靶性抗原特异性治疗抗体的肿瘤及组织分布分析

摘要

在这里，我们提出了一个方案，研究小鼠肿瘤异种移植模型中抗体的体内定位。

摘要

单克隆抗体是高亲和力多功能药物，通过可变的独立机制来消除癌细胞。在过去的几十年里，抗体药物结合剂、双特异性抗体、嵌合抗原受体（CAR）和癌症免疫治疗领域已成为基础和治疗研究最有希望的领域。随着无数成功的人体试验，以突破性的速度瞄准白血病和黑色素瘤中的免疫检查点受体和 CAR-T 细胞，对于抗体工程变异衍生的肿瘤治疗来说，这是非常激动人心的时刻。令人遗憾的是，由于肿瘤床中免疫效应细胞有限，大量抗体和基于 CAR 的治疗方法在实体癌症的人体试验中也被证明是令人失望的。重要的是，肿瘤以外的组织内治疗抗体的非特异性分布也导致缺乏临床疗效、相关毒性和临床失败。由于临床前研究忠实地转化为人类临床轨迹，高度依赖于小鼠肿瘤异种移植功效和安全研究，在这里我们重点介绍一种测试肿瘤和治疗抗体一般组织分布的方法。这是通过标记蛋白-A纯化抗体与近红外荧光染料，然后对肿瘤轴承小鼠进行活成像。

引言

FDA于1986年批准了第一个单克隆抗体靶向CD3（OKT3，Muromonab），1，2。此后的二十年里，由于抗体对免疫检查点抑制剂3的压倒性成功，抗体工程领域迅速^爆炸。除了间接激活免疫系统外，抗体还旨在直接标记癌细胞，以精确接触免疫效应细胞，通过死亡受体激动剂触发细胞毒性，阻断肿瘤细胞生存信号，阻断血管生成（血管生长），约束免疫检查点调节器，提供放射性同位素，化疗药物和siRNA作为结合剂^2。此外，研究患者衍生T细胞和NK细胞（CAR-T和K-NK）表面各种抗体的单链可变片段（scFv）是细胞疗法4的临床研究快速增长的^领域。

抗体药物的超高亲和力，提供选择性抗原表达肿瘤细胞，使它成为一个有吸引力的剂。同样，靶向分娩和肿瘤保留治疗抗体（或化学药物）是平衡疗效与毒性的关键。因此，大量的蛋白质工程为基础的策略，包括但不限于双特异性⁵和三特异性抗体⁶正在被利用，以显著增强狂热的优化肿瘤保留静脉注射（IV）注射治疗^5，7。在这里，我们描述了一个简单的荧光为基础的方法来解决肿瘤和组织分布的潜在有效的抗癌抗体。

由于动物组织在可见光谱中兴奋时具有自动荧光，因此抗体最初被标记为近红外染料（例如，IRDye 800CW）。对于概念调查的证据，我们利用叶酸受体α-1（FOLR1）靶向抗体称为法莱图祖马布及其衍生物称为双特异性锚细胞活性剂^（BaCa）7抗体，共同靶对FOLR1和死亡受体^-5（DR5）8在一个重组抗体。FOLR1是卵巢和TNBC癌细胞、肿瘤异种移植和患者肿瘤9中明确定义的过度表达靶^向受体。值得注意的是，有多个努力，临床利用基于抗体的方法利用FOLR1，使免疫效应细胞和抗体药物结合（ADC）用于卵巢癌和乳腺癌10，11。

在本文论文中，我们使用CHO表达系统克隆、表达和纯化临床抗FOLR1（farletuzumab）以及其他对照抗体。IgG1等型和临床抗白痴粘液-16抗体称为阿巴戈沃马布¹² 被用作阴性对等对。在蛋白质-A纯化后，指示抗体被标记为IRDye 800CW，并施用到裸鼠的尾静脉中，要么携带卵巢肿瘤异种移植物，要么稳定地转染人类FOLR1，表达穆林结肠癌异种移植。抗体定位通过实时成像跟踪，在多个不同时间点7使用体内成像^谱。这种方法不需要任何基因改造或注射基板，使光发射，并明显更快，成本效益和高效。如果有重链和轻链序列，下面描述的一般克隆、表达、纯化和标记协议可应用于任何临床和非临床抗体。

