分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

摘要

本文介绍了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究抗体体内定位的实验方案。

摘要

单克隆抗体是一类高亲和力的多功能药物，可通过多种不依赖于可变区的机制清除癌细胞。在过去几十年中，抗体-药物偶联物、双特异性抗体、嵌合抗原受体（CAR）以及癌症免疫治疗领域已成为基础研究和治疗探索中最具前景的方向。随着针对免疫检查点受体以及在白血病和黑色素瘤中应用CAR-T细胞的多项人类临床试验取得突破性进展，源自抗体工程技术的各种肿瘤治疗手段正处于令人振奋的发展阶段。然而遗憾的是，在实体瘤的人体试验中，大量基于抗体和CAR的治疗方法效果不佳，主要原因在于肿瘤微环境中免疫效应细胞的可及性有限。此外，治疗性抗体在非肿瘤组织中的非特异性分布也导致了临床疗效不足、相关毒性反应以及临床试验失败。由于临床前研究向人体临床试验的可靠转化在很大程度上依赖于小鼠肿瘤异种移植模型的疗效与安全性评估，本文重点介绍一种用于检测治疗性抗体在肿瘤及正常组织中分布情况的方法。该方法通过使用近红外荧光染料标记经蛋白A纯化的抗体，随后对荷瘤小鼠进行活体成像来实现。

引言

美国食品药品监督管理局（FDA）于1986年批准了首个靶向CD3的单克隆抗体（OKT3，Muromonab）^1,2。自此之后的二十年间，由于抗体在免疫检查点抑制剂领域取得了巨大成功，抗体工程领域迅速蓬勃发展³。除了间接激活免疫系统外，抗体还被设计用于直接标记癌细胞，以精确招募免疫效应细胞，通过死亡受体激动剂触发细胞毒性，阻断肿瘤细胞存活信号通路，抑制血管生成（血管生长），调控免疫检查点调节因子，并作为偶联载体递送放射性同位素、化疗药物和siRNA²。此外，将不同抗体的单链可变区片段（scFv）表达于患者来源的T细胞和NK细胞表面（即CAR-T和CAR-NK）的研究，已成为细胞治疗领域临床探索的快速发展方向⁴。

基于抗体的药物具有超高的亲和力，可选择性地靶向表达抗原的肿瘤细胞，因而成为一种极具吸引力的治疗剂。同样，治疗性抗体（或化学药物）的靶向递送及在肿瘤中的滞留是实现疗效与毒性之间平衡的关键。因此，目前正利用大量基于蛋白质工程的策略（包括但不限于双特异性⁵和三特异性抗体⁶），以显著增强静脉注射（IV）治疗药物在肿瘤中的亲和力....

方案

所有涉及动物操作和肿瘤异种移植研究的实验程序均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准，并符合相关监管标准

1. 抗体的表达与纯化

1. CHO 细胞的维持
   1. 在补充了市售 1x 谷氨酰胺添加剂的 FreeStyle CHO 培养基中，于 37 ˚C、5% CO₂ 条件下，使用 Delong 锥形瓶（玻璃或一次性）以 130 rpm 振荡培养 CHO 细胞。
      注意：强烈建议使用带挡板和通气盖的锥形瓶，以增强搅拌并改善振荡过程中的气体交换。使用普通锥形瓶（无挡板）由于悬浮培养的搅拌受限，会导致抗体产量显著降低。
   2. 将细胞密度维持在 1–5 × 10⁶ 个细胞/mL，细胞活力 >95%。若细胞密度超过 5 × 10⁶ 个细胞/mL，则需传代稀释。切勿使 CHO 细胞密度降至 0.2 × 10⁶ 个细胞/mL 以下。
2. CHO 细胞的转染
   1. 在 200 mL 培养基（2 × 10⁶ 个细胞/mL）中，于 Delong 带挡板锥形瓶中培养 CHO 细胞。
      注意：在带挡板锥形瓶中培养的悬浮细胞，其蛋白产量始终高于在无挡板瓶中培养的细胞。
   2. 在 15 mL 离心管中，加入 5 mL CHO....

