酰胺的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素，配制肝肿瘤细胞系 SK-HEP-1 的培养基。
2. 基于比色法LDH检测的自然杀伤细胞介导的细胞毒性实验
- 在100 mm细胞培养皿中将SK-HEP-1细胞培养至70−80%汇合度，培养条件为5% CO₂2 在 37 °C 在 CO2 培养箱。通过以下步骤制备单细胞悬液：先用 5 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后在 5% CO₂ 条件下加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育。2 在 37 °C 在 CO2 孵育至形成单细胞悬液。
注意：由于癌细胞中NK细胞活化配体的表达发生变化，应激状态下的癌细胞可诱导NK细胞活性。因此，为获得准确结果，应使用健康且未达到汇合状态的癌细胞。还需注意，NK细胞受体及其配体可能对胰蛋白酶消化敏感。26,27因此，胰蛋白酶消化方案应仔细优化，并应避免过度消化。 - 消化后，加入10 mL SK-HEP-1培养基，于160 x g离心 g 在15 mL无菌圆锥形离心管中离心3分钟。用5 mL 1×PBS洗涤细胞沉淀，并重悬于5 mL培养基中。
- 同时，将NK92MI细胞在160 x g下离心 g 在15 mL无菌离心管中离心3分钟。用5 mL 1×PBS洗涤细胞沉淀，重悬于5 mL NK92MI细胞培养基中。
注意：NK92MI 细胞在 NK 细胞培养基中培养，其获取方法与步骤 2.1 中所述类似。 - 使用血细胞计数板或任何可用的自动细胞计数仪对 SK-HEP-1 和 NK92MI 细胞进行计数。
- 加入SK-HEP-1细胞（靶细胞）（1 × 104/100 µL/well）和NK92MI细胞（效应细胞）（1 × 105/100 µL/well以1:10的靶细胞:效应细胞比例，将细胞接种至96孔板中，每组设三个复孔。
- 将96孔板置于培养箱中孵育 37 °C 在95%空气和5% CO₂的环境中2 孵育3小时后，以450 × g离心培养板 g 室温下孵育5分钟。
- 在不扰动细胞沉淀的前提下，收集 100 µL 吸取各孔上清液并转移至新的96孔板中的对应孔中。
- 添加 50 µL 加入LDH底物，充分混匀，于室温避光孵育20分钟。
- 通过添加终止反应 50 µL 加入终止液（pH 4.7 的 50% 二甲基甲酰胺和 20% 十二烷基硫酸钠）。立即使用酶标仪在 490 nm 和 680 nm 处测定平板的吸光度。
- 用490 nm处的吸光度减去680 nm处的吸光度。使用以下公式计算自然杀伤（NK）细胞毒性的百分比（%）。
其中，LDH实验组（效应细胞+靶细胞）为NK92MI细胞与SK-HEP-1细胞共同培养的吸光度，LDH效应细胞组为单独NK92MI细胞的吸光度，LDH自发释放组为单独SK-HEP-1细胞的吸光度，LDH最大释放组为加入裂解缓冲液的SK-HEP-1细胞的吸光度。
注意：为减少血清干扰，务必设置以下对照：仅靶细胞（SK-HEP-1）、仅效应细胞（NK92MI）、加入裂解缓冲液的靶细胞（完全裂解对照）、靶细胞培养基、NK92MI培养基，以及靶细胞培养基与NK92MI培养基按1:1比例混合。
3. 基于钙黄绿素AM染色的显微镜法检测自然杀伤细胞介导的细胞毒性
- 将 SK-HEP-1 细胞培养至 70−80% 汇合度。先用 5 mL 1× PBS 洗涤细胞，再加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育，制备单细胞悬液。
- 将 SK-HEP-1 细胞在 1 mL 无菌离心管中以 160 × g 离心 3 分钟。将沉淀重悬于 3 mL 无血清 DMEM 培养基中。
- 向 SK-HEP-1 细胞中加入 1.5 µL 钙黄绿素 AM 溶液（10 mM），室温孵育 30 分钟。将标记钙黄绿素 AM 的 SK-HEP-1 细胞在 15 mL 无菌离心管中以 160 × g 离心 3 分钟。
- 用 5 mL 1× PBS 洗涤细胞两次，以去除多余的钙黄绿素 AM 染料。
- 同时，将 NK92MI 细胞在 15 mL 无菌离心管中以 160 × g 离心 3 分钟。用 5 mL 1× PBS 洗涤细胞沉淀一次，并重悬于 5 mL NK92MI 细胞培养基中。
- 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对钙黄绿素 AM 标记的 SK-HEP-1 细胞和 NK92MI 细胞进行计数。
- 将 SK-HEP-1 细胞重悬于培养基中，浓度为 1 × 105 个细胞/mL；将 NK92MI 细胞重悬于 NK 细胞培养基中，浓度为 1 × 106 个细胞/mL。
