用于猪缺血性心脏病模型中3D打印冠状动脉狭窄植入物经皮植入的新方法

摘要

我们介绍一种新颖、经济高效且简便的经皮输送三维打印冠状动脉植入物的技术，用于构建闭胸猪缺血性心脏病模型。该技术采用母子延长导管固定植入物，成功率高。

摘要

在大型动物中建立局灶性冠状动脉狭窄模型的微创方法具有挑战性。可通过使用三维（3D）打印冠状动脉植入物进行快速成型，经皮创建局灶性冠状动脉狭窄。然而，在缺乏辅助设备的情况下，可靠地输送这些植入物可能较为困难。本文描述了一种采用母-子冠状动脉导引导管的方法，用于稳定植入物，并有效将3D打印的植入物输送至冠状动脉任意目标位置。通过冠状动脉电影造影确认局灶性冠状动脉狭窄，同时采用钆增强的一次通过心肌灌注磁共振成像（MRI）评估冠状动脉狭窄的功能学意义。我们证明，在缺血性心脏病的猪模型（n = 11）中，通过改造母-子冠状动脉导引导管可实现3D打印冠状动脉植入物的可靠输送。该技术简化了经皮输送冠状动脉植入物的过程，可用于建立非开胸猪局灶性冠状动脉狭窄模型，操作迅速且手术失败率低。

引言

缺血性心脏病仍然是美国首要的死亡原因¹。大型动物模型已被用于实验研究，以理解并表征冠状动脉疾病（CAD）及其相关并发症（包括心肌梗死、心律失常事件和心力衰竭）的发病机制，同时也用于测试新的治疗方法或诊断技术。这些研究的结果有助于加深对缺血性心脏病的理解、诊断与监测，并推动临床实践的进步²。已有多种动物模型被使用，包括兔、犬和猪。然而，这些动物极少自然发生冠状动脉狭窄，尤其是局限性病变，且难以稳定地诱导产生³。以往的研究曾描述通过结扎、阻塞装置或外部夹钳来建立人工冠状动脉狭窄的方法。最近，我们报道了如何利用3D打印技术制造冠状动脉植入物，以经皮方式创建局限性的人工冠状动脉狭窄⁴。我们使用计算机辅助设计软件，设计出具有不同内径、外径以及长度的中空管状冠状动脉植入物，并采用市售的增材制造材料进行加工。这些植入物为表面光滑、边缘圆润的中空3D打印管状结构。我们设计了一套包含多种尺寸的植入物库，涵盖不同的内径、外径和长度。植入物的外径依据冠状动脉指引导管的尺寸而定，内径则依据未扩张冠状动脉成形术球囊的尺寸确定。通过调整植入物的长度，可定制所需的灌注受限程度。然而，由于缺乏专为大型动物设计制造的导丝和导管，此类装置的安全经皮递送仍具挑战性。相比之下，临床上用于人类冠状动脉的导管、导丝及辅助设备则种类齐全。在本研究中，我们展示了如何将临床级“母子”冠状动脉指引导管重新用于递送3D打印的冠状动脉植入物。

GuideLiner 导管（图1A）最初为经皮冠状动脉介入治疗（PCI）而设计，可用于实现导管的深部嵌入，并为复杂病例提供更强的支撑力⁵。在本研究中，选择 GuideLiner 导管是基于操作者的使用经验及其可获得性，但在条件允许的情况下，其他类似的导管也可考虑使用。该装置被视为一种"母-子"导管系统（图1B），可插入标准冠状动脉指引导管（"母体"）内部，是一种同轴的柔性管状结构（"子体"）。该导管可通过导丝送入，有效延长标准冠状动脉指引导管的到达范围，使其能够延伸至指引导管末端之外。GuideLiner 或其他类似的母-子导管系统可在植入 3D 打印冠状动脉植入物时提供额外的支撑。由于植入物需安装在血管成形术球囊上，并作为一个整体沿冠状动脉导丝送入血管内（图1B,1C），使用该导管有助于将植入物更稳定地输送至目标位置。通过将母-子导管定位在球囊近端附近，可在球囊放气和回撤过程中使植入物保持在预定位置。尽管该母-子导管结构具有一定刚性，但其能够沿导丝深入冠状动脉的特性，以及导管尖端的不透射线标记，均为成功植入的关键特征。