方案

弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准了所有涉及动物处理和肿瘤异种移植研究的程序，并符合相关监管标准

1. 抗体的表达和纯化

1. CHO细胞的维护
   1. 在 FreeStyle CHO Media 中生长 CHO 细胞，在 37 °C 时以 130 rpm 摇动时补充市售 1x 谷氨酰胺补充剂，使用 delong Erlenmeyer 烧瓶或一次性玻璃或一次性玻璃，使用 5% CO_2。
      注:强烈建议使用带通风盖的挡板烧瓶，以增加搅拌，并改善在摇晃过程中气体输送。由于悬浮培养的搅拌有限，常规烧瓶（非困惑）的抗体产量显著降低。
   2. 保持细胞数在1-5 x 10^6细胞 /mL之间，具有>95%的细胞生存能力。如果单元格数增加超过 5 x 10⁶ 个单元格/mL，则拆分单元格。绝不允许CHO细胞达到0.2 x 10^6细胞 /mL以下。
2. CHO细胞的转染
   1. 在德隆 Erlenmeyer 困惑烧瓶中生长 200 mL 介质^（2 x 10 6 细胞/mL） 中的 CHO 细胞。
      注:在困惑的烧瓶中生长的悬浮培养物总是产生更高的蛋白质产量，而当生长在非困惑的烧瓶中时。
   2. 在15 mL管中，服用5 mL的CHO FreeStyle介质，加入50μg的VH克隆DNA和75μg的VL克隆DNA。漩涡混合良好。
   3. 在室温下孵育DNA混合物5分钟。
      注:更长的孵育会降低蛋白质的产生。
   4. 将750μL的1mg/mL聚乙烯胺（PEI）储存添加到DNA溶液中，并积极涡旋混合物30 s。在室温下孵育5分钟。
      注:爱德华王子岛必须新鲜。PEI 的多个冷冻解冻周期显著降低了整体产量。
   5. 在细胞上加入DNA和PEI的整个混合物，同时手动摇动烧瓶。立即孵育德龙 Erlenmeyer 困惑的烧瓶与细胞在 37 °C 摇动在 130 rpm.
3. 表达
   注:抗体具有分泌信号肽设计到其N端端，这有助于抗体分泌到介质中。
   1. 在37°C下生长转染细胞，第1天以130转/时摇晃。
   2. 第2天，加入2 mL的100倍抗皱剂和2mL的100倍抗菌抗真菌溶液。将烧瓶移至较低温度（32-34 °C），以 130 rpm 转速摇动。
   3. 每五天， 加入 10 mL 的 Trypton N1 饲料， 和 2 mL 的 100 倍谷氨酰胺补充剂.
   4. 在用锥蓝染色的细胞分色后，每三天使用血细胞计继续计数细胞。确保细胞生存能力保持80%以上。
   5. 第10天或第11天，收获抗体纯化的介质。在 3000 x g、4°C 旋转培养基 40-60 分钟，然后使用 0.22 μM 瓶过滤器过滤透明介质。
4. 净化
   注:抗体纯化使用市售的蛋白质-A列（见 材料表），使用近性泵。
   1. 用两列结合缓冲液（pH 7.4 时磷酸钠 20 mM 磷酸钠）平衡柱。
   2. 以1 mL/min 的流速通过柱，通过含有抗体的过滤介质（在步骤1.3.5中获得）。
   3. 用两列的绑定缓冲区卷清洗列。
   4. 使用 5 mL 洗脱缓冲液（pH 3.4 下 30 mM 醋酸钠）将抗体转化为 500 μL 馏分。
   5. 通过每馏分加入10μL中和缓冲液（pH9中的3M醋酸钠）来中和洗型抗体的pH值。
      注:分数数3-6包含大部分抗体。建议保留所有分数，以防抗体在比预期后分馏。
   6. 使用分光光度计使用分光光度计测量纯化抗体的浓度，选择IgG的默认方案。通过考虑分子量和吸收系数，在mg/mL中获得抗体的最终浓度。