- 在 96 孔板中，每孔加入 100 µL 含 1 × 104 个钙黄绿素 AM 标记的 SK-HEP-1 细胞（靶细胞）和 100 µL 含 1 × 105 个 NK92MI 细胞（效应细胞），每孔靶细胞与效应细胞比例为 1:10，每个处理组设三个复孔。
- 将 96 孔板置于 37 °C、95% 空气和 5% CO2 的环境中孵育 4 小时。孵育结束后，使用荧光显微镜（10 倍物镜）拍摄钙黄绿素 AM 标记细胞的荧光图像。每种处理条件的每个重复至少拍摄 10 个不同视野。
- 为每个重复随机选取 10 张图像，计数与或不与 NK92MI 细胞共孵育的钙黄绿素 AM 阳性标记靶细胞数量。使用以下公式计算细胞毒百分比。
注意：作为对照，应设置不含 NK92MI 细胞的靶细胞组，以及完全裂解的靶细胞组（完全裂解对照）。为实现完全裂解，将细胞在含 0.5% Triton X-100 的溶液中孵育 1 小时（在 200 µL 培养基中加入 20 µL 5% Triton X-100）。
4. NK细胞迁移实验
- 培养NK92MI细胞，并在15 mL无菌离心管中以160 × g 离心3分钟。
- 用5 mL 1× PBS将细胞沉淀洗涤两次，然后将细胞重悬于3 mL无血清的NK92MI细胞培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对NK92MI细胞进行计数。
- 将NK92MI细胞（2.5 × 105 个细胞/100 µL/孔）接种至Transwell小室的上层（插入式培养小室直径为6.5 mm，孔径为5 µm）。
- 在下层培养室中加入0.6 mL含有待测NK细胞趋化因子性质物质的无血清培养基（例如条件培养基、趋化因子、细胞因子）。
注意：制备条件培养基时，应使用减血清培养基且不额外添加血清，以避免血清蛋白对迁移实验造成干扰。 - 将24孔Transwell培养小室在37 °C孵育4小时。4小时后，收集下层培养室中未贴壁且已迁移的NK92MI细胞，并转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中用于后续分析。
注意：培养时间可能因靶细胞类型以及靶细胞产生趋化因子的种类、浓度和动力学而异。因此，该时间应根据每种细胞类型、趋化因子和实验条件通过实验经验确定。 - 向每管含有迁移NK细胞的样品中加入预定数量的流式细胞术计数微球，体积为50 µL。使用具备自动化FACS细胞计数功能的任意流式细胞仪，检测每孔300 µL细胞悬液的体积。
注意：每次使用前均需充分混匀或涡旋振荡流式细胞术计数微球，以确保每次使用微球数量恒定，从而减少实验变异性。建议使用反向移液法操作计数微球以保持准确性。仅使用NK细胞和计数微球作为流式细胞术的FACS分析对照。作者建议至少检测10,000个微球与NK细胞的总事件数，该数值已被证实效果良好。然而，具体数值可能因实验条件不同而有所变化。因此，微球与NK细胞的总事件数应根据每类实验条件通过实验经验确定。此外，为获得具有统计学意义的结果并考虑不同细胞计数之间的变异性，必须以生物学重复三次的方式进行实验。 - 使用以下公式计算迁移的NK92MI细胞的绝对数量：
其中A = 细胞数量，B = 微球数量，C = 该批次微球的标定数量（每50 µL流式细胞术计数微球的数量；本例中为49,500），D = 样品体积（µL）。
注意：若FACS分析中使用300 µL样品体积（迁移细胞）和50 µL流式细胞术计数微球，则迁移细胞的绝对数量 = 1,700个细胞 / 3,300个微球事件 × 49,500个微球 / 300 µL = 84.975个细胞/µL。若样品被稀释或使用了不同体积的FACS计数微球，则需对计算结果进行相应校正。
结果
采用SK-HEP-1肝肿瘤细胞系作为模型系统，进行自然杀伤（NK）细胞毒性实验和NK细胞迁移实验。为通过乳酸脱氢酶（LDH）检测法测定NK细胞的细胞毒性，将表达非特异性（NS）shRNA或靶向激活转录因子4（ATF4）的shRNA的SK-HEP-1细胞与NK92MI细胞在96孔板中共孵育3小时（图1A）。已有研究表明，ATF4可通过上调激活配体ULBP1来调节NK细胞的细胞毒性28。通过比色法测定由NK细胞介导的靶细胞杀伤所释放的LDH活性，并根据方案1中所述公式计算细胞毒性百分比。ATF4基因敲低组与表达NS shRNA的对照组相比，NK细胞介导的细胞毒性显著降低（图1B-D）。我们还采用基于钙黄绿素AM（calcein AM）染色的检测方法评估NK细胞的细胞毒性。具体而言，将表达NS shRNA或靶向ATF4的shRNA的SK-HEP-1细胞用calcein AM标记后，与NK92MI细胞在96孔板中共同孵育4小时，如图2A所示。