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荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

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DOI：

10.3791/60726

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2020年2月18日

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1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, Harvard University, 2Department of Biology, College of William and Mary, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Department of Bioengineering, California Institute of Technology, 5Department of Computer Science, College of William and Mary

本文内容

摘要

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。

摘要

多种细胞类型中均可观察到自发性细胞内钙活动，且据推测其在多种生理过程中发挥关键作用。特别是在脊椎动物神经发育过程中，胚胎发生期钙活动模式的适当调控对于多种神经发育事件至关重要，包括神经管的正常闭合、突触形成以及神经递质表型的确定。尽管钙活动模式在频率和振幅上的差异提示了一种潜在的机制，即这些钙流可能以编码信号的形式传递给下游效应分子并调控基因表达，但现有的群体水平研究方法尚缺乏深入探索这一可能性所需的精确度。此外，这些方法因无法检测在无细胞间接触条件下神经元命运决定的状态，从而限制了对细胞间相互作用作用的研究。因此，我们建立了一种实验流程，将分离的神经组织外植体的钙活动延时成像与荧光原位杂交检测相结合，从而在单细胞水平上实现钙活动模式与分子表型的明确关联。我们已成功利用该方法区分并表征了与分化中的神经细胞及神经前体细胞各自相关的特定钙活动模式；除此之外，本文所述的实验框架亦可便捷地适用于研究任何时间序列活动模式与目的基因或基因群表达之间的相关性。

引言

游离胞质钙对多种生物过程至关重要，从细胞增殖和迁移到凋亡和自噬均依赖其调控1,2,3在这些通路中，钙离子可通过与钙结合结构域相互作用，诱导蛋白质构象改变，从而调控蛋白质活性及相互作用，进而对基因表达产生下游效应。例如，一种称为下游调节元件拮抗性调节因子（DREAM）的神经元钙感应蛋白，在与钙离子结合时会维持在未折叠的中间构象状态，从而阻止其与靶蛋白及DNA靶点发生相互作用。4然而，除了作为简单的信号分子外，细胞内钙瞬变的动态特性使得这些活动模式能够编码更复杂的基于幅度或频率的信号5,6转录因子活化T细胞核因子（NFAT）的核转位受钙振荡频率调控：高频钙振荡促进其核转位，而低频钙振荡则抑制该过程7值得注意的是，最近的研究表明，NFAT 可能实际上响应于钙的累积暴露8. 钙调磷酸酶和Ca2+/钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）也对特定频率、持续时间或幅度的钙瞬变表现出不同的响应9为了增加调控的复杂性，计算模型表明，许多下游钙结合蛋白在结合竞争者存在或缺失的情况下，其对频率的依赖性会相应增强或减弱。10,11.

在发育中的神经系统内，已定义出两类主要的钙活动行为，并将其与特定的生物学过程相关联。如果钙内流发生在单个细胞内，钙信号在五秒内达到约基础水平强度的400%，并呈现双指数衰减，则被归类为"尖峰"12。此类信号主要与神经递质表型的确定相关13。相比之下，"钙波"被定义为较慢且幅度较低的钙瞬变，其特征是细胞内钙浓度在30秒或更长时间内上升至约基础水平的200%，随后在数分钟内逐渐衰减12。这类信号常在多个相邻细胞间传播，其存在与神经突起生长及细胞增殖相关14,15。然而，尽管这两类活动是基于其特征性的动力学谱型所定义，但目前尚不明确细胞究竟识别这些模式中的哪些具体特征，并由下游效应分子进行转导。

理解细胞内钙振荡与基因表达之间的关系，将有助于深入认识确保神经系统适当发育和模式形成的调控机制之一。为此，对胚胎脊髓的研究表明，发育过程中钙峰活动的增加与抑制性神经元水平升高相关，而钙峰活动的减少则与兴奋性神经元水平升高相关13。然而，这些基于群体水平的检测尚未被用于在单细胞水平上将钙活动与基因表达关联起来。

在单细胞水平上研究这些问题，相较于以往的工作具有若干显著优势。首先，能够对大量细胞中的钙活动和基因表达进行单个评估，从而观察到完整的不同活动模式，而不会因群体水平的测量而被掩盖。此外，在单细胞原代培养中研究这些关系，可保持钙活动与基因表达之间的细胞自主性关联，同时消除依赖细胞间通讯的相互作用。因此，该方法可将这些细胞自主性机制独立出来进行研究。然而，该方法也允许阐明和探究非细胞自主性钙活动的作用。例如，可在神经板阶段从胚胎中分离细胞，培养至其同胞对照组达到神经管阶段，然后与从神经管阶段胚胎中 freshly 分离的细胞进行比较。这使得能够直接比较在关键发育时期保留了细胞间通讯的细胞与细胞间通讯被阻断的细胞。