结果

在所述方法中，我们首先克隆了靶向叶酸受体α-1（FOLR1）的抗体farletuzumab，以及一种名为BaCa的双特异性抗体（由farletuzumab和lexatumumab组成），同时还包括abagovomab等对照抗体（序列见补充文件1）。DNA克隆中代表性重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的详细信息如图1A所示。为确认阳性克隆，我们采用信号肽前向引物（SP For）与CK Rev/CH3 Rev引物进行菌落PCR（引物序列见补充文件1）。菌落PCR的代表性结果证实了轻链和重链具有预期大小（图1C）。阳性抗体克隆还通过Sanger测序进一步验证。在确认完成pVH和pVL DNA克隆后，使用CHO悬浮培养系统进行转染，随后在4 °C条件下通过蛋白A亲和层析纯化抗体（详见图1B及实验方案中的具体步骤）。

纯化的farletuzum.......

讨论

选择性且肿瘤组织特异性的抗癌治疗药物递送是衡量靶向治疗疗效与安全性的关键¹³。本文介绍了一种快速且高效的方法，用于研究临床抗体farletuzumab及非临床抗体BaCa在组织和肿瘤中的详细分布情况。该方法适用于任何新开发的抗体，并可与具有理想特性的临床有效抗体并行使用，以评估其在肿瘤/器官中的分布特性。考虑到大多数抗体靶向的受体（如乳腺癌中的HER2）在肿瘤细胞（组织）中高度过表达，但在非肿瘤细胞类型的细胞中，其表达水平较低或功能异常同样具有重要意义¹⁴。例如，在结肠癌患者中，大量靶向EGFR的临床抗体会在皮肤组织中蓄积并引发毒性反应¹⁵，而皮肤是一种非癌组织，其生长与分化依赖于EGFR信号传导和功能。因此，我们坚信，将此类初步的组织分布研究与更大动物群体中的肝毒性及组织组织化学检测相结合，对于全面评估新开发抗体的安全性和治疗可行性至关重要。此外，若新开发的抗体对小鼠同源抗原/受体具有交叉反应性，则所述组织分布研究方法也可广泛应用于免疫功能健全小鼠的异种移植研究中。在同系动物研究中，除肿瘤分布.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FreeStyle CHO 培养基	Gibco Life Technologies	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 15240-062
防结块剂	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
BD 胰岛素注射器	BD BioSciences	Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum	PerkinElmer	Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 标记的抗人 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 35050-061
HiPure 质粒大提试剂盒	Invitrogen	Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe 柱	GE Healthcare	Cat # 11-0034-93
Infusion	Takara BioScience	STO344
IRDye 800CW NHS 酯	LI-COR	Cat # 929-70020
异氟烷，USP	Covetrus	Cat # 11695-6777-2
润滑性眼膏	Refresh Lacri-Lube	Cat #4089
Matrigel	Corning	Cat # 354234
PEI 转染试剂	Thermo Fisher	Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer 透析盒	Thermo Scientific	Cat # 66333
Steritop 真空滤器	Millipore Express	Cat #S2GPT02RE
胰蛋白酶-EDTA	Gibco Life Technologies	Cat # 15400-054
实验模型：细胞系
人：OVCAR-3	美国模式培养物集存库	ATCC HTB-161
人：CHO-K 细胞	本实验室稳定转染获得	ATCC CCL-61
小鼠：4T1	由弗吉尼亚大学 Dr. Chip Landen 惠赠
小鼠：MC38	由马里兰大学巴尔的摩县分校 Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg 惠赠	通过 STR 分型鉴定
小鼠：MC38 hFOLR1	本实验室构建（本文）
实验模型：动物
小鼠：裸鼠 Foxn1nu/Foxn1+	Envigo	多次订购
小鼠：NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	Jackson Laboratory	多次订购