孵育结束后，使用FITC/GFP滤光片通过荧光显微镜捕获calcein AM阳性细胞的图像。由于被NK细胞杀伤的细胞不再保留calcein AM染料，因此该方法无法检测到死亡细胞。如图2B,C所示，与未与NK92MI细胞共培养的SK-HEP-1细胞相比，共培养后calcein AM阳性SK-HEP-1细胞数量减少。然而，正如预期，通过shRNA敲低ATF4可减弱NK细胞对SK-HEP-1细胞的杀伤作用，表现为calcein AM阳性细胞数量更多（图2B,C）。因此，基于LDH和基于calcein AM的两种检测方法结果一致，均证实ATF4基因敲低会降低NK细胞介导的肿瘤细胞毒性。上述任一方法均足以评估NK细胞介导的细胞毒性；然而，为提高实验的严谨性和结果的可信度，我们建议同时使用这两种方法。
我们还展示了24孔NK细胞迁移实验的结果。将NK92MI细胞重悬于无血清的NK92MI培养基中并加入上室，趋化因子CC基序配体2（CCL2）则添加至下室的可渗透膜腔室中。NK细胞的迁移能力按照第3节所述方法进行检测（图3A）。通过加入计数微球进行流式细胞术，并随后进行FACS分析，以定量迁移的NK92MI细胞数量。如图3B-C所示，与对照培养基相比，向含CCL2培养基方向迁移的NK92MI细胞数量显著增加。
图1：基于比色法LDH活性的NK细胞介导的细胞毒性检测。（A）比色法LDH活性检测NK细胞毒性的关键步骤示意图。（B,C）通过定量RT-PCR和蛋白质印迹法分析表达非特异性（NS）shRNA或靶向ATF4的shRNA的SK-HEP-1细胞中ATF4的表达水平。（B）在表达NS shRNA或ATF4 shRNA的SK-HEP-1细胞中，ATF4 mRNA相对水平经ACTINB表达水平归一化后显示。（C）表达NS shRNA或ATF4 shRNA的SK-HEP-1细胞中ATF4和ACTINB蛋白水平。（D）采用LDH法检测表达NS shRNA或ATF4 shRNA的SK-HEP-1细胞中NK细胞介导的细胞毒性。显示NK细胞介导的细胞毒性百分比（%）。数据以均值±标准误表示；ns，无显著性差异；**p < 0.01，***p < 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：基于钙黄绿素AM染色的显微镜法检测NK细胞介导的细胞毒性。（A）基于钙黄绿素AM染色的显微镜法检测NK细胞介导的细胞毒性的关键步骤示意图。（B）采用钙黄绿素AM法分析表达对照shRNA或ATF4 shRNA的SK-HEP-1细胞中NK细胞介导的细胞毒性。图中显示代表性图像。比例尺 = 200 μm。（C）B图所示实验中钙黄绿素AM阳性细胞的百分比。**p < 0.01。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：基于流式细胞术的NK细胞迁移定量实验。（A）示意图展示基于流式细胞术的NK细胞迁移实验的关键步骤。（B,C）在24孔板的下室加入50 ng CCL2后进行NK细胞迁移实验。（B）显示对照组或CCL2处理组培养基中NK细胞迁移的代表性散点图。（C）展示B图实验中的NK细胞迁移数据（均值 ± 标准误）。***p < 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文所述的细胞毒性和迁移方法可用于评估自然杀伤（NK）细胞对癌细胞的细胞毒性作用以及恶性肿瘤中NK细胞介导的免疫逃逸机制，同时可用于鉴定能够增强NK细胞活性或功能的治疗剂。这些实验方案操作简便、灵敏度高、可重复性强，是传统基于放射性51铬释放实验的优选替代方法。这些方案经过特别设计，可方便地适用于大多数实验室，采用易于解读的比色法、显微镜观察或基于流式细胞术（FACS）的检测读数，使研究人员能够得出可靠的结论。所有方法均可扩展，适用于高通量筛选策略。尽管本方案以单一肝癌细胞系为背景进行介绍，但可轻松地推广应用于其他类型的癌细胞和/或非癌靶细胞。
尽管所介绍的所有方法均具有稳健性和可重复性，但在使用不同批次的癌细胞和NK细胞时，实验间仍可能出现变异。为确保实验结果能够准确支持结论，建议使用生物学三复孔至少重复实验两次。
该方法的一个局限性在于NK92MI细胞的生长速度可能较慢。因此，对于包含50个或更多样本的实验，应提前培养足够数量的NK92MI细胞，以避免实验延误。此外，必须严格执行方案中描述的全部对照措施，以防止出现虚假或不可重复的结果。NK细胞毒性实验的另一个局限性是，NK细胞与癌细胞的比例以及孵育时间必须针对每种靶细胞进行优化。例如，我们针对肝癌细胞系测试了多种癌细胞与NK细胞的比例（1:5、1:10、1:20、1:40和1:80），以及多个孵育时间点（2、3、4、5和6小时）。根据我们的结果，当癌细胞与NK细胞的比例为1:10和1:20、孵育时间为3小时时，结果最为稳定一致。
