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方法文章

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

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DOI：

10.3791/60738

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2020年1月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

构建具有理想亲和力和特异性的、可被任意给定小分子配体化学诱导的蛋白质二聚化系统，在生物学检测与调控方面具有广泛的应用前景。本文中，我们描述了一种高效且可推广的从头设计化学诱导二聚化系统的方法，该方法通过逐步筛选噬菌体展示的组合型单域抗体文库来实现。

摘要

仅在小分子配体存在时发生的蛋白质二聚化事件，能够推动用于解析和调控生物通路的小分子生物传感器的开发。目前，化学诱导二聚化（CID）系统种类有限，针对特定小分子配体设计具有理想灵敏度和选择性的新型CID系统仍是蛋白质工程领域的一大挑战。本文介绍一种高通量筛选方法——combinatorial binders-enabled selection of CID（COMBINES-CID，组合型结合剂介导的CID筛选法），可用于从头设计适用于多种配体的CID系统。该方法通过两步筛选噬菌体展示的组合纳米抗体文库，首先获得1）"锚定结合剂"，即能够优先结合目标配体的分子；随后获得2）"二聚化结合剂"，即仅特异性结合锚定结合剂-配体复合物的分子。为筛选锚定结合剂，采用含超过109个互补决定区（CDR）随机化的纳米抗体组合文库，利用生物素标记的配体进行筛选，并通过生物层干涉技术（BLI）使用未标记配体验证阳性克隆。为获得二聚化结合剂，以锚定结合剂-配体复合物作为正向筛选靶标，同时以未结合配体的锚定结合剂作为负向筛选对照，对纳米抗体文库进行筛选。COMBINES-CID方法具有广泛适用性，可用于其他免疫球蛋白、非免疫球蛋白或计算设计支架结构的CID结合剂筛选，从而构建用于体外及体内药物、代谢物、信号分子等检测的生物传感器。

引言

化学诱导二聚化（CID）系统是指两种蛋白质仅在小分子配体存在下才会发生二聚化的体系（图1），可用于解析和调控代谢、信号转导及其他生物通路，是一种多功能工具1。该系统已在生物调控方面展现出应用潜力，例如通过药物控制T细胞激活2以及诱导细胞凋亡3,4，从而提高过继性T细胞治疗的安全性和有效性。此外，该系统还为小分子靶标的体内或体外检测提供了新方法。例如，可将CID蛋白与荧光报告系统（如荧光共振能量转移（FRET）5和环状重排荧光蛋白）6进行基因融合，用于活体实时检测；或作为亲和试剂，应用于类似夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测方法中。

尽管化学诱导二聚化（CID）系统具有广泛的应用前景，但构建可由特定小分子配体调控的新型CID系统仍面临重大挑战。已建立的蛋白质结合物工程方法，包括动物免疫7、体外筛选8,9和计算蛋白质设计10，能够生成通过二元蛋白质-配体相互作用发挥功能的配体结合蛋白。然而，这些方法在构建配体诱导的三元CID复合物方面存在困难。某些方法通过化学连接两个可独立结合同一或不同蛋白质的配体来实现CID11,12,13,14,15,16，或依赖于筛选能够识别预先存在的小分子-蛋白质复合物的结合蛋白（如抗体）17,18，因此其可选用的配体种类有限。

我们近期开发了一种用于从头设计化学诱导二聚（CID）系统的新方法——combinatorial binders-enabled selection of CID（COMBINES-CID）方法19。该方法可实现配体诱导二聚的高特异性（例如，锚定二聚化结合物的解离常数，KD（无配体）/KD（有配体）> 1,000）。这种二聚特异性是通过使用具有柔性结合位点的锚定结合物实现的，这些结合位点在配体结合后可发生构象变化，从而为筛选仅识别配体结合态锚定物的构象选择性结合物提供了基础。我们通过构建大麻二酚（CBD）诱导的纳米抗体异源二聚体，验证了该方法的可行性。纳米抗体是来源于骆驼科动物的一种12–15 kDa功能性抗体片段，具有通用支架结构和三个柔性CDR环（图2）20，可形成大小可调的结合口袋，适用于小分子表位21,22。值得注意的是，体外筛选组合蛋白文库的方法应具备成本效益且具有普适性，因为同一高质量文库可应用于不同配体的CID系统构建。

