视觉GPCR-mini-G蛋白信号复合物的策略性筛选与表征以实现成功结晶

摘要

本报告介绍了为制备视觉G蛋白偶联受体视紫红质及其与mini-G_o的复合物而筛选不同去垢剂的方法。文中展示了在纯化过程中不同阶段用于表征复合物质量的生化方法。该方案可推广至其他膜蛋白复合物，为其未来的结构研究提供参考。

摘要

确定膜蛋白复合物晶体结构的关键在于结晶前样品的质量。特别是去垢剂的选择至关重要，因为它会影响复合物的稳定性和单分散性。我们最近解析了牛视紫红质活性状态与工程化G蛋白mini-G_o结合的晶体结构，分辨率达到3.1 Å。本文详细描述了优化视紫红质–mini-G_o复合物制备的流程。在经典去垢剂和新戊二醇（NPG）类去垢剂中制备暗态视紫红质，随后在光照条件下与mini-G_o形成复合物。通过紫外-可见光谱（UV-VIS）检测对光敏感配体9-顺式视黄醛重新结合生成视紫红质的过程，以评估视紫红质的稳定性。采用自动化的尺寸排阻色谱（SEC）分析视紫红质及其与mini-G_o复合物的单分散性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）经考马斯亮蓝染色后确认复合物的形成，显示视紫红质与mini-G_o之间存在1:1的摩尔比。在交叉验证所有分析数据后，我们排除了不合适的去垢剂，并选用最佳候选去垢剂进行大规模制备和结晶。另一个问题来自N-糖基化的异质性。异源表达的视紫红质在SDS-PAGE上显示出两种不同的N-糖基化形式，这可能会阻碍晶体生长。因此，测试了多种去糖基化酶，其中内切糖苷酶F1（EndoF1）处理后获得了仅含单一N-糖基化形式的视紫红质。通过这一系统性的蛋白质质量表征策略，成功优化了视紫红质–mini-G_o复合物的制备，最终获得了晶体结构。这是继之前两例之后第三个被解析的GPCR–G蛋白信号复合物晶体结构。该策略也可推广应用于其他膜蛋白及其复合物，以促进样品制备和结构解析。

引言

确定膜蛋白及其复合物的晶体结构一直具有挑战性，其主要困难在于难以获得高质量的衍射晶体。与可溶性蛋白不同，内在膜蛋白包含一个跨越细胞膜的疏水核心。为了将膜蛋白从细胞膜中提取至水相缓冲液中，必须使用去垢剂形成去垢剂-蛋白胶束，从而取代包围膜蛋白疏水核心的脂质分子。膜蛋白的稳定性、活性和完整性直接依赖于去垢剂的化学和结构特性¹，而去垢剂的性质也决定了胶束的大小。过大的去垢剂胶束可能遮蔽小分子量膜蛋白的亲水表面，从而在使用蒸汽扩散法时因缺乏晶体接触而阻碍结晶。较小的去垢剂胶束有利于晶体学研究，但短链去垢剂通常较为剧烈，容易导致膜蛋白失稳和聚集。因此，在结晶前，额外的去垢剂筛选步骤必不可少，通常需寻找仍能维持蛋白稳定性的较短链去垢剂。

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类含有七个跨膜α-螺旋的整合膜蛋白。GPCRs主要存在两种状态：一种是被反向激动剂或拮抗剂稳定化的非活性状态，另一种是与激动剂结合并由G蛋白稳定化的活性状态，尽管在这两种极端状态之间很可能存在多种亚状态。由于非活性状态比活性状态更稳定，早期对GPCRs的结构解析主要集中于与反向激动剂和拮抗剂结合的非活性状态²。当GPCRs与激动剂结合而被激活时，受体表现出高度动态性，并在受体的胞质面瞬时形成一个供G蛋白结合的裂隙。这种动态特性被认为是激动剂结合的GPCRs通常比非活性状态更不稳定的原因。因此，针对所研究受体的构象状态筛选合适的去垢剂变得至关重要，因为研究活性状态可能需要比研究非活性状态更温和的去垢剂。