此外，来源于实体瘤的癌细胞会贴壁并在培养板表面生长，而自然杀伤（NK）细胞则悬浮生长。如果孵育时间超过3小时，建议使用超低吸附96孔板，这将提高实验之间以及生物学重复之间的稳定性和可重复性。还需要注意的是，NK细胞诱导的细胞毒性实验也可使用从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离的原代NK细胞进行。然而，此类实验存在若干局限性：首先，与NK92MI细胞相比，这些实验难以进行规模扩增；其次，从PBMCs中分离的NK细胞在细胞毒活性上可能存在批次间差异，从而影响结果的可重复性和解释。类似地，文献中还描述了其他人类NK细胞系，也可用于此类实验，包括NKL细胞29；但与NK-92MI细胞不同，NKL细胞依赖IL-2且无法商业化获取。
在考虑上述所描述的钙黄绿素AM实验时，需要注意的是，细胞死亡后钙黄绿素AM仍保留在凋亡小体中30。因此，对钙黄绿素AM染色的定量应谨慎进行，因为它可能导致自然杀伤细胞毒性的低估。
与自然杀伤细胞（NK细胞）介导的细胞毒性类似，细胞因子和其他趋化因子对NK细胞迁移的调控在NK细胞功能的调节中起着重要作用。本文所述的NK细胞迁移实验提供了一个简单平台，可用于评估在趋化因子或其他趋化剂等刺激条件下NK细胞的迁移能力。该实验可用于评价能够促进或干扰NK细胞迁移的试剂，从而鉴定出NK细胞迁移的增强剂和抑制剂。该方法还可用于研究因基因/表观遗传学改变（如表达上调或下调）或药物处理所导致的NK细胞迁移调控能力的变化。
为准确测量自然杀伤细胞（NK细胞）的迁移能力，需遵循若干关键步骤。在使用条件培养基的所有实验中，必须确保对照组和处理组使用等量的条件培养基，以获得准确的测量结果。孵育时间应根据所使用的纯化趋化因子和条件培养基进行相应调整。最后，Transwell迁移实验是一种成熟且被广泛认可的评估NK细胞迁移能力的优良方法；然而，该实验所采用的均质单层培养体系缺乏组织甚至三维培养所具有的复杂生理环境，可能无法充分模拟肿瘤微环境的真实情况。
因此，尽管本文介绍的自然杀伤细胞毒性实验和自然杀伤细胞迁移实验存在某些局限性，但这些实验适用于广泛的免疫学研究，因而为评估自然杀伤细胞功能及调节自然杀伤细胞的免疫治疗手段提供了重要且可靠的方法。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢美国国立卫生研究院的资助：R01CA195077-01A1（NW）、R01CA200919-01（NW）和1R01 CA218008-01A1（NW）。我们还感谢美国国防部提供的资助W81XWH1910480和W81XWH-18-1-0069（授予NW）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 绝对计数微球 | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
| Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
| Amicon ultra 离心滤器 | Millipore | UFC900324 | |
| Calcein AM 染料 | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140079 | |
| 叶酸 | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| 马血清 | Gibco | 16050114 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco | 2530081 | |
| LDH 细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| myo-肌醇 | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| NK92MI 细胞 | ATCC | CRL-2408 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| SKHEP-1 细胞 | ATCC | HTB-52 | |
| Transwell 可渗透小室 | Costar | 3241 | |
| 胰蛋白酶 EDTA 溶液 | Gibco | 25200056 |
参考文献
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