在本实验方案及视频中，我们重点描述通过使用CBD作为靶标，对多样性超过109的组合纳米抗体文库进行筛选，从而体外两步筛选并验证锚定结合物（图3A）和二聚化结合物（图3B）的方法；但该方案同样适用于其他蛋白质文库或小分子靶标。CID结合物的筛选通常需要6–10周（图4）。

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方案

1. 文库构建

  1. 使用多样性约为 1.23–7.14 × 109 的合成组合单域抗体文库，如先前所述19。尽管本方案未包含文库构建步骤，但也可应用于其他组合型结合蛋白文库。

2. 配体靶标或配体的生物素标记

  1. 根据靶标上合适的生物素化位点，通过不同的化学合成策略对选定的配体进行生物素标记，例如大麻二酚（CBD）和四氢大麻酚（THC）19。

3. 锚定结合剂筛选

  1. 筛选起始
    1. 每轮筛选开始时，挑取一个新鲜培养的 TG1 细胞单菌落，接种于 6 mL 2YT 培养基中，在 37 ˚C、250 转/分钟（rpm）条件下培养至 600 nm 波长处吸光度（OD600）约为 0.5。将细胞置于冰上孵育，用于步骤 3.5.1。
  2. 使用生物素结合链霉亲和素磁珠进行阴性筛选
    1. 使用磁性分离架清洗 300 µL 链霉亲和素包被的磁珠，用含 0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST，即 1 × PBS 加 0.05% vol/vol Tween 20）洗涤 3 次，再用 1 × PBS 洗涤 2 次，以制备“阴性筛选磁珠”。
    2. 将磁珠重悬于 1 mL 含 1% 酪蛋白的 1 × PBS（pH = 7.4）中，并加入推荐结合容量 5 倍量的 生物素 以饱和磁珠结合位点。在室温（RT）下旋转孵育 1 小时。
    3. 用 0.05% PBST 洗涤 5 次，再用 1 × PBS 洗涤 3 次，共洗涤 8 次。
    4. 加入约 1013 个噬菌体颗粒，溶于含 1% 酪蛋白/1% BSA 的 1 × PBS（pH = 7.4）中，在室温下旋转孵育 1 小时。
    5. 孵育后，收集上清液，用于步骤 3.3.6。
  3. 使用生物素化配体结合链霉亲和素磁珠进行阳性筛选
    1. 按照步骤 3.2.1 的方法，使用“阴性筛选磁珠”所用体积的一半来制备“阳性筛选磁珠”。
    2. 将磁珠重悬于 1 mL 含 1% 酪蛋白的 1 × PBS（pH 7.4）中，并根据说明书计算的完全结合容量，加入所选 生物素化配体 的 5 倍量以饱和磁珠。在室温下旋转孵育 1 小时。
    3. 用 0.05% PBST 洗涤 5 次，再用 1 × PBS 洗涤 3 次，共洗涤 8 次。
    4. 用 1 mL 含 1% 酪蛋白/1% BSA 的 1 × PBS（pH = 7.4）封闭磁珠，在室温下旋转孵育 1 小时，以防止噬菌体与链霉亲和素包被磁珠之间的非特异性结合。
    5. 用 0.05% PBST 洗涤 3 次，再用 1 × PBS 洗涤 1 次，共洗涤 4 次。
    6. 使用步骤 3.3.5 中获得的未结合噬菌体重悬链霉亲和素包被磁珠，在室温下旋转孵育 1 小时。
    7. 小心吸出上清液，避免扰动磁珠。将未结合的噬菌体保存为“输入”样品，用于步骤 3.5.1。
    8. 用 0.05% PBST 洗涤 10 次，再用 1 × PBS 洗涤 5 次。每洗涤三次后，将磁珠转移至新离心管中，以避免噬菌体非特异性吸附在管壁上。
  4. 噬菌体展示纳米抗体的洗脱
    1. 通过加入 450 µL 的 非生物素化配体 进行竞争性洗脱，配体浓度为微摩尔范围（例如 10–50 µM），在室温下旋转孵育 30 分钟。用于竞争性洗脱结合噬菌体的配体浓度取决于目标“锚定结合剂”的期望 KD 值。在初始筛选轮次中可使用相对较高的配体浓度，随后在后续轮次中逐步降低。