为了克服以往实验方法的局限性，我们开发了一种实验方案，可同时评估单个神经前体细胞中的钙活动与基因表达，从而将特定的活动模式与后续的分化程序相关联。在非洲爪蟾（Xenopus laevis）神经发育的不同阶段分离神经组织，将其解离为单细胞，并在荧光钙指示剂存在下通过共聚焦显微镜进行成像。活细胞成像完成后，样品经固定处理，随后采用荧光原位杂交（FISH）检测目标基因或剪接异构体的表达水平。重要的是，可在两次成像实验之间对同一单个细胞进行追踪，从而将细胞的钙活动特征与其基因表达水平相互关联（图1）。本文所报道的实验方案旨在探究非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎神经发育过程中钙活动模式与基因表达之间的关系。然而，该实验的整体框架（单细胞时间序列成像，随后进行FISH检测及图像共定位）可经适当修改后广泛应用于几乎所有细胞类型、荧光报告分子以及目标基因的研究。

方案

所有涉及动物的操作均依照威廉与玛丽学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 动物护理与胚胎操作

  1. 通过皮下注射的方式，将人绒毛膜促性腺激素（HCG）注入成年非洲爪蟾（Xenopus laevis）的背侧淋巴囊，雌性剂量为600 U，雄性为400 U，以诱导自然交配。
  2. 注射后，将至少一只雄性和一只雌性青蛙置于室温饲养缸中过夜。产卵通常在注射HCG后9–12小时开始。
  3. 收集胚胎，并用2%半胱氨酸溶液（pH 8.0）轻轻冲洗2–4分钟以去除卵胶膜。
  4. 用0.1×马氏改良林格液（MMR）（100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgSO4、2 mM CaCl2、5 mM HEPES，pH调至7.4–7.6）将胚胎清洗3次。
  5. 将胚胎转移至含有0.1× MMR和50 µg/mL庆大霉素的100 mm玻璃培养皿中。每皿放置50–100个胚胎为宜。
  6. 将培养皿置于14 °C–22 °C条件下孵育，使胚胎发育至所需的目标发育阶段。定期使用塑料移液管清除未受精细胞以及坏死或发育异常的胚胎。
    注意：为确保一致性，发育阶段的判定应依据Nieuwkoop和Faber所定义的形态学标准16。具体关注的发育阶段依实验目的而异。例如，重要的神经发育标志事件包括第14期（神经胚形成起始）、第18期（神经管闭合起始）和第22期（尾芽伸长起始）。

