染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）是一种用于确定转录因子与其调控的基因组序列之间相互作用的方法。本实验方案以鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica）血清型肠炎沙门菌的细菌生物膜为例，详细介绍了在细菌生物膜中进行ChIP-seq的技术步骤。
本文内容
摘要
摘要
染色质免疫沉淀结合测序（ChIP-seq）是一种可用于发现转录因子、组蛋白修饰及其他DNA结合蛋白调控靶点的技术。ChIP-seq 数据还可用于分析不同环境条件或细胞类型中转录因子的差异性结合。最初，ChIP 通过在微阵列上进行杂交（ChIP-chip）来实现；然而，随着技术进步、测序成本降低以及能够产生大量高质量数据，ChIP-seq 已成为首选方法。本实验方案描述了针对细菌生物膜（持续性和慢性感染的重要来源）进行 ChIP-seq 操作的技术。本研究以鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）的生物膜细胞和浮游细胞为材料，针对生物膜主调控因子 CsgD 进行 ChIP-seq，以确定该因子在两种细胞类型中的差异结合情况。本文展示了生物膜样本的适宜收获量、以浮游对照样本为基准的归一化处理、为使交联剂充分渗透而对生物膜进行均质化处理，以及执行常规 ChIP-seq 步骤以获得高质量测序结果的具体方法。
引言
细菌生物膜是由细胞及其自身产生的基质构成的结构化聚集体，具有抗干燥、抗生素和宿主免疫反应的能力。1因此，它们会引起持续性和慢性感染，并因其在生存与传播方面的适应性策略而给研究人员带来独特的挑战。 肠道沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌（S. 伤寒沙门氏菌（Typhimurium）在环境压力条件下（28 °C，营养受限）的纯培养中，可形成表型异质性的生物膜聚集体，这类聚集体对干燥和抗生素具有抗性，同时存在表达毒力因子的浮游细胞。2这两种细胞类型是由于生物膜主调控因子 CsgD 的双稳态表达而产生的。3我们推测，这可能是一种风险分摊策略 沙门氏菌，其中浮游细胞参与短期传播，而生物膜细胞则能在环境中长期存活，直至有机会感染新宿主2,4. 许多调控控制元件 csg 操纵子表达特征明确5。然而，除了 adrA 以及 csg 操纵子6目前对 CsgD 的调控靶点知之甚少。明确 CsgD 的调控网络将有助于我们更深入地理解沙门菌的生活周期以及生物膜在传播过程中的作用。
染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）是一种强大的体内技术，可用于全基因组范围内鉴定蛋白质与DNA的相互作用，并提供有关转录因子、组蛋白修饰或核小体参与的调控过程的信息7。近年来的研究已利用该技术评估不同生长条件和细胞类型之间蛋白质结合的差异8。在染色质免疫沉淀（ChIP）过程中，通过针对目标蛋白的特异性抗体富集与蛋白质结合的DNA片段。首先收集细胞，并通过甲醛交联处理将DNA结合蛋白在体内与DNA交联固定。随后裂解细胞以释放内容物，并将染色质剪切为约200–600 bp的片段7。利用抗体对与目标蛋白结合的DNA片段进行免疫沉淀，再经去交联及蛋白质消化后分离得到DNA片段9。这些DNA片段代表了蛋白质的结合位点，可通过与微阵列杂交（ChIP-chip）或深度测序并比对至基因组序列进行鉴定10,11。尽管ChIP-chip实验能够提供足够的调控信息，但其应用受限于昂贵的探针成本以及杂交和芯片本身带来的偏差12。与ChIP-chip相比，ChIP-seq具有更宽的动态范围、更高的核苷酸分辨率和覆盖度、更优的信噪比，并且产生的假象更少7。