2. 荧光标签

注:抗体与含有NHS酯反应组的红外染料标记，该染料与蛋白质结合并形成稳定的结合物。这种反应对pH敏感，在pH 8.5下效果最佳。与染料一起标记的荧光偶联物显示最大吸收量为 774 nm，发射最大为 789 nm。pH 8.5 是有效结合的关键。

1. 使用透析盒（0.1-0.5 mL）在1L的结合缓冲液（pH 8.5下为50 mM磷酸盐缓冲液）中透析0.5 mL的抗体。4小时后将透析盒转移到新鲜缓冲液和透析过夜。
2. 在500μL的反应量中加入0.03毫克的IRDye 800CW 800CW，从而建立结合反应。
   注:IRDye 800CW 以10mg/mL的浓度溶解在DMSO中。
3. 在20°C下进行2小时贴标反应。
   注:增加超过 2 小时的时间不会改善标签。
4. 通过对 1x PBS 进行广泛透析来净化标记的偶联体。
5. 通过测量染料在780纳米的吸收度和280nm时蛋白质的吸收度来估计标记的程度。染料对 280 nm 信号的贡献为 3%。
6. 使用此公式计算染料/蛋白质比:
   
   其中0.03是280纳米（等于780纳米时其吸收率的3.0%）的染料的吸收系数，ε染料和ε_蛋白分别是染料和蛋白质（抗体）的摩尔消光系数。
   注:ε染料是270，000米^-1厘米^-1和ε_蛋白质是203，000米^{-1厘米-1（}对于典型的IgG）在PBS的1:1混合物:甲醇。IgG 以外的蛋白质可能非常不同的摩尔灭绝系数。对感兴趣的蛋白质使用正确的消光系数是准确确定D/P比至关重要。
7. 使用此公式计算最终蛋白质浓度:
   
   注:在进行体内研究之前，始终使用ELISA（酶链接免疫吸附测定）或流式细胞学确认标记和未标记抗体的抗原结合功效。

3. 小鼠异种移植研究

1. 肿瘤细胞的注射制备
   1. 在RPMI-1640中位生长OVCAR-3细胞，辅以10%的FBS和1x青霉素链霉素。
   2. 注射前一天，亚培养细胞进入新的100毫米培养皿与10 mL的完整中/菜。使用 0.5-1 x 10^{6 个单元格} /菜的细胞号。
   3. 在 37 °C 温度、95% 湿度和 5% CO 2 下孵育_培养物 ，20-24 小时。
   4. 注射当天，从培养皿中去除生长介质。用Ca²⁺/Mg²⁺ 免费Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）彻底冲洗细胞层，以去除死细胞、细胞碎片和所有血清痕迹，这些痕迹可能会干扰尝试蛋白素作用。
   5. 通过向每道菜添加 1.0-1.5 mL 的 Trypsin-EDTA 溶液来尝试细胞，并尝试通过将菜体倾斜到周围，然后在 37°C 下孵育 5-10 分钟，从而传播溶液。
      注:观察倒置显微镜下的细胞，检查实际的三辛化状态。在三辛化下，细胞从培养皿表面分离的数量较低，过度三分素化会诱发细胞应激。因此，适当的尝试性很重要。
   6. 向每道菜添加1.0-1.5 mL的完整生长介质，以停止尝试性作用，之后通过轻轻移液重新悬浮细胞。
      注:温和移液对保持细胞健康很重要。
   7. 将电池悬浮液收集到 15 mL 锥形管中，在室温下以 250 x g 旋转 5 分钟。
   8. 去除上经剂后收集细胞颗粒，并在1x DPBS中重新悬浮颗粒，清洗细胞。
   9. 以低速旋转电池悬架 250 x g 5 分钟。
   10. 加入500μL的DPBS，通过温和移液重新悬浮细胞，获得单细胞悬浮。
   11. 使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。
       注:为了更好的精度，重复计数三次，并采取平均值。
   12. 以这样的方式调整体积，使最终细胞密度为1 x 10^{8 8} 细胞/mL。
2. 皮下注射细胞，发展小鼠异种移植
   注:所有程序应在 BSL2 安全柜中完成。在目前的研究中，^已经使用了全裸狐1nn/Foxn1+小鼠。
   1. 将50μL的细胞悬浮液放入1.5 mL管中，与50μL的基膜基质介质混合。
      注:基底膜基质介质在室温下容易形成凝胶状状态，因此在冰上小心地维护细胞和基质介质混合物。建议将管子、尖端和注射器放在冰箱里，然后在动物注射前转移到冰上。
   2. 搅拌混合物，以避免任何细胞组。然后，将含有5×10⁶ 细胞的100μL细胞悬浮基基中混合物放入1 cc注射器中。
   3. 轻轻抬起动物的皮肤，将皮肤与底层肌肉层分离，用26G针在皮肤（5 x 10^6细胞 ）下缓慢注射细胞悬浮液（100μL）。等待几秒钟，然后拿出针头，使地下室基质介质可以形成半固体凝胶状结构以及皮肤下的细胞，防止混合物从注射部位出来。
      注:细胞需要在注射前进行测试，以检测是否有可能损害免疫缺陷小鼠的污染。虽然注射不要把针头太深到皮肤，因为这可能形成肿瘤比预期的更深。
   4. 将动物关在无菌笼子里，观察约20分钟。
   5. 观察小鼠2-3周，让肿瘤长至500 mm³ 大小。