2. 胚胎解剖与样品制备

  1. 溶液配制
    1. 配制含有 116 mM NaCl、0.67 mM KCl、2 mM CaCl2·2H2O、1.31 mM MgSO4 和 4.6 mM Tris 的 2 mM Ca2+ 溶液。每 100 mL 溶液中加入 1 mL 青霉素/链霉素（10,000 U/mL 青霉素；10,000 µg/mL 链霉素）。调节 pH 至 7.8，并进行过滤除菌。
    2. 通过混合 116 mM NaCl、0.67 mM KCl、4.6 mM Tris 和 0.4 mM EDTA 配制无钙镁（CMF）溶液。调节 pH 至 7.8，高压灭菌以实现灭菌。每 100 mL 溶液中加入 1 mL 青霉素/链霉素（10,000 U/mL 青霉素；10,000 µg/mL 链霉素）。调节 pH 至 7.8，并进行过滤除菌。
  2. 解剖与成像用培养皿的准备
    1. 对两个 35 mm 塑料培养皿和一个 35 mm 细胞培养皿（见材料表）进行紫外线灭菌。
    2. 在超净工作台内，准备两个 50 mL 塑料锥形管，每管加入 10 mL 的 2 mM Ca2+ 溶液。
    3. 继续在超净工作台内操作，向一个 35 mm 塑料培养皿中加入 2 mL 2 mM Ca2+ 溶液，向一个 35 mm 细胞培养皿中加入 2 mL 2 mM Ca2+ 溶液，向另一个 35 mm 塑料培养皿中加入 2 mL CMF 溶液。
    4. 在超净工作台外，用含庆大霉素（50 µg/mL）的 0.1x MMR 填充两个 100 mm 塑料培养皿和一个 35 mm 塑料培养皿。用 70% 乙醇填充一个 60 mm 塑料培养皿。
    5. 在解剖前立即向含有 Ca2+ 溶液的 50 mL 锥形管之一中加入 0.01 g 胶原酶 B。充分混匀后，将溶液转移至一个新的 60 mm 塑料培养皿中。
  3. 借助解剖显微镜，识别处于目标发育阶段的胚胎。使用无菌移液管将至少六个合适的胚胎转移至步骤 2.2.4 中准备的含 0.1x MMR + 庆大霉素的 100 mm 培养皿之一中。该培养皿将作为暂存培养皿。
  4. 使用无菌移液管将一个胚胎转移至另一个含 0.1x MMR + 庆大霉素的 100 mm 培养皿中。该培养皿将作为解剖培养皿。
    1. 若解剖的胚胎已发育至能够活动的阶段（约第 23 阶段或更晚），应在解剖前将其麻醉：将胚胎转移至含有 0.1% 3-氨基苯甲酸乙酯（溶于含庆大霉素（50 µg/mL）的 0.1x MMR）的培养皿中。待胚胎完全不动后，将其移回含庆大霉素（50 µg/mL）的 0.1x MMR 培养皿中，并继续进行解剖操作。
  5. 小心去除包裹胚胎的卵黄膜。最简便的方法是使用一对钝头镊子固定胚胎，同时用一对精细镊子夹住膜，然后用精细镊子轻轻拉扯，将卵黄膜剥离。
  6. 使用精细镊子将胚胎的背侧和腹侧区域分开。可通过沿前后轴“夹捏”胚胎，将其切成两半。使用无菌移液管将背侧部分转移至步骤 2.2.5 中准备的含胶原酶溶液的 60 mm 培养皿中。丢弃腹侧部分。
  7. 让背侧外植体在胶原酶溶液中于室温孵育 1–2 分钟。然后轻轻将其转移回解剖培养皿中。
  8. 通过小心去除外胚层中预定神经组织上所有残留的内胚层和中胚层污染，完成解剖。对于第 22 阶段或更晚的胚胎，还应移除并丢弃神经管。
    注：若在解剖过程中需要，可使用步骤 2.2.4 中准备的 70% 乙醇培养皿对镊子进行清洁或重新灭菌。
  9. 解剖完成后，轻轻将外植体转移至步骤 2.2.3 中准备的含 Ca2+ 溶液的 35 mm 培养皿中。
  10. 重复步骤 2.4–2.9，直至收集到四个外植体。
  11. 使用 P1000 移液器将全部四个外植体转移至含 CMF 溶液的 35 mm 培养皿中，注意避免外植体与气液界面接触。轻轻摇晃培养皿，使所有外植体聚集在培养皿中央。
  12. 于室温孵育 1 小时，使外植体解离。
    注：为促进解离，可在 CMF 溶液中加入 0.025%–0.01% 胰蛋白酶。对于较老的胚胎（第 22 阶段及以上），此步骤可能对有效解离是必要的。
  13. 此时，暂存培养皿中应至少保留两个处于合适发育阶段的胚胎。将这些胚胎转移至一个新培养皿中，该培养皿已按步骤 2.2.4 准备好含庆大霉素的 0.1x MMR，并盖上盖子，使其在不受干扰的条件下发育，以匹配外植体培养皿的条件。这些胚胎将作为同胞对照。
  14. 使用速干胶将微刻度盖玻片（见材料表）粘附在步骤 2.2.3 中准备的 35 mm 细胞培养皿底部。
    注：在盖玻片边缘涂抹少量速干胶，然后将其牢固压在细胞培养皿的底面。胶水接触网格的任何区域都会遮挡位置标记，因此必须确保盖玻片中央的网格区域不接触胶水。
  15. 外植体解离 1 小时后，使用 P100 移液器将其转移至细胞培养皿中。为尽可能多地将细胞接种在培养皿的网格区域，应将移液器保持低角度靠近培养皿表面，将移液器尖端置于网格内角并朝向内部，然后用力将细胞悬液喷射过整个网格区域。理想情况下，细胞会沉降成一个紧密而密集的团块。
  16. 于室温孵育 1 小时，使细胞贴附于培养皿表面。在此孵育开始时，确定并记录同胞对照胚胎的发育阶段。
  17. 将 5 µL 1 mM Fluo-4 AM（见材料表）与 2 µL 10% Pluronic F-127 酸混合。
    注：Fluo-4 AM 对光敏感，应始终保存在避光管或用铝箔包裹的管中。
  18. 孵育完成后，将样品培养皿移至暗室或其他避光位置。使用移液器从培养皿边缘移除 100 µL 溶液。将此溶液加入 Fluo-4 AM/Pluronic F-127 酸的分装液中，反复吹打混匀，然后将全部体积加回样品培养皿中。轻轻摇晃以混匀。
  19. 用铝箔覆盖培养皿，并于室温孵育 1 小时。在此孵育开始时，确定并记录同胞对照胚胎的发育阶段。
  20. 孵育结束后，使用另一管 2 mM Ca2+ 溶液进行三次换液，方法如下：1）从培养皿中移除 1 mL 溶液，加入 3 mL 新鲜溶液；2）从培养皿中移除 3 mL 溶液，加入 3 mL 新鲜溶液；3）从培养皿中移除 3 mL 溶液，加入 3 mL 新鲜溶液。

3. 钙成像

注意：使用倒置共聚焦显微镜进行钙成像（材料表）。

  1. 将样品板放置在显微镜载物台上，注意避免暴露于环境光下。固定样品板后，使用记号笔标记板的前端位置，以便在后续成像时能够找到相同的视野。
  2. 在显微镜下定位样品——先使用10倍物镜，再切换至20倍物镜——并选择适合成像的视野。理想的视野应细胞密度较高，但又不至于过密导致细胞成团或难以单独区分。
  3. 调节显微镜焦距，使带网格刻度的盖玻片清晰可见。盖玻片上标记的数字可作为特定网格位置的唯一标识，用于在后续成像中重新定位同一视野。若最初选定的视野未覆盖任何数字，请重新调整，直至视野中出现可识别的数字。
  4. 对选定的视野拍摄明场图像，确保带网格刻度的盖玻片处于焦点。
  5. 调整焦距设置，再次拍摄选定视野的明场图像，使细胞处于焦点位置。
  6. 当细胞层处于焦点时，使用488 nm激光照射样品。可根据每次实验优化HV和Offset参数，以确保在FITC通道检测到荧光信号的动态范围。
  7. 对于两小时的成像，调整成像配置以采集901帧图像，扫描时间为3.93 s，时间间隔为8 s。运行配置以获取图像。
  8. 成像完成后，将样品板从显微镜载物台上取下。从板中移除1 mL溶液，并加入1 mL 2x MEMFA（含200 mM MOPS、2 mM EGTA 和 2 mM MgSO4 的7.4%甲醛溶液）。
  9. 在室温下孵育2小时，或在4 °C下过夜。在此孵育开始时，确定并记录同胞对照胚胎的发育阶段。
  10. 固定完成后，将板中所有溶液移除，并替换为2 mL 1x PBS。将样品板置于4 °C保存，以备后续处理。