ChIP 已被用于分析 Sfh 和 OmpR 的调控作用 沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门菌13,14，群体感应AphA调控在 弧菌 alginolyticus15, RpoS 调控在 大肠杆菌16，毒力调节因子EspR的调控机制在 结核分枝杆菌17通过 AmrZ 调控的潜在二鸟苷酸环化酶 铜绿假单胞菌18，以及 VraSR 调控在 金黄色葡萄球菌19. 已描述的细菌ChIP-seq实验通常从液体培养基中培养细胞并以单细胞形式收获开始。然而，对生物膜及其相应基因调控的分析为建立成功的ChIP-seq实验方案带来了一系列新的挑战。本方案中，ChIP-seq被用于鉴定CsgD的差异调控靶点，该 S. 鼠伤寒沙门氏菌生物膜主调控因子在生物膜和浮游细胞类型中的研究。本方案描述了用于确定ChIP-seq所需生物膜适量样本、从烧瓶培养物中收获生物膜、对生物膜及单细胞对照样本进行归一化处理、均质化生物膜以及完成免疫沉淀的技术。该方法对于研究细菌生物膜中的调控靶点具有重要价值，并可适用于多种物种。
方案
1. 锥形瓶培养细胞生长
- 从冻存菌种中挑取伤寒沙门氏菌（Salmonella serovar Typhimurium）菌株，在含有适当抗生素的LB琼脂平板（100 mm培养皿中含20 mL固体培养基）上划线，于37 °C培养16–20小时，以获得单菌落。
- 从步骤1.1的划线平板上挑取1–3个单菌落，接种于含有适当抗生素的5 mL LB液体培养基中（置于25 mm × 150 mm的硼硅酸盐培养管内），于37 °C、200 rpm振荡培养7小时。
- 使用分光光度计测定液体培养物在600 nm处的光密度（OD600）。取适量培养物，用PBS按1:4比例稀释后加入2 mL比色皿中，测定600 nm处的吸光度。我们发现此步骤最关键的因子是培养时间。OD值用于标准化培养物，以便在步骤1.4中提供所需数量的细胞。
- 将相当于1.0 OD600体积的菌液（即约109个细胞）加入含有100 mL 1%胰蛋白胨并添加适当抗生素的锥形瓶中，于28 °C、200 rpm振荡培养13小时。
注意：生物膜细胞会以聚集的片状物形式出现，而浮游的单个细胞则存在于浑浊的培养液中。
2. 收集无细胞的1%胰蛋白胨培养上清
- 收集烧瓶培养物以获得无细胞的条件培养基（含1%胰蛋白胨）。在将培养物转移至离心管前，用移液器反复吹打数次以充分混匀。
- 在10 °C条件下，以12,000 x g 离心10分钟，使所有细胞沉淀。
- 将上清液倾入0.2 µm滤器装置中，进行真空过滤，并分装至新离心管中。
注意：生物膜聚集体在常规溶液（如PBS）中具有黏附性，会附着在离心管管壁及移液器吸头表面。由于条件培养基（含1%胰蛋白胨）更便于操作，我们最初使用该培养基转移生物膜，并在交联前（步骤4.5）立即更换为温热的PBS，以去除培养基中可能存在的蛋白质交联底物。
3. 从烧瓶培养物中分离生物膜和浮游细胞2
- 使用无菌的 25 mL 移液管，将烧瓶培养物分装至 15 mL 离心管中。以低速（210 × g）离心 2 分钟，以分离两种细胞类型。
注意：生物膜细胞应在离心管底部形成松散的沉淀 - 将含有浮游细胞的上清液用移液管转移至两个 40 mL 离心管中，留待后续使用（步骤 5）。移除所有剩余液体时，注意不要扰动沉淀。重复此操作，直至从所有烧瓶培养基中完成两种细胞类型的分离。
4. 准备受生物膜聚集体
注意：生物膜通过湿重收获，以获得 25 µg DNA，这是染色质免疫沉淀（ChIP）推荐的最低起始材料量。S. Typhimurium 的生物膜转换系数（BCF）为 1.73 × 108 CFU/mg2。准备其他类型生物膜的研究人员需通过实验确定每单位重量生物膜中的细胞数量，并利用以下公式计算获得 25 µg DNA 起始材料所需的生物膜重量：
- 准确称量一个 2 mL 带盖离心管（ snap cap 或 screw cap 管）的重量。
- 用 1 mL 预培养的胰蛋白胨液体将生物膜沉淀重悬。将重悬的生物膜转移至已预先称重的 2 mL 带盖离心管中。
- 在 20 °C 条件下，以 11 000 x g 离心 1 分钟。