在本报告中，我们采用视觉G蛋白偶联受体——牛视紫红质³及其与mini-G_o蛋白的复合物^4,5进行去垢剂筛选实验，分别代表非活性状态和活性状态。去垢剂筛选主要针对经典的烷基麦芽糖苷和葡萄糖苷类去垢剂，以及新戊二醇（NPG）类去垢剂。在此背景下，经典去垢剂由一个糖基头部基团和一条烷基链构成，而NPG型去垢剂则包含两个相同的经典去垢剂分子，二者通过糖基与烷基链之间的季碳原子连接而成^6,7,8。

实验流程从在不同去垢剂中纯化视紫红质开始，随后形成视紫红质–mini-G_o复合物，最后通过多种方法对复合物进行表征（图1）。对于视紫红质的非活性状态，通过紫外-可见光谱法（UV-VIS）监测对光敏感配体9-顺式视黄醛的重组情况。该光谱可揭示视黄醛的物理化学状态，并反映其在视紫红质视黄醛结合口袋中的微环境。采用尺寸排阻色谱法（SEC）评估纯化后视紫红质的单分散性以及视紫红质–mini-G_o复合物的形成情况。由于SEC可根据蛋白质分子的大小和形状进行分离，聚集的蛋白质组分会在空体积中洗脱，因而可被识别。为确认复合物的形成，对SEC洗脱组分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，以验证视紫红质和mini-G_o是否同时存在。

另一个需要考虑的因素是膜蛋白的翻译后修饰（PTM）。在哺乳动物和昆虫细胞表达系统中产生的真核膜蛋白上，常可观察到N-糖基化等PTM修饰。通过敲除编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I（GnTI）的基因，已构建出一种人胚胎肾293（HEK293）细胞的有限N-糖基化菌株，该菌株可在保守位点Asn-X-Ser/Thr处均一地添加GlcNAc₂Man₅型N-糖链。尽管可通过突变保守位点中的氨基酸残基来阻止N-糖基化，但这可能同时改变蛋白质的功能或折叠效率。在牛视紫红质中，N-糖基化位点Asn15的突变会导致错误折叠以及G蛋白激活能力下降^9,10。本报告中使用的视紫红质是在HEK 293 GnTI缺陷型细胞系中表达的。然而，SDS-PAGE结果显示存在两种形式的视紫红质。这种异质性可能阻碍晶体形成，因此尝试使用肽-N-糖苷酶F（PNGase F）和内切糖苷酶F1（Endo F1）进行去糖基化处理。通过SDS-PAGE和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对去糖基化产物进行表征，以确定糖基化水平及其均一性。

方案

注意：本去垢剂筛选方案以 30 g HEK293 细胞沉淀作为起始材料进行详细说明。

1. 材料、化学品和试剂

注意：所有溶液均使用分析纯试剂和超纯水配制，超纯水由去离子水进一步纯化获得，在 25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ∙cm。