4. 基因表达分析：探针合成

  1. 如下所述，为原位杂交制备一条反义RNA探针。此外，针对同一基因制备一条有义探针，作为阴性对照使用。
  2. 为纯化含有探针模板序列的质粒DNA，将含有模板质粒的细菌甘油菌种接种至150 mL LB液体培养基中。在37 °C条件下振荡培养过夜，或直至培养物变浑浊。
  3. 使用您所选择的方法从细菌培养物中纯化质粒DNA。
    注意：我们使用McNary-Nagel中量提取试剂盒以获得高产量的质粒DNA。
  4. 为确认质粒中含有预期的插入片段，进行限制性酶切消化，并在琼脂糖凝胶上分析酶切产物。也可将未酶切的质粒在琼脂糖凝胶上进行分析，以检测是否存在基因组DNA污染。
  5. 为线性化模板DNA，设置一个100 µL的限制性酶切反应体系，其中包含20 µg质粒DNA、2 µL适当的限制性内切酶和1×相应的缓冲液。在37 °C下孵育至少2小时。
  6. 通过苯酚/氯仿抽提，随后进行氯仿抽提，以提取线性化的DNA。
  7. 用100%乙醇沉淀DNA。可通过向样品中加入两倍体积的冷乙醇，并在-80 °C下孵育至凝固（15–30分钟）来快速完成。
  8. 使用预冷的离心机，在12,000 × g、4 °C条件下离心20分钟，使DNA沉淀成团。
  9. 弃去上清液，并用200 µL 70%乙醇洗涤沉淀。在12,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
  10. 弃去上清液，将沉淀在空气中干燥约5分钟。用20 µL 1× TE缓冲液重悬，于4 °C保存备用。
  11. 为合成并纯化反义RNA探针，通过混合15 µL 10 mM rCTP、15 µL 10 mM rGTP、15 µL 10 mM rATP、9.75 µL 10 mM rUTP和5.25 µL 10 mM dig-11-UTP，配制2.5 mM的rNTP混合液（参见材料表）。
  12. 设置一个50 µL的体外转录反应体系，其中包含步骤4.2–4.10中获得的4 µg线性化模板DNA、15 µL步骤4.11配制的2.5 mM rNTP混合液、10 µL 5×转录缓冲液、5 µL 0.1 M DTT、0.5 µL RNase抑制剂（20 U/µL）和1.5 µL适当的RNA聚合酶（T3、T7或SP6）。在37 °C下孵育1小时。
  13. 向反应体系中再加入1.5 µL RNA聚合酶，继续在37 °C下孵育1小时。
  14. 向反应体系中加入1 µL RQ1 DNA酶，在37 °C下孵育10分钟，以降解DNA模板。
  15. 向样品中加入30 µL 7.5 M LiCl溶液。用移液器吹打混匀，并在-20 °C下孵育至少1小时。
  16. 使用预冷的离心机，在14,000 × g、4 °C条件下离心25分钟。
  17. 弃去上清液，并用500 µL 70%乙醇冲洗沉淀。在14,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
  18. 弃去上清液，将沉淀在空气中干燥约5分钟。用20 µL无核酸酶水重悬。
  19. 通过将样品用杂交缓冲液（50%甲酰胺、5× SSC（生理-柠檬酸钠缓冲液；750 mM NaCl，75 mM 柠檬酸钠，pH 7.0）、1 mg/mL 酵母RNA、0.1% Tween-20、1× Denhardt溶液、0.1% CHAPS、10 mM EDTA 和 100 µg/mL 肝素）稀释至终浓度为10 ng/µL，配制10倍浓度的探针储备液。于-20 °C保存备用。

5. 基因表达分析：荧光原位杂交

注意：所有洗涤步骤应使用无菌、独立包装的移液管，每次加入约 1 mL 溶液进行操作。在添加或移除溶液时，应将移液管置于培养板边缘，洗涤过程应尽可能轻柔，以确保细胞不会从培养板表面脱落而丢失。

