免疫荧光和定量PCR对白蝇组织中白蝇病毒的定位和定量

Summary

我们描述了一种免疫荧光和定量PCR方法，用于昆虫组织中果子病毒的定位和定量。免疫荧光方案可用于共定病毒和载体蛋白。定量PCR协议可以扩展，以量化整个白蝇体内和受病毒感染的植物中的病毒。

Abstract

贝戈莫病毒（贝戈莫病毒属，家族双子病毒）由贝米西亚塔巴奇复合物的白蝇以持续、循环的方式传播。考虑到果虫病毒对全世界作物生产造成的广泛损害，必须了解果蝇病毒与其白蝇载体之间的相互作用。为此，在病媒组织中定位和定量病毒至关重要。在这里，以番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）为例，我们描述了一个详细的方案，通过免疫荧光在白蝇中肠道、原发唾液腺和卵巢中本地化果子病毒。该方法基于对病毒涂层蛋白、染料标记的二级抗体和共聚焦显微镜使用特定抗体。该协议还可用于共同本地化果病毒和白蝇蛋白。我们进一步描述了通过定量PCR（qPCR）对白蝇中肠、原发性唾液腺、淋巴和卵巢中的TYLCV进行定量的一个方案。使用专为TYLCV设计的引基，定量协议允许比较白蝇不同组织中的TYLCV量。所述协议对于白蝇和受病毒感染植物体内的果子病毒的定量可能有用。这些协议可用于分析白蝇中贝戈病毒的循环途径，或作为研究白蝇-白蝇-白蝇病毒相互作用的其他方法的补充。

Introduction

在过去的几十年里，贝戈莫病毒（贝戈莫病毒属，家族双子病毒）已经^{给全世界许多}蔬菜、纤维和观赏作物的生产造成了严重损害。贝戈莫病毒由白蝇贝米西亚·塔巴奇（赫米特拉:阿莱罗迪达）持续传播，这是一种复杂的物种，包含超过35个神秘的物种^2，3。白蝇病毒可能直接或间接地影响白蝇的生理和行为，如粪便^4、长寿⁴和宿主偏好^5、6。此外，即使在相同的实验条件下^{，在相同的}实验条件下，特定白蝇病毒物种/菌株的传播效率也因不同的白蝇神秘物种^{而异，这表明}白蝇与白蝇之间存在复杂的相互作用。为了更好地了解白蝇-白蝇病毒相互作用背后的机制，在白蝇组织中对病毒进行定位和定量至关重要。

番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）是一种在以色列首次....

Protocol

1. 白蝇、病毒、植物和病毒的获取

1. 棉花上的后白蝇 （MEAM1）在温室的防虫笼中，温度为 26 ° 1 °C，相对湿度为 14:10:黑暗循环，60 ± 10% 相对湿度。
2. 基于白蝇线粒体细胞色素氧化酶I基因执行常规PCR，以确定白蝇种群的纯度。
   1. 收集20只成年白蝇，并把它们单独转移到含有30μL的发合缓冲液（10 mM Tris，pH = 8.4，50 mM KCl，0.45%[wt/vol] 补间-20，0.2% [wt/vol] 明胶，0.45% [vol/vol] 诺尼德 P 40，60 g/mLl。
   2. 在每个 PCR 管中加入 5⁄7 个陶瓷珠子（直径 2 mm），并研磨样品以进行组织莱沙。
   3. 在65°C孵育所有样品1小时，然后在100°C下孵育10分钟，然后短暂离心。使用此上清液作为 PCR 扩增的模板。
      注:如有必要，可在65°C处增加孵育时间。
   4. 按如下方式制备PCR反应:1 U的Taq DNA聚合酶，2μL的10x缓冲液（含Mg2+），1.6μL的dNTP混合物（2.5 mM），每引物0.5μL（每个引物10μM），2μL的白蝇组织上液，以及双蒸馏水，总体积为20μL每次反应。正向引基序列为 5' - TTATTTATATATCAAAGT-3' 和反向引基序列为 5' - TAATATGGATATATATATATATATATG-3'。
      注:应包括....

Results

此处使用B. tabaci复合体和 TYLCV 的 MEAM1 白蝇作为示例来描述这些过程。本手稿中描述的免疫荧光和病毒定量程序概述如图1所示。图2显示了PSG、中肠和卵巢中TYLCV和DAPI染色免疫荧光检测的代表性结果，表明TYLCV在PSG和中肠道中积累较多，卵巢中积累较少。图3显示了白蝇PSG、中古、淋巴和卵巢中24、48和72小时在TYLCV感染番茄上喂食后病毒的相对数量，表明随着采集期的增加，不同白蝇组织中病毒的数量增加。

图 1:本文中介绍的协议概述。（A） 白蝇中肠、PSG.......

Discussion

在这里，我们描述了一种方案，用于通过免疫荧光和qPCR在其白蝇载体的组织中定位和定量果蝇病毒。解剖是白蝇组织中对病毒进行本地化和量化的第一步。白蝇的身体长约1毫米，这意味着组织非常小，很难解剖它们。此外，组织之间有很强的联系。例如，卵巢与细菌紧密结合，使其难以分离。在这里，考虑到不同组织的特点和位置，我们描述了不同的解剖方法。然而，需要大量的实践来快速准确地解剖这些组织。此外，最好使用新鲜的白蝇，因为死昆虫会增加解剖的难度。此外，解剖后，必须清洁组织，以避免污染。

免疫荧光技术基于特定抗体的使用。每个抗体的合适工作浓度在成像中非常重要，因为高浓度的抗体会降低信背景比，低浓度可能无法提供足够的信号。在这里，我们使用稀释1:400的初级抗体和第二抗体。这些抗体应分成小等分，并保持在-20°C，以避免反复冻结和解冻。抗体稀释应在使用前准备。当此处描述的方案用于共同地化病毒和白蝇蛋白时，对病毒和白蝇蛋白的主要抗体产生于不同物种的动物中非常重要。此外，应仔细选择二级抗体的荧光道，以防止通道之间出血。此外，鉴于白蝇组织体积小，应始终在显微镜下清洗，以避免损失。虽然免疫荧光是高度敏感的，但与其他.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% 多聚甲醛	MultiSciences	F0001
4'，6-二脒基-2-phé尼龙哚 （DAPI）	Abcam	ab104139
牛血清白蛋白 （BSA）	MultiSciences	A3828
CFX Connect 实时 PCR 检测系统	Bio-RAD	185-5201
共聚焦显微镜	蔡	LSM800
Dylight 549 山羊抗小鼠	Earthox	E032310-02	二抗
单克隆抗体 （MAb 1C4）			一抗
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sangon Biotech	B548119-0500
体视显微镜	蔡司	Stemi 2000-C
TB 绿色预混液 Ex Taq （Tli RNase H Plus）	TaKaRa	RR820A	qPCR 预混液
热循环仪	Thermofisher	A41182
Tissuelyzer	沙海景欣	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI 生命科学	9002-93-1
吐温 20	BBI 生命科学	9005-64-5