4. 使用体内成像系统进行抗体定位

注:本实验中使用的体内成像 设备（见材料表）使用一套高效过滤器和光谱非混合算法，实时对生物体内的细胞和遗传活动进行非侵入性可视化和跟踪。系统提供荧光和生物发光监测功能。

1. 通过尾静脉注射25μg的染料标记抗体。
   1. 使用 2% 异氟的肿瘤轴承小鼠麻醉。检查是否对踏板反射没有反应。
   2. 一旦老鼠停止移动，通过应用蠕虫水扩张横向尾静脉。
   3. 使用 1 cc 胰岛素注射器用 26 G 针头注射 25 μg（100 μL）标记抗体。
   4. 同样，作为负对照，标记和注射非特异性IgG1等型抗体，它不针对癌细胞。
2. 在8、24、48小时等抗体注射后进行体内活体成像。
   1. 在相关软件中， 单击位于 控制面板中的初始化，确认阶段温度为 37 °C。
   2. 打开氧气供应，麻醉系统上所有的泵，将异氟气体供应到麻醉室，将异氟蒸发器阀设置为2%。
   3. 将小鼠转移到麻醉室，等待小鼠完全麻醉。涂抹眼睛润滑软膏，避免眼睛干燥。
   4. 转到" 控制"面板，通过"成像向导 "选项设置荧光成像 ，并选择 773 nm 的激发和 792 nm 的发射。
      注:默认的自动曝光设置提供了良好的荧光图像。但是，可以根据需要修改自动曝光首选项。
   5. 将麻醉小鼠转移到成像室，并使用鼻锥将其组装在成像场上。成像阶段提供一次容纳 5 只鼠标的选项。
      注:在分析时，让对照小鼠与测试小鼠一起进行成像，以进行类似的曝光量和其他设置。
   6. 一切就绪后，选择 图像 采集控制面板上的"获取"选项。
   7. 使用自动曝光设置，系统会在一分钟内生成图像。生成的图像是荧光覆盖在摄影图像上，以计数单位或光子单位或效率显示光学荧光强度。
   8. 获得图像后，将小鼠从成像室转移回其笼中，观察其恢复1至2分钟。
3. 使用软件中为图像分析提供的工具和功能进一步微调图像。图像分析工具在菜单栏和工具调色板中。
   1. 在 "图像调整"下，调整亮度、对比度或不透明度并选择色度。
   2. 使用 ROI 工具 在光学图像中指定感兴趣区域 （ROI），并测量 ROI 中的信号强度。如果需要，将量化信号数据导出到电子表格软件并绘制数据。
   3. 对于后续研究，分析小鼠各种组织（如肝、肺、心脏、肾脏、脾脏、大脑等）的尸检，以了解荧光标记抗体的详细非特异性分布。
      注:在96和测定中，通过使用抗原（本例中的FOLR1），数据可以进一步支持组织特定的ELISA。