- 小心移除管中全部上清液，并准确称量离心管重量。用含生物膜的管重减去空管重量，计算出生物膜重量。该重量应位于目标生物膜重量的 ±10% 范围内。
- 洗涤细胞以去除残留的预培养胰蛋白胨液体。向管中加入 1 mL 温热的 PBS，轻轻涡旋振荡以重悬沉淀。在 8 000 x g 条件下离心 3 分钟，使生物膜沉淀，并弃去上清液。再向管中加入 1 mL PBS，涡旋振荡以重悬沉淀。
5. 准备浮游细胞
- 使用分光光度计测定低速离心后（步骤 3.2）浮游上清液的体积和 OD600
- 计算获得最终 OD600 为 6.0 所需的体积：
- 将离心机预冷至 10 °C，通过离心（10,000 × g，10 °C 下 10 分钟）沉淀浮游细胞
- 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于步骤 5.2 中计算出的最终体积的 PBS 中
- 使用分光光度计重新测定浮游细胞的 OD600，并将相当于 6.0 OD600 的浮游细胞体积分装至 2 mL 扣盖或螺口管中
- 用 PBS 定容至 1 mL
6. 细胞匀浆化
- 向每个试管中加入一个已灭菌的5 mm不锈钢珠。
- 使用混匀仪以30 Hz频率均质化5分钟。观察聚集的试管，确认生物膜已被打散。
- 将均质后的细胞转移至新的1.5 mL离心管中，避免转移金属珠。用PBS定容至1 mL。
注意：进行系列稀释以计数输入细胞，并确认最终细胞数量接近预期或目标值。
7. 蛋白质与DNA的交联
- 将新鲜的甲醛加入样本管中，使其终浓度为1%。在旋转摇床上室温孵育30分钟。
注意：甲醛具有腐蚀性，对皮肤、眼睛和呼吸道有刺激作用，且易燃。应在通风橱中操作。 - 加入1 M甘氨酸，使其终浓度为125 mM，以终止交联反应。在旋转摇床上室温孵育5分钟。
8. 洗涤细胞以去除过量交联剂
- 在 8,000 x g 条件下离心 3 分钟以沉淀细胞，并弃去上清液
- 将沉淀重悬于 20 µL 的 25 倍蛋白酶抑制剂和 500 µL 滤膜过滤除菌的 PBS 中。
- 在 8000 x g 条件下离心 3 分钟，并弃去上清液。
9. 裂解细胞
- 将沉淀重悬于 600 µL 裂解缓冲液中（参见表 1），冰上孵育 10 分钟。
- 向一个无菌的 15 mL 离心管中加入 1.4 mL 免疫沉淀稀释缓冲液（参见表 1），并将裂解后的细胞转移至该 15 mL 离心管中。冰上放置 1.5–2 小时，期间轻轻涡旋振荡数次。
注意：部分难裂解的细胞物质可能仍残留在管中。通过在冰上长时间孵育并间歇涡旋振荡，可使这些物质进一步破碎。剩余物质将通过超声处理进一步打碎。
10. 通过超声处理片段化DNA
- 将15 mL离心管置于盛有冰的烧杯中，并将3 mm探头插入管内。
- 以400 W功率的20–40%进行5轮超声处理，每轮30秒，每次超声间隔在冰上冷却2分钟。
- 通过离心沉淀析出的物质（8000 x g，4 °C下离心10分钟），将上清液转移至新离心管中。
- 可选步骤：在65 °C下进行30–60分钟解交联处理，随后在45 °C下消化RNA和蛋白质30–60分钟，再在2%琼脂糖凝胶上电泳以检测片段大小是否合适。
注意：将探头浸入细胞裂解液中。超声处理及间歇期间始终保持溶液处于冰上。超声探头脉冲时不得取出离心管。超声前溶液应呈浑浊状，超声后应变得澄清。
11. 免疫沉淀 DNA-蛋白质-抗体复合物
- 准备
- 分装一份1.35 mL等分试样用于免疫沉淀，另一份 200 µL 分装一份作为输入对照。将输入对照保存于 -80 °C 直至进行解交联和消化步骤。
- 使用一抗进行免疫沉淀
- 添加 10 µg 纯化蛋白特异性一抗 1.35 µL 分装。在过夜孵育 4 °C 在旋转轮上。
注意：一抗可以是单克隆抗体、高质量的多克隆血清或商用表位抗体（如抗-FLAG）。 - 添加 50 µL 将蛋白G磁珠加入第11.2.1步的各管中，孵育 4 °C 在旋转轮上孵育3 h。
- 加入IP洗涤缓冲液1、IP洗涤缓冲液2和TE（pH 8.0）（参见 表1) 置于冰桶中。将洗脱缓冲液预热至 65 °C.