  1. 从孔板中移除 1x PBS（来自步骤 3.10），加入新鲜的 1x PBS，并在室温下孵育 5 分钟。
  2. 将 25 mL 的 0.1 M 三乙醇胺（pH 8.0）与 62.5 µL 乙酸酐混合，充分混匀。用此溶液洗涤孔板 10 分钟。
  3. 用 1x SSC 洗涤孔板 5 分钟。
  4. 用 0.02 M HCl 洗涤孔板 10 分钟以通透细胞。
  5. 用 1x PBS 洗涤孔板两次，每次 5 分钟。
  6. 移除溶液，向孔板中加入 1 mL 杂交缓冲液（50% 甲酰胺，5x SSC（750 mM NaCl，75 mM 柠檬酸钠，pH 7.0），1 mg/mL 酵母 RNA，0.1% Tween-20，1x Denhardt 溶液，0.1% CHAPS，10 mM EDTA 和 100 µg/mL 肝素）。在 60 °C 下振荡孵育至少 6 小时。
  7. 移除杂交缓冲液，替换为 750 µL 的 1x RNA 探针溶液（由步骤 4.19 制备的 10x 储液稀释而成）。正义 RNA 探针可用作阴性对照。
  8. 在 60 °C 下振荡孵育 8–14 小时。
  9. 移除探针溶液并储存于 -20 °C。
    注意：1x 探针稀释液最多可重复使用三次，之后应弃去。
  10. 用 0.2x SSC 冲洗孔板。
  11. 用新鲜的 0.2x SSC 在 60 °C 下洗涤 1 小时。
  12. 将孔板转移至室温，平衡 5 分钟。
  13. 用 0.2x SSC 洗涤孔板 5 分钟。
  14. 用 1x PBT 洗涤孔板 15 分钟。
  15. 用含 2% H2O2 的 1x PBT（0.1% Triton-x-100）洗涤孔板 1 小时。
    注意：该溶液对光敏感，每次实验均需新鲜配制，并避光保存。孵育期间孔板也应避光或用铝箔包裹。
  16. 用 1x TBST（150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1% Tween-20）洗涤孔板 15 分钟。
  17. 将封闭试剂用马来酸缓冲液（100 mM 马来酸，150 mM NaCl，pH 7.5）稀释至 2%。在室温下用此混合液封闭细胞至少 1 小时。
  18. 将封闭液替换为用含 2% 封闭试剂的马来酸缓冲液按 1:1,000 稀释的抗地高辛-POD 抗体溶液。在 4 °C 下孵育过夜。
  19. 用 1x TBST 冲洗孔板 3 次。
  20. 用 2 mL 的 1x TBST 洗涤 4 次，每次至少 15 分钟，持续振荡。
  21. 用 1x PBT 洗涤 2 次，每次至少 10 分钟，持续振荡。
  22. 将 Cy3 标记的酪胺按 1:25 比例用 1x PBT 稀释。用 750 µL 该稀释液洗涤孔板 5 分钟。
    注意：该溶液极光敏感，实验后续步骤中孔板应始终用铝箔包裹或避光，以防止信号衰减。
  23. 向该溶液中加入 2.5 µL 的 0.3% H2O2，并在室温下继续振荡孵育 40 分钟。
  24. 用 1x TBST 洗涤 4 次，每次至少 15 分钟，持续振荡。
  25. 用 1x PBT 冲洗。
  26. 在 1x MEMFA（100 mM MOPS，1 mM EGTA，1 mM MgSO4，含 3.7% 甲醛）中于室温孵育 1 小时以固定细胞。
  27. 移除溶液，替换为 1x PBS。将孔板置于铝箔包裹的容器中，于 4 °C 保存，待后续处理。

6. 细胞成像

注意：成像使用倒置共聚焦显微镜进行。

  1. 将样本板放置在显微镜载物台上，使步骤 3.1 中标记的记号对准载物台前方。
  2. 调节焦距，使带网格的盖玻片清晰可见，并以步骤 3.4 中获取的网格图像为参考，调整视野，使其与钙成像（第 3 节）中捕获的视野一致。
  3. 获取网格和细胞的明场图像。
  4. 使用 595 nm TRITC 激光照射样本。根据阴性对照细胞的图像，调节增益值以适当区分信号与背景，并采集一幅静态图像。
    注意：理想情况下，背景荧光水平应基于与非靶向正义 RNA 探针平行处理的阴性对照板确定。调节增益设置，使该对照板呈现完全黑色（对应背景水平），随后在同一批次实验的其他样本板成像过程中保持该增益设置不变。