我们组装的输送装置由一根标准的冠状动脉导引导管、子母导管以及固定在未充气冠状动脉球囊扩张导管上的3D打印植入物组成（图1B）。作为功能性输送单元，子母导管不仅为设备输送提供了稳定的额外支撑，还被独特地用作剪切装置，以在球囊放气和撤出过程中保持植入物的位置。导管尖端的不透射线标记物作为组装装置的定位引导，位于球囊扩张导管的近端。这些特性使得血流限制性植入物能够精确部署。该过程设计为可重复、高效，并尽可能减少对实验动物的伤害。

在本研究中，采用母-子经皮介入技术建立具有局限性冠状动脉狭窄的猪模型，用于评估对比增强应激性心肌灌注磁共振成像（MRI）。然而，该技术也可应用于其他研究，包括冠状动脉以外的血管系统。

方案

我们根据《动物福利法》、美国国立卫生研究院以及美国心脏协会关于实验动物使用的指南开展实验。本机构动物护理和使用委员会已批准该动物实验方案。

1. 3D打印冠状动脉狭窄植入物的术前准备

1. 使用镊子将打印的植入物浸入25%肝素溶液中进行浸涂，以防止血栓形成，并在空气中干燥24小时。

2. 动物实验对象的术前准备

1. 实验前1周将约克夏猪（SNS Farms，30–45 kg）运抵机构，并使其适应环境。
2. 手术前一天午夜后使猪进入禁食状态。

3. 操作麻醉

1. 使用肌肉注射氯胺酮（10 mg/kg）和静脉注射咪达唑仑（1 mg/kg）对猪进行镇静。
2. 用氧气-异氟烷（1–2%）混合气体对动物进行通气。
3. 动物镇静后，实施气管插管。
4. 持续静脉输注罗库溴铵（2.5 mg/kg/h），并在需要时追加静脉推注剂量（1–3 mg/kg，每20–30分钟一次），以实现膈肌固定。
5. 在整个实验过程中，通过监测觉醒、运动、生命体征剧烈波动及其他痛苦或不适迹象，维持适当的外科麻醉深度。本研究中，猪在麻醉状态下监测约6小时。

4. 血管通路

1. 采用塞耳丁格技术，将动脉鞘和静脉鞘分别插入受试者的双侧股动脉和股静脉。
2. 持续用肝素化生理盐水冲洗所有导管端口。

5. 术前用药管理

1. 根据需要，为预防心律失常，肌肉注射胺碘酮（1.5 mg/kg），静脉注射利多卡因（2 mg/kg）和艾司洛尔（1 mg/kg）。在实验过程中，根据需要重复给予胺碘酮、利多卡因和艾司洛尔，以抑制心室节律并控制心率反应。
2. 建立血管通路后，给予肝素（5,000–10,000 单位），使活化凝血时间（ACT）>300 秒。实验期间每小时检测一次ACT，并根据需要追加静脉注射肝素，以维持ACT目标值。

6. 血流动力学监测

1. 在整个实验期间，使用单个侧胸导联心电图（ECG）记录ST段、T波及心率的变化。
2. 使用压力传感器持续记录股动脉压力。
3. 将脉搏血氧仪连接至动物的耳部或唇部，以进行连续的脉搏血氧饱和度监测。

7. 植入物输送设备的准备

1. 进行冠状动脉造影前，将一个未充气的NC Trek经导丝冠状动脉球囊通过所需尺寸的双腔导管插入，使球囊尖端伸出导管尖端之外。
2. 将3D打印的植入物安装到未充气的血管成形球囊上，使植入物位于球囊的标记之间，并靠近近端标记（图1B）。
3. 使用注气装置将球囊充气至2–3 atm，以固定植入物在球囊上的位置。确认植入物位于球囊近端半侧，以便在准备取出时最接近双腔导管（图1B）。