注意：含有洗脱缓冲液的溶液切勿置于冰上。 - 使用磁力架将蛋白G磁珠吸附在离心管管壁上
- 进行洗涤：用……洗涤2次 750 µL 冷IP洗涤缓冲液1，洗涤1次 750 µL 冷IP洗涤缓冲液2，洗涤2次 750 µL pH 8.0 的冷TE缓冲液。洗涤过程中将离心管置于磁力架上。
- 添加 450 µL IP洗脱缓冲液（参见 表1) 加入各管中，于 65 °C 每5分钟轻柔涡旋振荡一次，共30分钟。
- 将磁珠用磁力架吸附至管壁，静置至少2分钟，直至溶液澄清。
- 将澄清的上清液转移至新的1.5 mL离心管中，注意不要扰动磁珠沉淀。
- 添加 10 µg 纯化蛋白特异性一抗 1.35 µL 分装。在过夜孵育 4 °C 在旋转轮上。
12. 解交联 DNA-蛋白质复合物并消化共纯化的 RNA 和蛋白质
- 向每管中加入 2 µg RNase A 和 NaCl，使 NaCl 终浓度为 0.3 M。
- 在 65 °C 下孵育，时间不少于 6 小时，或过夜。
- 向每管中加入 180 µg 蛋白酶 K 以完成蛋白质消化，然后在 45 °C 下孵育 3–5 小时。
13. 文库构建与测序
- 使用磁珠纯化 DNA
注意：磁珠法更适合分离染色质免疫沉淀（ChIP）实验中通常从细菌细胞中回收的微量 DNA。 - 使用与所选测序平台兼容的试剂盒构建文库。
- 使用荧光计配合广谱双链 DNA 检测试剂盒或 qRT-PCR 文库定量试剂盒检测文库浓度。
注意：根据我们的经验，荧光计测量结果可能会高估 DNA 浓度。 - 根据每个文库样本所需的充分覆盖度对文库进行混合。对于沙门氏菌（Salmonella）的 Illumina 测序，我们混合了 10–12 个文库。加入 Tris-HCl（pH 8.0）至终浓度为 1 mM。
- 根据所选测序平台的规格进行测序。
结果
细菌生物膜染色质免疫沉淀样品的制备包含多个步骤，如图1所示。这些步骤包括在摇瓶培养中生长生物膜、收集条件培养基、收集足量的生物膜及浮游细胞作为对照、用PBS洗涤细胞、组织匀浆、将蛋白质与DNA进行交联、裂解细胞、通过超声处理片段化DNA、使用特异性抗体和蛋白G磁珠对DNA进行免疫沉淀、洗涤并洗脱免疫沉淀的DNA，以及纯化DNA用于文库构建和测序。
S. Typhimurium 细胞在诱导生物膜形成的液体培养条件下生长时，会发生表型转换，形成多细胞生物膜聚集体和浮游细胞。该群体中约包含 40% 的生物膜聚集体（表达较高水平的双鸟苷酸环化酶（DGCs）和生物膜调控因子）和 60% 的浮游细胞（表达较高水平的毒力相关基因）2,4（图 2A）。本方案中，我们描述了一种同时收集这两种细胞类型以通过 ChIP-seq 比较其转录位点的方法；然而，该方案也可根据需要调整用于其他细菌物种形成的其他类型生物膜。生物膜聚集体和浮游细胞通过低速离心进行分离，该步骤可使生物膜聚集体沉淀，而浮游细胞保留在上清液中2（图 2B）。随后，将这两类细胞分别进行后续实验步骤处理。
ChIP-seq 建议输入的 DNA 量为 10–25 µg20。在鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）摇瓶培养中，30 mg 生物膜可获得约 25 µg DNA。由于生物膜聚集体含有大量蛋白质性质的胞外物质，我们推测这可能会影响交联效率。如果仅按细胞数量对不同类型的细胞进行归一化处理，则悬浮生长细胞的处理可能导致免疫沉淀时交联产物的量不一致。因此，我们进行了蛋白质定量分析，以确定与 30 mg 生物膜相当的悬浮细胞材料量（图 3）。结果表明，收获 6.0 OD600 的悬浮细胞可匹配 30 mg 生物膜的蛋白量。
必须首先将生物膜聚集体打散，以使交联剂能够均匀接触所有细胞。我们发现，使用混合研磨仪和5 mm不锈钢珠是实现细胞均质化最均匀且通量最高的方法（图4A）。浮游细胞也采用相同处理方式，以减少ChIP-seq实验中的变量（图4B）。
DNA 经超声处理断裂、交联，并用 RNase 和蛋白酶 K 处理后，可在 2% 琼脂糖凝胶上进行检测。超声处理后的 DNA 被打断成一系列片段，在琼脂糖凝胶上呈现为弥散条带。平均片段大小随超声脉冲次数的增加而减小（图 5）。不同超声仪的能量传递效率存在差异，因此建议进行超声条件优化实验，以确定将 DNA 打断至平均长度小于 1 kb 所需的超声脉冲次数。在本研究的 ChIP-seq 实验中，我们选择了 5 次脉冲。
ENCODE 指南建议通过免疫印迹法验证抗体对靶标的结合活性21。在此实验中，我们通过免疫印迹法检测了抗体在染色质免疫沉淀（ChIP）所用全细胞裂解液中的特异性和结合强度（图6）。我们证实该抗体可结合 CsgD-3xFLAG；抗 FLAG 抗体与抗 CsgD 抗体的信号在预期的分子量（28 kDa）处共定位22。
染色质免疫沉淀（ChIP）实验通常获得的DNA浓度较低。因此，选择了一种能够去除污染物并保留较高比例DNA的纯化方法。与基于离心柱的纯化方法相比，选择了磁珠纯化法，因为它对低浓度的ChIP DNA输入量具有更好的保留效果（图7），并能有效去除污染物（数据未显示）。
由于起始DNA量较少，ChIP DNA的文库构建可能需要使用稀释的接头并进行PCR扩增。测序前，可通过Bioanalyzer图谱观察文库，以确认PCR扩增前后文库片段大小分布的正确性（图8）。此外，若已知转录因子存在特定的调控靶点，应通过qPCR检测来确认结合区域的富集情况，即比较免疫沉淀DNA与超声处理后的输入DNA中，已知靶基因与参考基因序列丰度的倍数变化（∆∆Ct）。