1. 缓冲液储备溶液
   1. 配制 10 倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）。
   2. 配制 HEPES 缓冲液：1 M，用 NaOH 调节至 pH 7.5。
   3. 配制 5 M NaCl 溶液。
   4. 配制 2 M MgCl₂ 溶液。
      注意：所有储备溶液均需通过 0.22 μm 滤膜过滤，以保持无菌状态。
2. 去垢剂储备溶液
   1. 配制十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶液，10%（w/v）。
   2. 配制癸基麦芽糖苷（DM）溶液，10%（w/v）。
   3. 配制 6-环己基己基麦芽糖苷（Cymal-6）溶液，10%（w/v）。
   4. 配制 5-环己基戊基麦芽糖苷（Cymal-5）溶液，10%（w/v）。
   5. 配制壬基葡萄糖苷（C9G）溶液，10%（w/v）。
   6. 配制月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG）溶液，5%（w/v）。
   7. 配制癸基麦芽糖新戊二醇（DMNG）溶液，10%（w/v）。
   8. 配制 Cymal-6 新戊二醇（C6NG）溶液，10%（w/v）。
   9. 配制 Cymal-5 新戊二醇（C5NG）溶液，10%（w/v）。
   10. 配制辛基葡萄糖新戊二醇（OGNG）溶液，10%（w/v）。
       注意：配制 10% 去垢剂储备溶液时，将 1 g 去垢剂粉末溶于超纯水中，轻轻摇动助溶，然后定容至 10 mL。去垢剂储备溶液应于 -20 °C 长期保存，使用时置于冰上。
       警告：瓶装去垢剂通常建议储存在 -20 °C 冰箱中。打开前应将装有去垢剂粉末的瓶子恢复至室温。由于去垢剂粉末具有吸湿性，温度平衡可防止冷凝水形成，避免去垢剂受潮。
3. 其他化学品与试剂
   1. 配制 1D4 免疫亲和琼脂糖树脂：10 mL 50% 悬浮液。
      注意：1D4 免疫亲和琼脂糖是将单克隆抗体 Rho1D4 共价连接至琼脂糖微珠的材料，该抗体识别牛视紫红质 C 末端 9 个氨基酸 TETSQVAPA 作为表位。1D4 免疫亲和琼脂糖可作为亲和纯化介质，用于捕获含有 C 末端 1D4 标签的蛋白质。该纯化介质可自行制备^9,11 或直接购买。
   2. 配制 9-顺式视黄醛溶液：1 mM，溶于 100% 乙醇中。
      注意：配制和储存过程中应避免光照。
   3. 配制 1D4 肽段（序列 TETSQVAPA）：800 μM，溶于水中。
4. 缓冲液
   注意：所有缓冲液均由储备溶液按所需浓度配制而成。使用前所有缓冲液均需预冷至 4 °C。
   1. 配制缓冲液 A：PBS，含 0.04% DDM。
   2. 配制缓冲液 B：20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl，0.04% DDM。
   3. 配制缓冲液 C：20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl，以及 表 1 中所列工作浓度的去垢剂。
   4. 配制缓冲液 D：20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl。
   5. 配制洗脱缓冲液：20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl，80 μM 1D4 肽段，以及相应工作浓度的去垢剂。
   6. 配制 SEC 缓冲液：20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl，0.025% DDM；经 0.22 μm 滤膜过滤。
5. 液相色谱-质谱（LC-MS）用溶剂
   1. 配制溶剂 A：含 0.1% 甲酸的乙腈。
   2. 配制溶剂 B：含 0.1% 甲酸的超纯水。
   3. 配制溶剂 C：异丙醇。

2. 细胞膜增溶与蛋白质提取

1. 将表达牛视紫红质突变体 N2C/M257Y/D282C^3,9 的 30 g HEK293 GnTI^- 细胞沉淀物在室温下解冻，加入含蛋白酶抑制剂混合物的 120 mL 1× PBS 缓冲液，使用 Dounce 匀浆器或电动匀浆器（13,000 rpm，30 秒）进行匀浆。将匀浆后的细胞悬液收集至烧杯中，并调整体积至 150 mL。
   注意：30 g 细胞沉淀物相当于密度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL 的 3 L 细胞培养物。
2. 向匀浆后的细胞中轻柔加入 10% DDM，使其终浓度为 1.25%。冰上搅拌 1 小时。
3. 将细胞裂解液在 4 ˚C、150,000 × g 条件下离心 45 分钟，以去除未溶解的碎片。
4. 将上清液转移至 500 mL 瓶中，并加入 10 mL 1D4 免疫亲和琼脂糖树脂（50% 悬浮液）。在 4 °C 下轻柔混合溶解的细胞裂解液与树脂 4 小时或过夜。
5. 将裂解液/树脂混合物加载至开放柱中，以收集树脂。
6. 用 10 柱体积（CV）的洗涤缓冲液 A 洗涤树脂。
   注意：柱体积是指所用压紧（100%）琼脂糖树脂的体积。本实验中，1 CV 为 5 mL。
7. 用 2 CV 缓冲液 A 重悬树脂。
   警告：从步骤 2.8 开始，需在暗红光条件下操作的步骤将在描述前标注 "[黑暗]"。
8. [黑暗] 向重悬的树脂中加入 9-顺式视黄醛，使其终浓度为 50 μM。在黑暗中 4 °C 轻柔混合 4–16 小时。
   注意：较短的孵育时间可能导致视黄醛的重组不完全。
9. [黑暗] 收集柱中流出液。用 20 CV 缓冲液 A 洗涤树脂，随后用 15 CV 缓冲液 B 洗涤。
10. [黑暗] 用 2 CV 缓冲液 B 重悬树脂，然后将树脂悬液等分为 10 份，分别加入 10 个 10 mL 一次性层析柱中。
11. [黑暗] 收集柱中流出液，然后用 1 mL 缓冲液 C 重悬每个柱中的树脂。在 4 °C 孵育 1 小时。
12. [黑暗] 重复步骤 2.11。
13. [黑暗] 收集柱中流出液，然后用 0.8 mL 洗脱缓冲液重悬每个柱中的树脂。轻柔混合 2 小时。
14. [黑暗] 将洗脱液从柱中收集至 2 mL 离心管中。
15. [黑暗] 用 0.7 mL 洗脱缓冲液重悬每个柱中的树脂。轻柔混合 1 小时。
16. [黑暗] 将洗脱液从柱中收集至同一管中。

