我们描述了一种用于定位和定量昆虫组织中双生病毒的免疫荧光与定量PCR方法。该免疫荧光方案可用于病毒蛋白与媒介蛋白的共定位分析。定量PCR方案可进一步扩展用于整只烟粉虱个体以及病毒感染植物中病毒的定量分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
双生病毒属（Begomovirus，双生病毒科 Geminiviridae）由烟粉虱复合种（Bemisia tabaci）以持久性循环方式传播。鉴于双生病毒对全球农作物生产造成的严重危害，深入理解双生病毒与其烟粉虱传播介体之间的相互作用至关重要。为此，对病毒在介体组织中的定位与定量分析尤为关键。本文以番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）为例，详细介绍了一种利用免疫荧光技术对双生病毒在烟粉虱中肠、主唾液腺及卵巢中进行定位的实验方案。该方法基于特异性针对病毒外壳蛋白的一抗、荧光染料标记的二抗以及共聚焦显微镜检测。该方案还可用于双生病毒蛋白与烟粉虱蛋白的共定位分析。此外，本文进一步描述了一种通过定量PCR（qPCR）对TYLCV在烟粉虱中肠、主唾液腺、血淋巴及卵巢中进行定量的实验流程。利用针对TYLCV特异性设计的引物，该定量方案可实现对烟粉虱不同组织中TYLCV含量的比较。所描述的定量方法亦可用于检测烟粉虱个体或感染病毒的植物体内双生病毒的含量。这些实验方案可用于分析双生病毒在烟粉虱体内的循环路径，或作为其他研究烟粉虱-双生病毒互作方法的补充手段。
引言
近几十年来，双生病毒科（Geminiviridae）双生病毒属（Begomovirus）的病毒已对全球多种蔬菜、纤维作物和观赏植物的生产造成严重危害1。双生病毒以持久性方式由烟粉虱（Bemisia tabaci，半翅目：粉虱科）传播，而烟粉虱是一个包含35种以上隐存种的复合种2,3。双生病毒可能直接或间接影响烟粉虱的生理和行为，例如繁殖力4、寿命4以及寄主选择偏好5,6。此外，即使在相同的实验条件下，特定双生病毒种类/株系对不同烟粉虱隐存种的传播效率也存在差异7,8,9,10，表明双生病毒与烟粉虱之间存在复杂的相互作用。为了更深入理解烟粉虱与双生病毒相互作用的机制，对病毒在烟粉虱组织中的定位与定量至关重要。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 粉虱、病毒、植物与病毒的获取
- 在温室中，于26 ± 1 °C、14小时光照:10小时黑暗光周期、相对湿度60 ± 10%的条件下，在防虫网笼内的棉花（Gossypium hirsutum 品种 Zhemian 1793）上饲养烟粉虱（MEAM1）。
- 基于烟粉虱线粒体细胞色素氧化酶I基因进行常规PCR，以确定烟粉虱种群的纯度。
- 采集20头成虫烟粉虱，分别转移至含有30 μL裂解缓冲液（10 mM Tris，pH = 8.4，50 mM KCl，0.45% [wt/vol] Tween-20，0.2% [wt/vol] 明胶，0.45% [vol/vol] Nonidet P 40，60 g/mL 蛋白酶K）的PCR管中。
- 向每根PCR管中加入5–7颗陶瓷珠（直径2 mm），研磨样品以实现组织裂解。
- 将所有样品在65 °C孵育1小时，随后在100 °C孵育10分钟，短暂离心。以上清液作为PCR扩增的模板。
注：如有需要，可适当延长65 °C的孵育时间。 - 按如下体系配制PCR反应液：1 U Taq DNA聚合酶，2 µL 10x缓冲液（含Mg2+），1.6 µL dNTP混合物（2.5 mM），每种引物各0.5 µL（10 μM），2 µL烟粉虱组织裂解液上清，双蒸水补足至每反应总体积20 µL。上游引物序列为5'-TTGATTTTTTGGTC....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
B. tabaci 复合种中的 MEAM1 烟粉虱和番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）被用作示例，以描述本研究中的实验流程。本文所述免疫荧光检测与病毒定量方法的整体流程见图1。图2展示了TYLCV免疫荧光检测与DAPI染色在烟粉虱咽下腺（PSGs）、中肠和卵巢中的代表性结果，表明TYLCV在咽下腺和中肠中积累较多，而在卵巢中积累较少。图3展示了烟粉虱在取食感染TYLCV的番茄植株24、48和72小时后，其咽下腺、中肠、血淋巴和卵巢中病毒的相对含量，结果显示随着获毒取食时间的延长，病毒在不同组织中的含量逐渐增加。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种通过免疫荧光和定量PCR对双生病毒在其烟粉虱媒介体内组织进行定位与定量的实验方案。解剖是实现病毒在烟粉虱组织中定位与定量的第一步。烟粉虱体长约1毫米，其组织极为微小，解剖难度较大。此外，各组织之间存在较强的连接。例如，卵巢与含菌细胞紧密相连，难以分离。针对不同组织的结构特征与位置分布，本文介绍了多种解剖方法。然而，要快速而准确地完成这些组织的解剖，需要大量的实践操作。此外，最好使用新鲜的烟粉虱，因为死亡个体将增加解剖难度。同时，在解剖完成后，必须对组织进行清洗，以避免污染。
免疫荧光技术基于特异性抗体的使用。每种抗体的合适工作浓度在成像中非常重要，因为抗体浓度过高会降低信噪比，而浓度过低则可能无法提供足够的信号。本实验中，一抗和二抗均采用1:400的稀释比例。这些抗体应分装成小份保存于-20 °C，以避免反复冻融。抗体稀释液应在使用前新鲜配制。当本方案用于共定位病毒与烟粉虱蛋白时，针对病毒蛋白和烟粉虱蛋白的一抗必须由不同物种的动物产生。此外，应谨慎选择二抗所偶联的荧光染料，以防止不同检测通道之间的串色。另外，由于烟粉虱组织较小，所有洗涤步骤均应在显微镜下进行，以避免样.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家重点研发计划（项目编号：2017YFD0200600）、中国农业研究体系专项资金（项目编号：CARS-23-D07）和比尔 & 梅琳达·盖茨基金会（投资编号 OPP1149777）。我们感谢吴建祥教授提供TYLCV CP抗体。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 甲醛 | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-二脒基-2-苯并咪唑酮é尼立哚（DAPI） | Abcam | ab104139 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统 | 伯乐（Bio-RAD） | 185-5201 | |
| 共聚焦显微镜 | 蔡司 | LSM800 | |
| Dylight 549-山羊抗小鼠 | Earthox | E032310-02 | 二抗 |
| 单克隆抗体（MAb 1C4） | 一抗 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR预混液 |
| PCR仪 | 赛默飞世尔科技 | A41182 | |
| Tissuelyzer | 上海精欣 | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI生命科学 | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI生命科学 | 9005-64-5 |
参考文献
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