ChIP-测序数据的分析应包括赋予质量评分、剪切低质量碱基、比对成对末端测序中的正向和反向读段、将读段比对至高质量参考基因组、识别显著高于背景信号的峰，并进行下游分析（图9A）。下游分析应包括峰的可视化与注释、与生物学重复样本的一致性评估以及基序分析，还可包括不同实验条件或细胞类型间的差异结合分析，以及与已知通路基因表达数据的整合分析。对于类似本研究的ChIP-seq数据，应通过统计学显著性（p值）来确定峰（图9B,C，红色条形），而不仅仅依据倍数变化。在最终分析中，比对后的读段将与参考基因组的注释信息对照进行可视化展示（图9D）。若ChIP-seq结果较差，则其图谱将类似于输入对照测序（input-seq），即无任何显著高于背景信号的峰。
图1：细菌生物膜中 ChIP-seq 实验步骤示意图。 在本实验流程中，S. Typhimurium 细胞在含1%胰蛋白胨的摇瓶培养基中于28 °C条件下振荡培养（1），收集无细胞的条件培养基以处理生物膜细胞类型（2），用于获取足量的生物膜细胞和浮游细胞（3）。随后，这些细胞用 PBS 洗涤，并进行均质化处理以破坏生物膜结构（4）。使用甲醛交联剂将蛋白质与 DNA 进行交联，之后裂解细胞以释放内容物（5）。通过超声处理将细胞裂解液中的 DNA 断裂成片段（6）。利用特异性结合目标蛋白的抗体及 Protein G 磁珠，通过免疫沉淀富集与目标蛋白交联的 DNA（7）。将富集的 DNA 从 Protein G 磁珠上洗涤并洗脱（8），纯化后用于文库构建和测序（9）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：用于研究的体外烧瓶模型 S. 伤寒沙门菌生物膜发育 (A) S. 鼠伤寒沙门氏菌在1%胰蛋白胨中于37°C培养13小时 28 °C 经历表型转换，形成生物膜聚集体和液体培养基中的浮游细胞。B) 通过在 210 x 离心分离来自 (A) 中烧瓶培养物的生物膜聚集体和浮游细胞 g 孵育2 min后，收集上清液用于浮游菌细胞制备，收集沉淀用于生物膜细胞制备。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：从浮游细胞和生物膜细胞样品中收获的总蛋白浓度 S. 鼠伤寒沙门氏菌摇瓶培养 采用比色法蛋白质检测，以牛血清白蛋白（BSA）标准曲线为参照，在 750 nm 处测定蛋白质相对含量。裂解的浮游细胞样品在 OD 4.0、6.0 和 8.0 时的蛋白质含量600 与30 mg的生物膜聚集体进行了比较。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：S. Typhimurium 生物膜烧瓶培养物中细胞样品的匀浆处理。（A）来自烧瓶培养的生物膜聚集体在PBS中重悬（左），使用混合研磨仪在30 Hz条件下处理5分钟进行匀浆（右）。（B）来自烧瓶培养的浮游细胞在PBS中重悬后，同样以30 Hz频率经混合研磨仪处理5分钟，以确保不同类型细胞样品之间的一致性。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：使用染色质免疫沉淀前细胞裂解液进行的超声处理实验。 生物膜聚集体和浮游细胞样品被分别分离、均质化、交联并裂解。DNA-蛋白质复合物在冰上进行超声处理，每次超声30秒，间隔2分钟，最多重复8次，以将DNA打断成较小的片段。取部分超声处理后的裂解液在2%琼脂糖凝胶上进行分离。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：ChIP-seq 实验中所用抗 FLAG 抗体的靶标结合特异性。 通过免疫印迹法检测抗体特异性，所用样品为如图所示的鼠伤寒沙门菌（S. Typhimurium）菌株的全细胞裂解物。菌株 ∆csgD + p3xFLAG/csgD 和野生型（WT）生物膜样品代表从摇瓶中收获的生物膜聚集体，而菌株 ∆csgD ± p3xFLAG 和野生型浮游细胞代表浮游生长的细胞。纯化的 His 标签 CsgD 蛋白作为对照加载。全细胞裂解物经标准化处理，使每泳道上样总蛋白量为 30 µg。左侧数字表示预染分子量标记物的大小（单位为 kDa）。上图使用的初级抗体为兔源抗 FLAG 多克隆抗体（Sigma-Aldrich #F7425），下图则同时孵育兔源抗 FLAG 抗体和 CsgD 特异性单克隆抗体2。二抗分别为山羊抗兔 IgG（LiCor IRDye 680RD, 925-68071）和山羊抗小鼠 IgG（LiCor IRDye 800CW, 925-32210）。荧光信号使用 Odyssey CLx 成像系统及 Image Studio 4.0 软件包（Li-Cor Biosciences）进行检测。图中显示为代表性结果图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：针对ChIP-seq实验所得少量DNA的基于离心柱或磁珠的纯化策略。 使用基于离心柱的试剂盒或磁珠对已知量的DNA样本进行纯化，并测定洗脱液在纯化后的浓度。在低浓度DNA条件下，磁珠法表现出更优的回收率，这与ChIP-seq实验流程结束时（NGS文库构建之前）通常所获得的极少量DNA情况相似。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：通过Bioanalyzer检测的ChIP DNA样品及其后续文库 (A细胞裂解和超声处理后基因组DNA的平均片段大小为 <1000 bp，其中大部分片段位于200–500 bp范围内。B文库构建起始材料低于检测限。C连接接头和PCR富集可实现文库片段的扩增。D文库制备质量较差时，会出现DNA峰低、峰形异常或高分子量峰，或在约100 bp处出现大量接头接峰。 请点击此处查看此图的放大版本。