3. 紫外-可见光谱法

1. 准备分光光度计，使其覆盖 250–650 nm 的测量范围。使用水或洗脱缓冲液记录基线。
2. [暗态] 将洗脱的蛋白质加入石英比色皿中。测定蛋白质样品的光谱。
3. [暗态] 使用透过 495 nm 长通滤光片的光线直接照射比色皿中的蛋白质 2 分钟。
4. 测定光照后样品的光谱。
5. 对在其他 9 种去垢剂中纯化的所有蛋白质样品，分别在暗态和光照状态下进行相同的测量。
6. 在 X-Y 散点图中绘制曲线（吸光度 versus 波长）。

4. 视紫红质及视紫红质–mini-G_o 复合物的自动尺寸排阻色谱分析

1. [避光] 使用截留分子量（MWCO）为 30 kDa 的离心浓缩管，在 4 °C 下通过离心将蛋白质浓缩至 100 μL。若样品过度浓缩，可使用浓缩管的滤过液或缓冲液 C 进行稀释。为测定蛋白质样品浓度，使用分光光度计在 280 nm 处测量吸光度。
   注意：从步骤 4.2 开始，实验无需在避光环境中进行，因此样品可在正常光照条件下制备。
2. 为每种去垢剂条件准备 100 μL、浓度为 0.7 mg/mL 的视紫红质。
3. 为每种去垢剂条件准备 100 μL 视紫红质（0.7 mg/mL）与 mini-G_o^4,12（0.2 mg/mL）的混合物。向混合物中加入 1 mM MgCl₂。使用 495 nm 长通滤光片的光源照射混合物，并孵育 30 分钟。
4. 在液相色谱纯化系统上安装一支分离范围为 10–600 kDa（针对球状蛋白）的 24 mL 凝胶过滤柱，并用 SEC 缓冲液平衡该柱。
   注意：液相色谱纯化系统配备自动进样器、多波长检测器和组分收集器。
5. 将样品转移至自动进样瓶，并放入样品盘中。编写方法文件以自动化连续进行各样品的 SEC 运行，设置自动进样器向色谱柱加载 77 μL 样品，纯化系统以每分钟 0.5 mL 的流速洗脱 24 mL SEC 缓冲液。记录 280 nm 和 380 nm 处的吸光度。
6. 收集洗脱体积约为 12.9 mL 处的视紫红质峰组分及视紫红质–mini-G_o 复合物峰组分。
7. 通过 4–12% SDS 变性梯度凝胶电泳并结合考马斯亮蓝染色，分析步骤 4.2 中剩余的视紫红质样品以及视紫红质–mini-G_o 复合物的峰组分。
8. 绘制洗脱色谱图（A₂₈₀ 或 A₃₈₀ 对洗脱体积）。