    2. 收集上清液，将洗脱的噬菌体保存为“输出”样品，用于步骤 3.5.2。
  5. 输入/输出滴定与感染
    1. 对于输入滴定，将步骤 3.3.7 中获得的输入噬菌体用 1 × PBS 进行 10 倍系列稀释，最高稀释至 109 倍。取 107–109 稀释度的样品，分别取 10 µL 加入 70 µL TG1 细胞（OD600 约为 0.5）中进行感染。37 ˚C 孵育 45 分钟后，将感染后的 TG1 细胞涂布于三块含 100 μg/mL 氨苄青霉素和 2%（wt/vol）葡萄糖的 90 mm 2YT 琼脂平板上，37 ˚C 过夜培养。根据过夜培养的平板，噬菌体输入量可按以下公式计算：
      噬菌体滴度方程，生物淘选方法，噬菌体展示实验设置，菌落计数公式。
    2. 对于输出感染与滴定，将步骤 3.4.2 中获得的洗脱噬菌体加入 3 mL TG1 细胞（OD600 约为 0.5）中。在 37 ˚C 水浴中孵育 45 分钟。然后在 2YT 培养基中进行 10 倍系列稀释，最高稀释至 103 倍，将各稀释液涂布于 90 mm 2YT 琼脂平板上，37 ˚C 过夜培养。根据过夜培养的平板，噬菌体输出量可按以下公式计算：
      噬菌体滴度方程，生物淘选方法，噬菌体展示实验设置，菌落计数公式。
    3. 将剩余的感染后 TG1 细胞涂布于三块含 100 μg/mL 氨苄青霉素和 2%（wt/vol）葡萄糖的 150 mm 2YT 琼脂平板上，37 ˚C 过夜培养。
  6. 文库扩增与回收，用于后续筛选轮次
    1. 每块平板加入 3 mL 2YT，用无菌细胞刮刀刮下菌苔，将所有细胞收集至 50 mL 锥形管中。加入无菌甘油使终浓度为 20%（wt/vol）。测定混合液的 OD600，分装成 3–5 份储备液。长期保存于 -80 ˚C。
    2. 进行噬菌体拯救时，将含噬菌粒的 TG1 菌液用添加了 2% 葡萄糖和 100 μg/mL 氨苄青霉素的 2YT 培养基稀释至 OD600 约为 0.1。在 37 ˚C、250 rpm 条件下培养至 OD600 约为 0.5。
    3. 加入 CM13 辅助噬菌体至终浓度为 5 × 109 pfu/mL，进行超感染，在 37 ˚C、250 rpm 条件下孵育 45 分钟。CM13 辅助噬菌体提供组装完整噬菌体颗粒所需的噬菌体外壳蛋白。
    4. 在 8,000 × g 条件下离心 10 分钟，去除葡萄糖。将细胞重悬于 50 mL 添加了 100 μg/mL 氨苄青霉素和 50 μg/mL 卡那霉素的 2YT 培养基中，在 25 ˚C、250 rpm 条件下过夜培养。
    5. 将过夜培养物在 9,000 × g、4 ˚C 条件下离心 30 分钟。将上清液转移至新离心管中，加入 1/5 体积的 PEG/NaCl 溶液（含 20% wt/vol 聚乙二醇-6,000 和 2.5 M NaCl）沉淀上清液中的噬菌体。轻轻混匀后置于冰上 1 小时。
    6. 在 12,000 × g、4 ˚C 条件下离心 30 分钟收集噬菌体颗粒。将沉淀用 1 mL 1 × PBS 重悬，转移至微量离心管中。在 20,000 × g、4 ˚C 条件下离心 10 分钟，以去除残留细菌。
    7. 将上清液转移至新的微量离心管中，避免扰动细菌沉淀。取 1:100 稀释液测定 269 nm 和 320 nm 处的吸光度。噬菌体总数可按以下公式23计算：
      噬菌体滴度计算公式图示，利用吸光度和载体大小计算每毫升噬菌体数量。
    8. 噬菌体文库可短期保存于 4 ˚C，或加入 25% 甘油后长期保存于 -80 ˚C。
    9. 重复筛选过程（步骤 3.1–3.6）3–6 轮，或直至观察到理想的富集效果（参见结果部分）。随后进行平板培养并挑取单克隆（第 4 节），以表征其对配体的亲和力与特异性（第 5–7 节）。