图9：ChIP-seq数据通过生物信息学工具进行分析，并在基因组浏览器中可视化。 A. ChIP-seq数据典型生物信息学分析流程图。生物膜样本（∆csgD菌株 + p3xFLAG/csgD）和浮游细胞样本（∆csgD + p3xFLAG）的原始读段经过去除低质量读段和接头序列后，使用Bowtie2（v2.3.3.1）以默认参数比对至S. Typhimurium 14028s基因组（染色体NC_016856.1，质粒NC_016855.1）23。采用MACS2（v2.1.2）调用峰，参数为'-q 0.01 --nomodel'，将生物膜重复样本设为实验组，浮游细胞样本设为对照组24。进一步使用MACS2的bdgcmp模块，以'-m FE'参数生成折叠富集轨迹。具有显著性的峰文件结合折叠富集轨迹通过bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig工具转换为wig文件25，并在参考基因组上使用Integrative Genomics Viewer v2.5.1进行可视化26。图中显示代表性峰（红色条形）。(B) 一个约40 kbp的大区域，包含多个峰，属于非典型结果，但仍可能具有研究价值。(C) 此图为更典型的分析结果，显示两个显著的峰区域。(D) 对C图左侧峰区域的放大视图，显示读段比对至S. Typhimurium 14028s基因组中包含uspA与uspB双向启动子的区域。请点击此处查看该图的放大版本。
| 细胞裂解缓冲液 |
| 裂解缓冲液 |
| 50 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| 蛋白酶抑制剂 |
| 免疫沉淀稀释缓冲液 |
| 20 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0.01% SDS |
| 免疫沉淀缓冲液 |
| 免疫沉淀洗涤缓冲液 1 |
| 20 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 2 mM EDTA |
| 50 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0.1% SDS |
| 免疫沉淀洗涤缓冲液 2 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 250 mM LiCl |
| 1 mM EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% 脱氧胆酸 |
| TE (T10E1) pH 8.0 |
| 10 mM Tris-HCl |
| 1 mM EDTA |
| 洗脱缓冲液 |
| 1% SDS |
| 100 mM NaHCO3 |
表1. 缓冲液配方。
讨论
本方案概述了一种对纯培养物中的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）生物膜细胞和浮游细胞进行ChIP-seq分析的技术，旨在鉴定主调控因子CsgD的调控靶点。由于CsgD在两种细胞类型中具有双稳态特性，在生物膜聚集体中表达水平较高，而在浮游细胞中表达水平较低，因此我们预期可获得差异性结合信息2,3。然而，该技术也可适用于其他细菌转录因子、细胞类型或生长条件。特别是，通过使用实验确定的每单位重量生物膜细胞的菌落形成单位（CFU）换算系数，该技术可被调整用于其他细菌生物膜的研究。
ChIP-seq 在测序过程中可能因技术误差的扩增而产生偏差；然而，在关键步骤进行验证可以避免这一问题27。在免疫沉淀过程中，一抗的特异性对于仅选择目标转录因子及其所调控的DNA至关重要7。在本实验中，csgD 基因在其3'端与质粒编码的3xFLAG标签融合，对应于CsgD蛋白的C末端22。不含csgD的p3xFLAG质粒被用作"对照"（S. Typhimurium 14028 ∆csgD + p3xFLAG）。ENCODE指南建议使用针对目标蛋白的一抗对ChIP菌株和缺失菌株的裂解液进行免疫印迹分析21。确保各重复组之间的生长条件一致，对于减少转录因子结合及后续测序结果的变异性非常重要。如果能够仔细确保接种量和接种前的培养条件一致，则在摇瓶培养中形成的生物膜生长也具有一致性4。必须确认均质化后所有生物膜均已彻底分散，以确保试剂（特别是甲醛交联剂）能够均等地作用于所有细胞。
若干修改可使研究人员将本方案用于其他DNA结合蛋白、细胞类型、菌株、培养条件或实验室设备。若将本方案用于除S. Typhimurium以外的生物膜形成菌种，则需通过实验确定每单位生物膜重量对应的菌落形成单位（CFU）换算系数：需收集不同量的生物膜，充分匀浆后进行系列稀释和平板计数，以建立标准曲线；但在生物膜重量较低时，该曲线可能不够准确2。超声能量传递效率及细胞类型对抗性可能存在差异，因此建议进行超声破碎实验，以确定能够产生适用于后续文库构建和测序所需片段大小范围的超声脉冲次数11。使用微球菌核酸酶进行染色质片段化是超声破碎的一种替代方法，可获得更高分辨率的结合位点信息；但该方法可能引入片段化偏好性偏差7,28。DNA片段大小范围可根据后续文库构建试剂盒和测序平台的要求进行调整。其他匀浆方法也可替代混合研磨仪使用，例如可用玻璃组织匀浆器替代，但可能存在气溶胶风险或无法完全破碎生物膜。在对照设置方面，免疫沉淀前的DNA可在测序后的数据处理与分析过程中进行归一化；此外，也可使用同物种匹配的正常抗体血清进行模拟免疫沉淀（mock-IP）作为对照13。