5. 去糖基化与液相色谱-质谱研究

1. 进行LC-MS研究时，仅使用在LMNG去垢剂中纯化的视紫红质样品。
2. 制备200 μL混合液，其中视紫红质浓度为1 mg/mL，PNGase F¹³浓度为0.01 mg/mL。充分混匀后，在4 °C下孵育过夜。
3. 制备200 μL混合液，其中视紫红质浓度为1 mg/mL，Endo F1¹³浓度为0.01 mg/mL。充分混匀后，在4 °C下孵育过夜。
4. 通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析酶解结果。
5. 浓缩未经处理和经Endo F1处理的视紫红质样品，并在缓冲液D中进行尺寸排阻层析（SEC）纯化。
   注意：此步骤旨在为LC-MS研究准备含去垢剂最少的样品。缓冲液D不含任何去垢剂，但由于LMNG从膜蛋白上解离的速率较慢¹⁴，视紫红质不会发生聚集。
6. 收集洗脱体积约为12.9 mL的峰组分，使用离心浓缩仪（截留分子量30 kDa）浓缩至1 mg/mL。
7. 将10 μg蛋白上样至Reprosil 200 C18-AQ色谱柱，按照表2中列出的溶剂组成和条件采用线性梯度洗脱。流动相分流，25%进入质谱仪，75%用于紫外检测。

结果

样品制备与分析的实验流程总结见图1。采用开放式层析柱进行小规模亲和纯化，使我们能够并行地在多种不同的去垢剂条件下制备样品（图1A）。这种小规模纯化方案所获得的蛋白量足以进行后续的紫外-可见光谱分析、尺寸排阻色谱（SEC）以及SDS-PAGE分析（图1B-C）。

紫外-可见光谱揭示视紫红质的稳定性
通过光学吸收评估了视黄醛重建视紫红质的稳定性（图2）。在暗态下，9-顺式视黄醛以质子化席夫碱的形式共价连接于Lys296。光照后，9-顺式视黄醛异构化为全反式构型，席夫碱连接随之去质子化。质子化的9-顺式视黄醛在488 nm处出现吸收峰，而去质子化的全反式视黄醛则在380 nm处出现吸收峰。DDM中的视紫红质紫外-可见光谱显示出典型的9-顺式视黄醛结合态及光激活态视紫红质吸收特征，明显观察到约108 nm的蓝移，且光密度基本保持不变（图2A，左上图）。当视紫红质稳定性下降时，视黄醛结合口袋结构发生改变，导致视黄醛去质子化，甚至可能发生解离。若发生此类情况，光谱将同时反映出去质子化以及游离态视黄醛的贡献¹⁵。因此，我们通过蛋白质（280 nm）与视黄醛（质子化9-顺式视黄醛为488 nm，去质子化全反式视黄醛为380 nm）吸收值的比值来确定视黄醛重建入视紫红质的效率（图2B）。在传统去垢剂（DDM、DM、Cymal-6、Cymal-5、C9G）中纯化的视紫红质样品表现出相同的光学谱型。然而，在NPG类去垢剂（LMNG、DMNG、Cymal-6NG、Cymal-5NG）中纯化的样品其光学谱型提示视黄醛的结合环境次优，唯有OGNG样品的光学谱型与DDM样品一致。