8. 冠状动脉造影及冠状动脉植入物置入

1. 将X线透视C型臂置于前后位（AP）投照位置。
2. 将控制阀（见材料表）连接至左或右冠状动脉指引导管（见材料表）。
3. 通过右股动脉鞘，在J形导丝引导下插入指引导管，并在X线透视引导下将导管推进至主动脉根部。
4. 选择性（或非选择性）地将导管嵌入左主干冠状动脉（LMCA），并在X线透视下注入5 mL碘造影剂，以显示左冠状动脉系统。
5. 将指引导管对准左主干冠状动脉（LMCA）进行第二次血管造影（图2）。若因猪的主动脉弓较短导致冠状动脉嵌入困难，可考虑进行非选择性血管造影，只要其能充分显示血管结构即可。
6. 在X线透视下，当导管已进入或靠近左主干冠状动脉（LMCA）时，沿导丝送入一根0.014"、300 cm的冠状动脉导丝（见材料表），并进一步将导丝推送至远端前降支（LAD）或左回旋支（LCX），视需要而定（图3）。
7. 在X线透视引导下，将预先组装好的“母-子”导管系统连同已充盈的冠状动脉球囊成形术球囊，沿冠状动脉导丝送入，并推进至冠状动脉目标位置。注入5 mL碘造影剂以显示目标位置处的局限性狭窄，以便部署冠状动脉植入物（图4）。
8. 当植入物到达预定位置后，继续推进“母-子”导管至充盈球囊的近端标记处。
9. 放空球囊，并通过“母-子”导管将其回撤。此过程可在回撤过程中利用“母-子”导管将植入物从球囊上剪切分离，从而将植入物固定于血管的指定节段。
10. 移除球囊、“母-子”导管和冠状动脉导丝。
11. 进行最终血管造影，以记录血管内新形成的人工狭窄位置。如条件允许，应采用两个正交投照体位进行血管造影，以视觉评估狭窄的严重程度。也可将“母-子”导管选择性置于血管近端进行最终血管造影（图5），该方法可在使用最少造影剂的情况下实现良好的血管显影。
12. 立即转移动物至磁共振检查室，使用钆布醇（0.1 mM/kg）以2 mL/sec的速度注射，进行心脏负荷灌注MRI检查。
    注：所用负荷药物为腺苷，以300 µg/kg/min的剂量持续输注4分钟。成像方案包括：1）电影成像（视野[FOV] = 292 x 360 mm，矩阵大小 = 102 x 126，重复时间[TR] = 5.22 ms，回波时间[TE] = 2.48 ms，层厚 = 6 mm，像素带宽 = 450 Hz，翻转角 = 12˚）；2）静息状态及腺苷最大血管扩张负荷状态下的首次通过灌注成像，采用扰相梯度回波序列（FOV = 320 x 320 mm，矩阵大小 = 130 x 130，TR = 2.5 ms，TE = 1.1 ms，层厚 = 10 mm，像素带宽 = 650 Hz，翻转角 = 12˚）；以及3）采用心电门控、分段、扰相梯度回波相位敏感反转恢复序列进行延迟钆增强成像（FOV = 225 x 340 mm，矩阵大小 = 131 x 175 mm，TR = 5.2 ms，TE = 1.96 ms，层厚 = 8 mm，反转时间[TI] = 根据心肌信号抑制优化设定，像素带宽 = 465 Hz，翻转角 = 20˚）。典型的首次通过灌注图像见图6。
13. MRI检查完成后，通过输注戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死猪。
14. 行侧胸切开术，切除心脏，并解剖离体心脏以暴露冠状动脉。观察植入物相对于对角支（前降支区域）或钝缘支（左回旋支区域）的位置，并取出植入物。
15. 使用钝头弯剪刀（Metzenbaum剪刀）切开冠状动脉，肉眼检查血管是否有明显损伤（见图7）。拍摄心脏组织照片用于大体病理学分析，并用氯化三苯基四氮唑染色以排除心肌梗死（见图8）。