7. 数据处理

注意：数据处理使用 Nikon Elements 软件完成。

  1. 打开步骤 3.7 中的 2 小时钙成像图像。通过选择 Binary > Spot Detection > Bright Spots，识别每个单个细胞对应的像素。确保已选择 FITC 通道。
  2. 生成该图层后，单个细胞上方将出现彩色圆圈。调整细胞分布和大小参数，使尽可能多的细胞被识别并关联到唯一的标识符。
  3. 通过导航至 View > Analysis Controls > Tracking Options，对图像的所有帧进行细胞追踪。将轨迹间最大间隔设为 5 帧，删除与少于 600 帧相关联的对象，并选择 Close Gaps 选项。选择 Track Binaries 以将细胞追踪应用于图像。
  4. 细胞完成追踪后，手动删除任何不代表单个细胞的对象（例如细胞团块）。但不应根据钙活动轨迹的形态特征排除后续分析中的数据点。
  5. 在图像面板中，选择 View Overlay > Show Binary Object ID。滚动至图像末尾（第 901 帧），然后选择 Edit > Create View Snapshot (8bit RGB)> Current Frame > OK。这将生成图像最后一帧的快照，其中每个细胞关联的二进制 ID 可见。保存此图像。
  6. 通过选择所有对象，然后选择 Export Data to Excel，导出时间序列数据。将输出保存为 CSV 文件。
  7. 打开 FISH 图像。参照步骤 7.1–7.2 优化点状信号检测，但使用 TRITC 通道而非 FITC 通道。手动删除任何错误分配的二进制对象，然后选择 Automated Measurement Results > Update Measurement，以计算每个细胞的信号强度。通过重复步骤 7.5 和 7.6，导出图像快照和数据表。
  8. 创建一个电子表格，其中 A 列标记为 FISH Binary ID，B 列标记为 Calcium Binary ID。打开在步骤 7.5 和 7.7 中导出的图像。对于 FISH 图像中识别出的每个对象（步骤 7.7），在 A 列中记录其二进制 ID；然后在钙成像图像中（步骤 7.5）定位对应的细胞，并在 B 列中记录该二进制 ID。无法在两幅图像中均明确识别的细胞不应添加到电子表格中。
    注意：可使用图像编辑软件（如 Adobe Photoshop 或 GIMP 图像编辑器）同时打开两幅图像，将其中一幅设为半透明并叠加到另一幅上，以更轻松地识别和关联每个细胞的两个二进制 ID。
  9. 对于每个已识别的细胞，整合其时间序列钙成像数据（与 Calcium Binary ID 关联，于步骤 7.6 导出）和基因表达数据（与 FISH Binary ID 关联，于步骤 7.7 导出），可手动或通过脚本完成。
    注意：下游数据处理与分析可能包括将这些数据整合为单一数据表，并应用一系列分析技术（如峰计数、分形分析和马尔可夫熵），以帮助研究者识别钙活动的新模式 17,18。

结果

可用于钙成像的离散细胞制备成功的示例如图2A所示。细胞接种密度较高，可从每幅图像中获取最大量的信息，但又不至于过于密集而无法明确区分单个细胞。在2小时的成像过程中，每个明确定义的细胞均检测到荧光信号。将实验中记录的所有细胞轨迹整合成一幅复合图进行可视化，可揭示整体或群体水平测量可能掩盖的更为精细的放电行为模式（图2B）。当单独分析各个细胞的记录曲线时，可清晰识别出神经前体细胞特征性的不规则放电活动。与成熟神经元不同，胚胎期神经细胞表现出不规则、高度可变且复杂的钙活动特性（图2B）。为了量化这种复杂性，已应用多种数据分析方法17,18，包括采用多种参数来定义一次钙峰（图2C）。

通过将实验组与使用非结合性正义RNA对照的背景对照组进行比较，可以评估荧光原位杂交是否成功，包括反义mRNA探针的设计与合成是否成功（图3A,B）。此外，还可通过处理已知在可检测水平表达目标mRNA的细胞类型来进行阳性探针对照实验。

在钙成像和FISH成像之间识别同一个细胞，要求细胞在探针杂交和处理过程中基本保持相同的位置。如果培养板操作不当或洗涤过于剧烈，细胞可能从板表面脱落，在溶液弃去时丢失，或重新沉积到板上的其他位置，从而导致无法在不同图像间匹配同一细胞（图4A）。如果这种干扰仅影响视野中的部分细胞，则仍有可能检测并匹配图像中的部分细胞（图4B）。然而，当FISH操作谨慎进行，且在成像之间仅有少量细胞丢失或移位时，实验可获得最大量的有效数据（图4C）。

在收集到足够数量的细胞在特定发育阶段的钙活动和基因表达数据后，可进一步分析这两者之间的相关性（图1）。已有多种指标用于量化钙活动模式，包括脉冲计数/频率、平均功率、Hurst指数估计以及马尔可夫熵测量17,18。基因表达可根据具体研究问题，通过绝对荧光强度进行定量，或以二元（有/无）方式分级。

将钙活动与神经前体细胞标志基因表达进行关联的实验结果揭示了特定钙活动模式与神经递质表型之间的多种关联。在神经板阶段（14期），表达抑制性神经元标志基因gad1.1的GABA能细胞表现出比不表达gad1.1的细胞更为规律且振幅更高的钙活动（图5A）。此外，尽管表达gad1.1的细胞与高频的高振幅簇状放电相关，但表达兴奋性神经元标志基因slc17a7的谷氨酸能细胞中更常见的是低振幅放电。