研究人员在考虑进行ChIP-seq实验时，必须注意该方法的局限性。若要将其应用于其他类型的生物膜，可能需要进行重大修改。例如，在立即用PBS重悬伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）生物膜时，会导致生物膜聚集体的明显损失。针对细菌中转录因子调控靶点的免疫沉淀可能获得极少量的DNA，这在后续纯化和检测步骤中构成挑战。在片段化处理以及文库检测过程中的下游操作可能引入偏差9。此外，该方法无法揭示转录因子结合后体内基因表达水平的变化。对于生物信息学经验较少的研究人员而言，数据分析流程可能具有挑战性。该方法可能耗时较长且成本较高；然而，随着技术不断进步，测序成本通常低于微阵列，并且呈持续下降趋势。
文献中描述细菌染色质免疫沉淀（ChIP）的方法较少，大多数细菌实验始于简单的培养条件13,14,15,17,18。使用单细胞进行ChIP样品制备较为直接，相较于使用生物膜聚集体的ChIP样品制备所面临的挑战更少。对于ChIP-seq而言，以往研究顺式调控回路的方法，包括指数富集配体系统进化（SELEX）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、ChIP-chip、启动子缺失及报告基因分析等，已被ChIP-seq补充或取代29。由于测序技术的进步和测序资源的可及性，ChIP-seq正逐步取代ChIP-chip。深度测序使研究人员能够获得大量数据，相比ChIP-chip，可在起始材料更少的情况下识别出结合亲和力较低且具有更高碱基对分辨率的结合位点11,30。对具有高质量参考基因组的生物体的ChIP数据进行分析通常快速且特异性强。此外，ChIP-seq是一种全面的方法，可用于发现那些通过计算机预测存在但可能在所有细胞类型、生长阶段或环境条件下均未被占据的结合位点31。
未来，该方案可用于促进对细菌致病机制的理解，特别是形成生物膜的微生物。该技术的广泛应用以及新数据集的可获取性，有助于整合数据以鉴定在形成生物膜的微生物中共同定位并调控细胞过程的蛋白质群组32。此外，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）与RNA测序（RNA-seq）数据可进行整合，以构建基因调控系统模型33。
披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本研究得到了自然科学与工程研究理事会（NSERC）向 AW 提供的资助（#2017-05737）以及 Jarislowsky 生物技术讲席基金的支持。MP 获得了萨斯喀彻温大学传染病、食品安全与公共政策综合培训项目（ITraP）提供的 NSERC-CREATE 奖学金支持。
作者感谢 Dani Dale 负责拍摄与剪辑。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖粉末 | FroggaBio | A87-500G | |
| 电子天平（Explorer pro） | Ohaus | EP214 | |
| 台式离心机（8510R） | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA 检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP级蛋白G磁珠 | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| 15 mL锥形管 | FroggaBio | TB15-500 | |
| 50 mL锥形管 | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC蛋白定量检测试剂盒II | BioRad | 5000112 | |
| 一次性比色皿，1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| 电泳设备（mini-PROTEAN） | Bio-Rad | 1658000 | |
| 落地式离心机（Sorvall Evolution RC） | Thermo Scientific | 728211 | |
| 荧光计（Qubit 3.0） | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® 核酸凝胶染料，水溶液，10 000倍 | Biotium | 41003 | |
| 高灵敏度DNA检测试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| 摇床培养箱 | VWR | 1570-ZZMFG | |
| 水浴摇床 | New Brunswick | G76D | |
| LB培养基 | VWR | 90000-808 | |
| 磁力架（DynaMag） | Fisher Scientific | 12321D | |
| 微量离心机（带制冷） | Eppendorf | 5415R | |
| 1.5 mL微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq试剂盒v3（150个循环） | Illumina | MS-102-3001 | |