结果

在对操作流程进行初步优化后，干预步骤均在30分钟内完成。所有11名受试者（100%）均成功植入装置。在全部11名受试者（100%）的尸检中均成功回收了植入物。利用沿前降支（LAD）的对角支或沿左回旋支（LCX）的钝缘支作为定位标志，我们发现，在11名受试者中有10名（91%）的植入物在荧光透视引导下的部署位置与尸检时的位置一致。在一名受试者中，植入物出现轻微远端移位，可能与为缓解冠状动脉痉挛而注射冠状内硝酸甘油所引起的血管扩张有关。在研究的11名受试者中，有9名完成了整个导管检查并完成了MRI检查方案，因此操作成功率为82%。两名受试者在植入物部署后死亡。第一名受试者在植入物部署完成后较长时间，在MRI检查室内发生心室颤动。第二名受试者在实验进行至中途时因低血压而在MRI扫描仪内死亡。在解剖时，我们未在植入物内部发现血栓，也未见血管结构损伤的其他迹象。较高的生存率（2例死亡，9例存活）凸显了有效抗心律失常预防方案的重要性。图6展示了心肌应激灌注MRI的一个典型示例。植入物的详细设计及MRI验证的完整结果将另行报道。

讨论

本研究聚焦于一种用于诱导冠状动脉狭窄的植入物经皮部署新策略，并证明母子导管可被重新用于有效经皮递送3D打印的冠状动脉植入物。利用标准的人类经皮冠状动脉介入技术和设备，可在猪模型中以微创方式快速建立不同严重程度的离散性人工冠状动脉狭窄，且成功率高。这些植入物在急性期显示安全，并能有效产生严重的血管造影狭窄，且与血管扩张剂应激心脏磁共振成像期间出现的应激诱导灌注缺损相一致。与开胸手术技术相比，经皮递送诱导狭窄的植入物更具微创性且更符合动物伦理。

目前已有多种其他微创技术可用于在大型动物模型中实现血流减少。3D打印的冠状动脉植入物与球囊闭塞和弹簧圈闭塞在根本上有所不同，因为3D打印植入物所诱导的狭窄并不会完全阻塞血管。这一重要差异使得可以模拟应激诱发的心肌缺血，而非心肌梗死^7,8。Rissanen等人⁹描述了一种经皮技术，通过使用包裹聚四氟乙烯管的冠状动脉支架，在猪模型中制造出限制血流但非完全阻塞性的狭窄。该管材可通过针具和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D打印冠状动脉植入物	研究机构自制
静脉用胺碘酮溶液	研究机构药房
Amplatz Left-2（AL-2）指引导管（8F）	Boston Scientific，马萨诸塞州马尔伯勒，美国
Balance Middleweight 冠状动脉导丝（0.014” 300cm）	Abbott Laboratories，伊利诺伊州艾伯特公园，美国
COPILOT 回血控制阀	Abbott Laboratories，伊利诺伊州艾伯特公园，美国
静脉用艾司洛尔溶液（1 mg/kg）	研究机构药房
Formlabs Form 2 3D打印机，最小XY特征尺寸为150 µm	Formlabs Inc.，马萨诸塞州萨默维尔，美国
Formlabs 灰色树脂（植入物材料）	Formlabs Inc.，马萨诸塞州萨默维尔，美国
钆布醇 0.1 mmol/kg	Gadvist，拜耳制药，新泽西州韦恩，美国
GuideLiner 导管（6F）	Vascular Solutions Inc.，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国
肝素静脉溶液	Surface Solutions Laboratories Inc.，马萨诸塞州卡尔弗特，美国
肌肉注射用氯胺酮溶液（10 mg/kg）	研究机构药房
利多卡因静脉溶液	研究机构药房
雄性约克夏猪（30–45 kg）	SNS Farms
咪达唑仑静脉溶液	研究机构药房
NC Trek 球囊导管（over-the-wire型冠状动脉球囊）	Abbott Laboratories，伊利诺伊州艾伯特公园，美国
氧气-异氟烷吸入混合气体（1–2%）	研究机构药房
罗库溴铵静脉溶液	研究机构药房
戊巴比妥钠静脉溶液（100 mg/kg）	研究机构药房
氯化三苯基四氮唑染色剂	机构病理科实验室