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图1：实验工作流程示意图。 比例尺 = 100 μm。第3-5图板中的图像取自Paudel等（2019）17。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：钙离子成像及典型活性图谱。（A）Fluo4-AM 指示的细胞内钙离子活性。每幅2小时的图像由901帧组成，此处展示其中一帧代表性图像。（B）成像视野内所有细胞随时间变化的荧光强度复合图。曲线清晰显示了指示染料（Fluo4）随时间发生的光漂白现象。左上角的栅格图展示了应用Eilers和Boelen19开发的去趋势算法后钙离子活性的代表性轨迹，此处显示的细胞表现出多样化的簇发放电行为。（C）应用不同阈值（基线水平的150%和200%，其中基线为去趋势后荧光强度的平均值）来定义一次峰电位事件（绿色和蓝色箭头所示）。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：FISH成像。（A）使用不结合的正义RNA探针作为阴性对照进行FISH实验。成像参数已调整至无细胞显示荧光信号。某些视野中可能出现带有微弱荧光的非细胞碎片，如（A）图右上角和右下角所示；这些在背景设定时可忽略不计。（B）随后使用相同的成像参数对实验组样品（反义RNA探针）进行成像。在此条件下观察到的荧光信号代表高于背景水平的基因表达。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：图像叠加与共定位。 对同一样本分别进行钙活性成像（细胞以实心绿色圆圈表示）和FISH检测后（细胞以阴影红色圆圈表示）的示意图。(A) 在样本处理过程中发生显著位移的细胞，在两幅图像之间无法可靠地识别。(B) 细胞破坏可能仅影响视野中的部分细胞；部分细胞在两幅图像中均可清晰识别，而另一些则无法确切匹配。(C) 若样本处理得当，大多数细胞将保持原位，可在两幅图像中被准确识别。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：本方法应用示例，箱线图显示钙活动与基因表达（基因 GABA 和 Glut）之间的关联 gad1.1 和 slc17a7 分别在神经板期的非洲爪蟾（Xenopus laevis）中。 在14期，gad1.1阳性细胞（GABA）表现出更高振幅且更规律的钙活性，其定义依据为（A马尔可夫熵18 和（B) 使用去趋势荧光强度（基线）平均值的125%、150%、200%和300%作为阈值进行尖峰计数17 比 slc17a7 阳性细胞（Glut）。星号表示根据Bonferroni校正的双样本Kolmogorov–Smirnov检验（p < 0.05）具有统计学显著差异。 < 0.05）以及效应量的Cohen's d统计（n = 5个培养样本和 >100 个细胞；* 0.2 ≤ |d| < 0.5)。该图根据Paudel等人获得的数据集重新绘制并改编。17. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在构成发育中神经系统的细胞中，已观察到特征性的钙活动模式，特定类型的活动与不同的神经发育过程相关联。然而，要深入理解这些富含信息的活动模式如何转化为转录响应的机制，需要在单细胞分辨率下同时获取钙活动和基因表达的数据。尽管对于钙活动较为刻板的系统（如成熟神经元）可以在群体水平上进行合理检测，但胚胎神经系统所特有的不规则活动模式却容易被精度较低的记录方法所掩盖。

本方案中建立的实验框架可轻松适用于多种细胞类型和荧光报告系统。可从目标模式生物中分离出包含几乎任何单一细胞类型或多种细胞组合的组织，并进行单细胞成像培养。原代细胞培养方法不仅有助于细胞鉴定并分离细胞自主性过程的影响，还允许实验者根据需要确定培养基的组分。例如，已有研究通过比较神经元前体细胞在 2 mM Ca2+ 溶液中的活性，来探究在无细胞间相互作用影响的情况下，是否能够重现胚胎脊髓中动作电位频率与神经递质表型之间的关系13,20。

尽管本实验方案利用荧光标记物Fluo4-AM检测细胞内钙离子活性，但根据选择标准，使用者也可选择其他市售的标记物21，包括基因编码的钙离子指示剂。类似地，也可采用其他标记物来监测目标离子（包括K+、Na+和Zn2+）浓度、膜电位或细胞pH值的动态变化。成像参数和成像时长可根据需要进行调整。

尽管我们将钙活性与神经元表型的相关性作为一个具体应用进行了研究，但该方法也可适用于多种其他细胞特性。例如，可使用针对任何目的基因的探针进行荧光原位杂交（FISH），包括神经元标记物 ChAT 或转录因子 Engrailed，从而实现对可定制的一组 mRNA 分子的高灵敏度检测。这些探针可设计为特异性识别特定剪接异构体，以在需要时提供更高的靶标特异性。通过使用偶联了两种不同荧光染料的探针，可进行双重 FISH 实验，从而同时评估多个基因的表达情况。然而，此类实验所需的额外洗涤步骤会增加细胞丢失或移位的风险，因此需要操作者具备一定的经验与精细的操作技巧。

无论对该方案进行何种实验特异性的修改，都有几个关键步骤需要特别注意。解剖时应小心操作，以彻底清除所有污染组织或细胞群体；由于当外植体被解离后其空间分布模式将丧失，任何残留的邻近组织细胞都会与目标细胞混杂在一起而无法区分。细胞接种后，应尽可能轻柔地处理样品，以防止细胞脱落。最重要的是，所有溶液更换操作都应缓慢而谨慎地进行，移液时将移液器置于培养板边缘以添加或移除溶液。这将确保在钙成像和FISH图像中均能明确识别细胞。若在处理过程中细胞受到扰动，则可能无法在两幅图像之间识别出部分或全部对应的细胞。我们建议在进行细胞匹配时采取保守策略，仅使用那些能够明确对应的细胞进行后续分析。