| 混合研磨仪 | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL滤器单元，无菌，0.2 µm孔径 | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina） | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS纯化与片段筛选磁珠 | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| 正常小鼠血清 | AbCam | ab188776 | |
| 带透明盖的培养皿（100 mm × 15 mm） | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 移液控制器 | FroggaBio | MP001 | |
| 蛋白酶K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| 兔抗FLAG多克隆抗体 | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A（10 mg/mL；无DNase和蛋白酶） | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| 旋转轮 | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| 安全锁扣管（2.0 mL，无色） | Eppendorf | 22363344 | |
| 25 mL血清移液管 | FroggaBio | 94024 | |
| 分光光度计 | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| 5 mm不锈钢研磨珠 | Qiagen | 69989 | |
| 锥形微头1/8"（3 mm）超声探头 | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| 胰蛋白胨培养基 | VWR | 90000-286 | |
| 超声波液体处理器（超声仪） | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| 真空浓缩仪（Vacufuge plus） | Eppendorf | 022820001 | |
| 水浴锅1（Lab-line aquabath） | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| 水浴锅2（Precision） | Thermo Scientific | 51221044 |
参考文献
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).
- Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).
- MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307(2017).
- Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169(2015).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).
- Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).
- Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).
- Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).
- Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5 (1), 10469(2015).
- Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621(2012).
- Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10 (3), 1003984(2014).
- Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).
- Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15 (6), 1008233(2019).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6 (10), 26015(2011).
- Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).
- Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298 (5594), 799-804 (2002).
- Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).
- Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).
重印与许可
标签