4. 单克隆分离

  1. 为从富集的亚文库中分离单个克隆，制备噬菌体感染的TG1细胞的10倍系列稀释液（步骤3.5.2）。将系列稀释液接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素和2%（wt/vol）葡萄糖的90 mm 2YT-琼脂平板上，37 ˚C过夜培养。
  2. 从过夜培养的平板上挑取单菌落，分别接种至每孔含有250 μL添加了100 μg/mL氨苄青霉素的2YT培养基的无菌深孔板中，37 ˚C过夜培养。
  3. 从过夜培养物中取10 µL接种至500 µL新鲜的添加了100 μg/mL氨苄青霉素的2YT培养基中。
  4. 将细胞培养至OD600约为0.5，加入CM13辅助噬菌体至终浓度5 x 109 pfu/mL，在37 ˚C、250 rpm条件下孵育45分钟。
  5. 加入500 µL添加了100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素的2YT培养基。在25 ˚C、250 rpm条件下过夜孵育。
  6. 将过夜培养的深孔板以3,000 x g离心10分钟。收集上清液（含噬菌体颗粒），注意不要扰动菌体沉淀。
  7. 噬菌体颗粒可用于ELISA实验，以确定所选克隆对配体的特异性。可使用生物素或靶标的结构类似物作为阴性对照。

5. 通过 ELISA 验证锚定结合剂

  1. 使用包被缓冲液（100 mM 碳酸盐缓冲液，pH = 8.6）中浓度为 5 μg/mL 的链霉亲和素 100 μL，在 4 °C 过夜包被 96 孔 ELISA 板。
  2. 用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 3 次，向目标孔中加入 100 μL 浓度为 1 μM 的生物素化靶标；向对照孔中加入 100 μL 浓度为 1 μM 的生物素或靶标同源物。室温孵育 1 小时。
  3. 用 0.05% PBST 洗涤 5 次，通过每孔加入 300 µL 含 1% 酪蛋白的 1 × PBS 封闭非特异性结合位点。室温孵育 1 小时。
  4. 用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 3 次，加入纯化的噬菌体上清液。室温孵育 1 小时。
  5. 用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 10 次，每孔加入 100 μL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的 M13 主要外壳蛋白抗体（用含 1% 酪蛋白的 1 × PBS 稀释至 1:10,000）。室温孵育 1 小时。
  6. 用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 3 次，每孔加入 100 μL 四甲基联苯胺（TMB）底物。孵育 10 分钟或直至观察到明显的颜色变化。加入 100 μL 1 M HCl 终止反应。在分光光度计上于 450 nm 处读取吸光值。
  7. 对于蛋白表达与纯化，选择对靶标具有高亲和力和特异性的克隆（见讨论部分）。

6. 蛋白质表达、纯化和生物素标记

  1. 如先前报道19，从第5节中选择亚克隆克隆，并表达为C端带有Avi标签和His标签的纳米抗体。
  2. 在大肠杆菌WK6细胞的周质空间中表达所选纳米抗体（通常在1 L培养体系中），通过渗透休克法释放，并使用镍-NTA柱进行纯化（参见材料表）。
  3. 使用脱盐柱更换缓冲液（1 × PBS含5%甘油；参见材料表）。
  4. 使用商用试剂盒对纳米抗体进行生物素标记，以用于后续实验（参见材料表）。

7. 通过BLI表征锚定结合剂

  1. 通过将200 nM生物素标记的锚定结合物固定在链霉亲和素生物传感器上（参见材料表），使用结合测定缓冲液（1 × PBS（pH = 7.4）、0.05% Tween 20、0.2% BSA、3%甲醇）分析所选锚定结合物的结合亲和力和动力学。
  2. 使用数据分析软件（参见材料表）通过稳态分析计算锚定结合物-配体相互作用的解离常数（KD）。获得的KD值通常在单至双位数微摩尔范围内。

8. 二聚体结合剂筛选

注意：二聚化结合物的生物淘选筛选过程与锚定结合物的筛选类似，但有两个关键步骤不同：1）分别使用已选定的生物素标记锚定结合物和锚定结合物-配体复合物进行阴性筛选和阳性筛选，以筛选出二聚化结合物。2）在洗脱步骤中，使用 100 mM 三乙胺洗脱仅与锚定结合物-配体靶标复合物结合的阳性噬菌体。采用 100 mM 三甲胺溶液（pH = 11.5）通过破坏蛋白质相互作用来洗脱阳性克隆。