结果

在所述方法中，首先我们克隆了针对叶酸受体α-1（FOLR1）的抗体，称为法莱图祖马布和lexatumumab的双特异性抗体，以及控制抗体，如阿巴戈沃马布（ 补充文件1中提供的序列）。图1A中显示了DNA克隆（pVH、pVL）中代表性变量重（VH）和可变光（VL） 域的详细信息。为了确认阳性克隆，我们使用信号肽向前（SP For）和CK Rev/CH3 Rev底转（补充文件1中提供的序列）进行了 聚落PCR。殖民地PCR的代表性结果证实了轻链和重链的预期尺寸（图1C）。阳性抗体克隆也通过桑格测序得到确认。在确认的pVH和pVL DNA克隆之后，使用CHO悬浮培养物进行转染，随后在4°C下对抗体进行蛋白质-A柱亲和力纯化（ 参见图1B 和详细步骤协议）。

纯化的 farletuzumab 和其他对照 IgG1（除 BaCa 抗体在非还原和减少...

讨论

选择性和肿瘤组织特异性传递抗癌治疗剂是衡量特定靶向治疗疗效和安全性^的关键。在这里，我们描述了一个快速和有效的方法，以调查临床，farletuzumab和非临床BaCa抗体的详细组织和肿瘤分布。所述方法适用于任何新生成的抗体，可与临床有效抗体（具有所需质量）一起用于其肿瘤/器官分布特性。考虑到大多数抗体靶点受体（如乳腺癌中的 HER2）在肿瘤细胞（组织）中表达过度，在大多数情况下，它们的次优表达和功能在肿瘤细胞¹⁴以外的细胞类型中也至关重要。例如，在结肠癌患者中，相当一部分针对临床抗体的EGFR积累并引起^{皮肤组织15的毒性，皮肤组织是}一种非癌组织，其生长和分化需要EGFR信号和功能。因此，我们坚信，这些初步组织分布调查与肝毒性和组织组织化学测定结合在更大的动物群是全面评估安全性和治疗可行性的关键新生成的抗体。此外，所述组织分布研究也将高度适用于免疫能力小鼠异种移植研究，如果新生成的抗体保持交叉反应的穆林对应抗原/受体。在合成动物研究中，随着肿瘤分布和组织组织化学研究，详细的血细胞因子分析可用于加强...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FreeStyle CHO 培养基	Gibco Life Technologies	货号 # 12651-014
抗癌 （100X）	Gibco Life Technologies	货号 # 15240-062
抗结块剂	Gibco Life Technologies	货号 # 01-0057DG
BD 胰岛素注射器	BD BioSciences	货号 #329420
卡尺 IVIS 光谱	PerkinElmer	货号#124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	货号 #A10240-01
康宁 500 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	康宁	货号 # 10-13-CV
康宁 500 mL RPMI 1640	康宁	货号 # 10-040-CV
Cy5 偶联的抗人 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch	货号 # 709-175-149
GlutaMax-I （100X）	Gibco Life Technologies	货号 # 35050-061
HiPure 质粒大提试剂盒	Invitrogen	货号 # K21007HiTrap
MabSelect SuRe 色谱柱	GE Healthcare	货号 # 11-0034-93
输液	Takara BioScience	STO344
IRDye 800CW NHS 酯	LI-COR	货号 # 929-70020
异氟醚，USP	Covetrus	货号 # 11695-6777-2
润滑剂眼膏	刷新 Lacri-Lube	货号 #4089
Matrigel	Corning	货号 # 354234
PEI 转染试剂	Thermo Fisher	货号 # BMS1003A
Slide-A-Lyzer 透析盒	Thermo Scientific	货号 # 66333
Steritop 真空过滤器	Millipore Express	猫 #S2GPT02RE
胰蛋白酶-EDTA	Gibco Life Technologies	货号 # 15400-054
实验模型：细胞系
人：OVCAR-3	美国型培养物保藏中心	ATCC HTB-161
人：CHO-K 细胞	稳定在我们的实验室转化	ATCC CCL-61
来自 UVA			4T1
小鼠：MC38	来自 UMBC 的 Suzanne Ostrand-Rosenberg 博士的善意礼物	通过 STR 分析
小鼠：MC38 hFOLR1	在我们实验室生成（本文）
实验模型：动物
小鼠：无胸腺裸体 Foxn1nu/Foxn1+	Envigo	多目小鼠
：NOD.Cg Prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ	Jackson 实验室	多目