基于FLAG-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-RNA相互作用分析

摘要

本文介绍了一种改良的CLIP-seq方案，称为^FbioCLIP-seq，通过FLAG-生物素串联纯化技术来确定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶标。

摘要

RNA 和 RNA 结合蛋白（RBPs）调控多种生物学过程。RNA 与 RBPs 的时空分布是这些过程精细调控的基础。一种称为 CLIP-seq（交联与免疫沉淀）的策略已被开发用于捕获内源性蛋白-RNA 相互作用，其过程包括紫外交联后进行免疫沉淀。尽管传统的 CLIP-seq 方法在 RBP 研究中被广泛应用，但该方法受限于高质量抗体的可获得性、共纯化 RBP 可能带来的污染、对同位素操作的需求，以及在繁琐的实验流程中可能造成的信息丢失。本文介绍了一种改良的 CLIP-seq 方法，称为 ^FbioCLIP-seq，该方法采用 FLAG-生物素标签串联纯化技术。通过串联纯化和严格的洗涤条件，几乎所有的相互作用 RNA 结合蛋白均被去除，因此由这些共纯化 RBP 间接介导的 RNA 相互作用也被显著减少。^FbioCLIP-seq 方法能够在无需同位素标记、无需蛋白特异性抗体、且不经过 SDS-PAGE 和膜转移步骤的情况下，高效检测直接与蛋白结合的 RNA。

引言

RNA 和 RNA 结合蛋白（RBPs）调控多种细胞过程，包括剪接、翻译、核糖体生物合成、表观遗传调控以及细胞命运转变^1,2,3,4,5,6。这些过程的精细机制依赖于 RNA 和 RBPs 在空间和时间上的特异性分布。因此，要从分子水平上理解 RNA 的调控机制，一个重要步骤是揭示 RBPs 结合位点的位置信息。

一种称为交联免疫沉淀测序（CLIP-seq）的策略已被开发出来，用于捕捉蛋白质-RNA相互作用，其过程包括使用紫外交联，随后对目标蛋白质进行免疫沉淀⁷该方法的关键特征是通过紫外照射在RNA结合蛋白与其直接结合的RNA分子（约1 Å范围内）之间诱导形成共价交联。⁸RBP 足迹可通过 CLIP 标签聚类和峰识别来确定，通常分辨率为 30−60 nt。或者，CLIP 的逆转录步骤可在交联位点处导致插入缺失（indels）或碱基替换，从而实现 RNA 上蛋白质结合位点的单核苷酸分辨率鉴定。....

方案

1. 细胞系构建

1. 将目的基因克隆到 PiggyBac 载体 pPiggyBac-FLAG-bio-[目的 cDNA]-(潮霉素抗性) 质粒中，该质粒携带 FLAG-生物素表位^13,21，用于表达融合有 FLAG-生物素标签的 RNA 结合蛋白（^FBRBP）。
2. 将表达^FBRBP 的载体与 pBase 载体共转染至表达 BirA 酶的细胞系中²²。
   注意：本研究中，将^FBRBP 基因转染至已整合 BirA 表达载体的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中²¹。或者，也可将表达^FBRBP 的载体与 pBase 和 pPiggyBac-BirA-V5 载体共同转染入细胞。
3. 将细胞接种于明胶包被的培养皿中，在 mESC 培养基（材料表）中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。使用潮霉素 B（100 µg/mL）筛选转染细胞，持续 1 周。
4. 药物筛选后，用 SDS 上样缓冲液（表 1）收集细胞，并通过 Western 印迹^23<....

结果

图1展示了^FbioCLIP-seq实验流程的示意图。与FLAG介导或链霉亲和素介导的单步亲和纯化相比，FLAG-生物素串联纯化几乎去除了所有共纯化的蛋白质，避免了间接蛋白-RNA相互作用的污染（图2）。图3和图4分别展示了LIN28和WDR43的^FbioCLIP-seq代表性结果。我们利用小鼠胚胎干细胞（mESCs）进行了LIN28或WDR43的^FbioCLIP-seq实验。图3A显示了LIN28和WDR43在pre-let-7g区域的^FbioCLIP-seq信号轨迹图。图3B展示了pre-let-7g中已报道的GGAG基序以及^FbioCLIP-seq鉴定出的交联位点。通过C.......

讨论

本文介绍了一种改良的CLIP-seq方法，称为^FbioCLIP-seq，该方法利用FLAG-生物素双标签系统对蛋白质-RNA复合物进行串联纯化。已有研究表明，FLAG-生物素双标签系统在鉴定蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用方面具有强大优势^13,21。本文展示了该系统在鉴定与蛋白质相互作用的RNA时具有高特异性和操作便捷性。通过串联纯化和严格的洗涤条件，我们省略了技术难度较高的SDS-PAGE和膜转移步骤，从而更好地保留了蛋白质-RNA相互作用，并避免了同一复合物中RNA结合蛋白（RBP）带来的RNA信号污染。此外，跳过这些步骤也避免了使用放射性标记的ATP对RNA进行标记，使实验流程大大简化。需要注意的是，在本论文撰写过程中，另一种类似的方法uvCLAP也已被提出²⁴。

该实验方案的成功需要注意以下几个关键步骤。首先，在实验前应通过蛋白质印迹法（Western blot）确认标记蛋白生物素标.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
UV 交联仪	UVP	HL-2000 HybrilLinker
亲和纯化珠
ANTI-FLAG 珠	Sigma-Aldrich	A2220
链霉亲和素珠	Invitrogen	112.06D
试剂
10x PBS	Gibco	70013032
3 M NaOAc	Ambion	AM9740
3 x FLAG 肽	Sigma-Aldrich	F4799
ATP	Sigma-Aldrich	A6559
氯化钙 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016
CIP	NEB	M0290S	CIP 缓冲液包含在同一包装中。
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
凝胶纯化试剂盒	QIAGEN	28704
糖原	Ambion	AM9510
氯化镁 (MgCl2)	Sigma-Aldrich	449172
MNase	NEB	M0247S
NP-40	Amresco	M158-500ML
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
蛋白酶 K	TAKARA	9033
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340
Q5 高保真 2X 预混液	NEB	0492S
逆转录酶 (SupperScriptIII)	Invitrogen	18080093
RNA 提取试剂 (Trizol)	Invitrogen	15596018
RNase 抑制剂	ThermoFisher	EO0381
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
RQ1 Dnase	Promega	M6101
SDS	Sigma-Aldrich	1614363
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
T4 PNK	NEB	M0201S	PNK 缓冲液包含在同一包装中。
T4 RNA 连接酶	ThermoFisher	EL0021	T4 RNA 连接酶缓冲液和 BSA 包含在同一包装中。
T4 RNA 连接酶2，截短型	NEB	M0242S	T4 RNA 连接酶缓冲液和 50% PEG 包含在同一包装中。
胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher	25200072
尿素	Sigma-Aldrich	208884
mESC 培养基
DMEM (80%)	Gibco	11965126
2-巯基乙醇	Gibco	21985023
FCS (15%)	Hyclone
Glutamax (1%)	Gibco	35050061
LIF			纯化的重组蛋白；10,000 倍稀释
NEAA (1%)	Gibco	11140050
核苷混合物 (1%)	Millipore	ES-008-D
青霉素-链霉素 (1%)	Gibco	15140122
试剂盒
DNA 凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704