  1. 开始筛选
    1. 每轮筛选开始时，挑取一个在最低培养基上新鲜培养的 TG1 单菌落，接种于 6 mL 2YT 培养基中，在 37 °C、250 rpm 条件下培养至 OD600 约为 0.5。随后将细胞置于冰上孵育。
  2. 去除负向筛选的纳米抗体
    1. 使用 400 µL 链霉亲和素包被的磁珠制备“去除管”，并按照步骤 3.2 操作。但与用生物素饱和不同，此处加入所选的 生物素化锚定结合剂，用量为计算出的完全结合容量的 5 倍，并保留未结合的噬菌体，用于步骤 8.3.3。
  3. 正向筛选纳米抗体
    1. 使用“去除管”所用链霉亲和素包被磁珠体积的一半，按照步骤 3.3.2 至 3.3.3 制备“捕获管”。但与加入生物素化配体不同，此处加入所选的 生物素化锚定结合剂，用量为计算出的完全结合容量的 5 倍。
    2. 为形成正向二聚化结合剂筛选所需的锚定结合剂-配体复合物，加入足够高浓度的 非生物素化配体，以确保大多数与链霉亲和素结合的锚定结合剂能够形成配体结合复合物。
    3. 使用来自“去除管”的未结合噬菌体，按照步骤 3.3.3 至 3.3.8 操作。
  4. 洗脱正向筛选的纳米抗体
    1. 加入 450 µL 100 mM 三乙胺，于室温在旋转仪上孵育 10 分钟，以洗脱结合在锚定结合剂-配体复合物上的噬菌体。
    2. 收集竞争性洗脱的噬菌体，并按照步骤 3.4.1 至 3.4.2 操作。
  5. 进一步进行二聚化结合剂筛选
    1. 按照步骤 3.5 和 3.6 扩增并回收文库，以进行后续多轮筛选。重复筛选 3–6 轮，或直至观察到理想的富集效果。随后进行平板培养并挑取单克隆（参见第 4 节），以表征其对靶标的亲和力和特异性。

9. 通过 ELISA 表征二聚体结合剂

  1. 按照第4节中的步骤分离单个克隆，并通过ELISA进行表征。
  2. 为检测二聚化结合候选分子对锚定结合剂-配体复合物的亲和力，使用100 μL浓度为100 nM的生物素化锚定结合剂包被ELISA靶标板。孵育1小时后，加入1 μM的配体靶标以形成锚定结合剂-配体复合物。
  3. 对照板应仅使用生物素化锚定结合剂进行包被，以排除能够与游离锚定结合剂结合的克隆。加入100 μL浓度为100 nM的生物素化锚定结合剂，在室温下孵育1小时。
  4. 按照第5.3–5.7节操作。

10. 通过BLI表征二聚体结合剂

  1. 通过将生物素标记的二聚化结合剂固定在链霉亲和素（SA）生物传感器上，并使用结合缓冲液进行孵育，随后检测其与锚定结合剂-配体复合物的结合亲和力和动力学参数 1 μM 配体梯度稀释液预平衡的锚定结合剂。 KD, k在，以及 k关闭 相互作用的计算可使用我们报道的方法进行19.

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结果

我们描述了通过使用CBD作为靶标，从多样性超过109的组合纳米抗体文库中进行筛选，从而在体外分两步筛选并验证锚定结合物和二聚化结合物的方法。在连续多轮筛选过程中，评估噬菌体生物淘选中锚定结合物和二聚化结合物的富集情况至关重要。如图5所示，在经过4–6轮筛选后典型的富集结果表明，亚文库中潜在阳性克隆的比例较高，因此可能无需进行更多轮次的筛选。

单克隆ELISA适用于分析锚定结合物和二聚化结合物的相对结合亲和力与选择性。图6A展示了经过六轮生物淘选后典型的锚定结合物筛选结果。可比较表现出高（例如 #87）或低（例如 #27）配体选择性的克隆。应选择具有高选择性的克隆作为锚定结合物候选物。同样，图6B展示了经过四轮生物淘选后的二聚化结合物筛选结果。我们通常观察到某些克隆仅在存在配体时（例如 #49）或在无配体时（例如 #8...