根据所研究的生物学问题，可采用多种分析方法。时间序列的钙活动可通过多种方式进行处理和量化，实验者可灵活选择去趋势参数、分析指标和分析参数（例如，用于定义钙峰的基线百分比阈值）。通过将基因表达分析为从FISH图像中提取的绝对或相对荧光值，可以建立钙活动与基因表达水平之间的相关性。或者，通过设定阳性基因表达信号的荧光阈值，并为单个细胞分配“有”或“无”的标识，也可分析钙活动与基因表达（存在/缺失）之间的相关性。总体而言，该实验方案提供了一个极为灵活的流程，可用于结合单细胞匹配的基因表达数据进行时间序列数据的采集和初步分析。此类实验对于深入理解细胞动态与转录变化之间的复杂关系至关重要，例如在胚胎期非洲爪蟾（Xenopus laevis）神经前体细胞中鉴定出抑制性命运和兴奋性命运特征性的钙活动模式。

致谢

感谢Wendy Herbst和Lindsay Schleifer在本实验方案开发过程中所做的贡献。本研究工作获得了美国国立卫生研究院基金（1R15NS067566-01、1R15HD077624-01和1R15HD096415-01）对MSS的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>动物饲养 &与细胞培养
CHORULON（绒毛膜促性腺激素）默克动物保健
硫酸庆大霉素盐Millipore SigmaG1264
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）赛默飞世尔科技15140122
Pyrex 培养皿，100 mm × 20 mmMillipore SigmaCLS3160102
Corning Falcon Easy-Grip 组织培养皿，35 mmFisher Scientific08-772A
Corning Falcon Easy-Grip 组织培养皿，60 mmFisher Scientific08-772F
Falcon 标准组织培养皿Fisher Scientific08-772E
赛默飞世尔 Nunc 细胞培养/培养皿，35×10 mm 培养皿，Nunclon DeltaFisher Scientific12-565-90
Fisherbrand 标准一次性移液管，无刻度；长度：5.875 英寸；容量：7.7 mLFisher Scientific13-711-7M
甲磺酸三卡因Millipore SigmaE10521
胶原酶BMillipore Sigma11088807001
Dumont #55 镊子，DumostarFine Science Tools11295-51
Dumont #5 镊子，DumostarFine Science Tools11295-00
Cellattice 微刻线细胞培养表面Nexcelom BioscienceCLS5-25D-050
<强>用于钙成像
Fluo-4, AM, 细胞渗透性赛默飞世尔科技F14201
Pluronic F-127, 0.2 µm 过滤（水中 10% 溶液）赛默飞世尔科技P6866
<强>用于RNA探针制备
PureYield 质粒小提系统PromegaA1222
rATPPromegaP1132
rCTPPromegaP1142
rGTPPromegaP1152
rUTPPromegaP1162
地高辛-11-UTPMillipore Sigma3359247910
RNase 抑制剂赛默飞世尔科技N8080119
T3 RNA聚合酶PromegaP2083
T7 RNA 聚合酶PromegaP2075
SP6 RNA聚合酶PromegaP1085
RQ1 无RNase的DNasePromegaM6101
LiCl 沉淀溶液（7.5 M）赛默飞世尔科技AM9480
<强>用于荧光原位杂交
乙酸酐赛默飞世尔科技320102
封闭试剂Millipore Sigma11096176001
抗地高辛-POD，Fab片段Millipore Sigma11207733910
Cy3单反应性NHS酯Millipore SigmaGEPA13105
<强>溶液组分
氯化钙，96% 超纯，粉末，无水，ACROS OrganixsFisher ScientificAC349610
二水合氯化钙Millipore SigmaC3306
CHAPS 水合物Millipore SigmaC3023
Denhardt's 溶液（50X）赛默飞世尔科技750018
DTT，分子级（DL-二硫苏糖醇）PromegaP1171
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Fisher ScientificS311
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸Millipore SigmaE3889
甲酰胺（去离子）赛默飞世尔科技AM9342
猪肠黏膜来源肝素钠盐默克生命科学H3393
HEPES（超纯）赛默飞世尔科技11344041
过氧化氢溶液Millipore SigmaH1109
L-半胱氨酸Millipore Sigma168149
氯化镁，纯品，ACROS OrganicsFisher ScientificAC223211000
硫酸镁，97% 纯度，ACROS Organixs，无水Fisher ScientificAC413480050
马来酸，99%，ACROS OrganicsFisher ScientificACS125231000
MOPS（细白晶体/分子生物学级），Fisher BioReagentsFisher ScientificBP308
氯化钾默克生命科学P9541
酿酒酵母核糖核酸，IX型Millipore SigmaR3629
氯化钠默克生命科学S7653
三乙醇胺Millipore Sigma90279
Tris默克生命科学GE17-1321-01
TWEEN 20Millipore SigmaP9416
<强>仪器设备
层流罩首选模型
体视显微镜首选模型
倒置荧光显微镜尼康TE200
NIS-Elements 成像软件尼康
摇床培养箱首选模型
冷藏离心机首选模型
<强>其他
Corning 瓶顶式真空过滤系统，0.22 μm孔，500 mL瓶容量Millipore SigmaCLS430769
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-432-22

参考文献

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Fluo 4 AM

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