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讨论

在不同轮次的生物淘选中，选择输入噬菌体文库的正确浓度至关重要。我们通常起始于约 1012–1013 个噬菌体颗粒的输入文库，其多样性>109，以确保在下拉实验中每种噬菌体克隆大约有 100–1,000 个拷贝被展示。如果结合实验中的噬菌体浓度过高或过低，则非特异性结合或丢失阳性克隆的可能性将增加。锚定分子或二聚化结合剂的筛选通常包括三到六轮生物淘选，输出的噬菌体数量通常从约 104 开始，逐渐增加至约 108–109。在观察到此类富集后，适合挑选单克隆进行 ELISA 验证。额外增加淘选轮次可能会降低发现丰度较低但合适的阳性克隆的机会。

设置适当的阴性对照和筛选条件对于提高筛选成功率至关重要。例如，使用配体靶标的结构类似物有助于筛选出具有配体特异性的结合物。在我们的研究中，在ELISA和BLI验证锚定结合物及二聚化结合物时，使用了与CBD高度相似的类似物THC作为对照19。在二聚化结合物的筛选过程...

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披露

华盛顿大学已就本研究相关技术提交了临时专利申请。

致谢

本工作得到了华盛顿大学创新奖（授予 L.G.）、美国国立卫生研究院基金（1R35GM128918，授予 L.G.）以及华盛顿大学启动资金（授予 L.G.）的支持。H.J. 获得了华盛顿研究基金会本科生奖学金的支持。K.W. 获得了华盛顿大学蛋白质设计研究所本科生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-Step Ultra TMB ELISA 底物溶液Thermo Fisher Scientific34029
琼脂Thermo Fisher ScientificBP1423-2
Amicon Ultra-15 离心滤过装置（3 kDa 截留分子量）MilliporeUFC900324
氨苄青霉素Thermo Fisher ScientificBP1760-25
Bio-Rad 蛋白定量检测试剂盒 IIBio-Rad5000002
BirA 生物素-蛋白连接酶标准反应试剂盒AvidityBirA500
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA2153-50G
酪蛋白Sigma-AldrichC7078-1KG
CM13 辅助噬菌体Antibody Design LabsPH020L
D-(+)-葡萄糖一水合物Alfa AesarA11090
Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠Thermo Fisher Scientific11205D
DynaMag-2 磁力架Thermo Fisher Scientific12321D
EDTAThermo Fisher ScientificBP120-1
Fast DNA LadderNew England BiolabsN3238S
FastDigest BglIThermo Fisher ScientificFD0074
甘油Thermo Fisher ScientificBP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335
HiPrep 26/10 脱盐柱GE Healthcare17508701
HisTrap-FF-1mlGE Healthcare11000458
咪唑Alfa Aesar161-0718
IPTGThermo Fisher Scientific34060
卡那霉素Thermo Fisher ScientificBP906-5
M13 主要衣壳蛋白抗体Santa Cruz Biotechnologysc-53004
NaClSigma-AldrichS3014-500G
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-2000
Nunc 96 孔聚丙烯深孔储存板Thermo Fisher Scientific260251
Nunc MaxiSorpThermo Fisher Scientific44-2404-21
Octet RED96ForteBioN/A
pADL-23c 噬菌粒载体Antibody Design LabsPD0111
PEG-6000Sigma-Aldrich81260-1KG
Platinum SuperFi DNA 聚合酶Invitrogen12351010
PureLink PCR 纯化试剂盒Thermo Fisher ScientificK310001
QIAprep Spin M13 试剂盒Qiagen27704
恢复培养基Lucigen80026-1
SpectraMax Plus 384Molecular DevicesN/A
蔗糖Sigma-AldrichS0389-1KG
超级链霉亲和素（SSA）生物传感器ForteBio18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL 柱GE Healthcare28-9909-44
T4 DNA 连接酶Thermo Fisher Scientific15224-025
TG1 电转感受态细胞Lucigen60502-1
三乙胺Sigma-Aldrich471283-100mL
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
胰蛋白胨Thermo Fisher ScientificBP9726-5
Tween 20Thermo Fisher ScientificBP337-500
酵母提取物Thermo Fisher ScientificBP1422-2
Zeba Spin 脱盐柱Thermo Fisher Scientific89882

参考文献

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