尺寸排阻色谱显示了样品纯度和蛋白质的单分散性。
尺寸排阻色谱（SEC）是在蛋白质样品制备和筛选过程中评估样品的一种高效且稳健的分析工具。它可以验证前一步纯化所得样品的纯度以及蛋白质分子的单分散性。对于视紫红质及其mini-G_o复合物，样品质量通过280 nm和380 nm处的吸收曲线进行判断（图3A）。280 nm处的信号表明蛋白质的存在，而380 nm处的信号则反映视黄醛的存在。在空体积（使用该色谱柱时约为8 mL）处出现的任何信号均归因于蛋白质聚集体。因此，结果表明，使用传统去垢剂制备的样品均处于单分散状态，但C9G除外，其样品中出现了一部分聚集体。相比之下，使用NPG型去垢剂制备的样品比C9G样品含有更多的聚集体；其中LMNG和Cymal-6NG导致的聚集体形成最多，而DMNG和Cymal-5NG中的聚集体较少。例外的是OGNG，其洗脱谱图与DDM相似。在空体积处洗脱的蛋白质聚集体同时表现出较低的视黄醛占据率，这可通过A₂₈₀/A₃₈₀比值的升高来体现，相较于保留体积约为12.9 mL（对应135 kDa）处的主峰，该比值明显增加。我们观察到的另一个特征是，视紫红质和视紫红质–mini-G_o均在相近的保留体积处洗脱（图3B）。这一点并不意外，因为去垢剂结合状态下的视紫红质表观分子量为120 kDa，而视紫红质–mini-G_o复合物为144 kDa。因此，仅凭SEC数据无法确定复合物的形成，故进一步采用SDS-PAGE对SEC纯化后的样品进行分析。

SDS-PAGE 验证了复合物的形成
SDS-PAGE 是鉴定样品中蛋白质组分的常规方法。在凝胶过滤层析（SEC）纯化前的浓缩视紫红质样品通过 SDS-PAGE 分析以确认其纯度，结果显示在约 37 kDa 处出现两条条带，以及一条位于 50 kDa 以上位置的弥散条带（图 4A）。后续证实较低的两条条带具有不同的 N-糖基化状态。50 kDa 以上的条带被解释为由 SDS-PAGE 样品缓冲液诱导形成的视紫红质寡聚体，因为在 SEC 或其他任何检测方法中均未观察到此类聚集体。由于 SEC 数据无法确认复合物的形成，因此对视紫红质–mini-G_o 样品经 SEC 洗脱的各组分进行了 SDS-PAGE 分析。SDS-PAGE 结果显示，在所有去垢剂条件下，均同时存在视紫红质和 mini-G_o 的蛋白条带，表明无论使用何种去垢剂，复合物均能形成（图 4B）。

LC-MS 质谱鉴定了视紫红质中的 N-糖基化模式
来自亲和纯化和 SEC 的视紫红质样品在 SDS-PAGE 凝胶上均显示出两条蛋白条带，其表观分子量约为 37 kDa，使用 24 mL 柱进行 SEC 时无法将这两条带分离。在 HEK 293 GnTI^- 细胞中异源表达的视紫红质存在不同的 N-糖基化模式，这是最可能的解释。因此，测试了两种酶——PNGase F 和 Endo F1——对视紫红质去糖基化的能力。根据 SDS-PAGE 数据，Endo F1 将两条蛋白条带的分子量降低为单一产物，而 PNGase F 消化后仍显示两个不同的条带群体（图 5A）。对未消化和经 Endo F1 处理的样品进行 LC-MS 质谱分析，以鉴定不同组分的分子量。结果显示，在 HEK 293 GnTI^- 细胞中表达的视紫红质含有一个或两个 N-聚糖，其质量差为 1014±1 Da。经 Endo F1 处理后的视紫红质不含任何 N-聚糖，与含有两个 N-聚糖的视紫红质相比，其质量差为 2027±1 Da。这些结果与用于表达视紫红质的细胞系中缺乏 N-乙酰葡糖胺转移酶 I 的情况一致，导致所有 N-聚糖均具有 GlcNAc₂Man₅ 结构（质量为 1014 Da）。

图 1：去垢剂筛选实验的样品制备与表征。 （A）在纯化过程中，于不同去垢剂中制备视紫红质样品。 （B）本方案中使用的方法：紫外-可见光谱法（UV-VIS spectroscopy）、尺寸排阻色谱法（SEC）、SDS-PAGE 以及液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）。 （C）视紫红质、视紫红质–mini-G_o 复合物及视紫红质去糖基化产物的表征实验流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：视紫红质的紫外-可见光谱分析。 （A）视紫红质的紫外-可见光谱。暗态下结合9-顺式视黄醛的视紫红质光谱以蓝色曲线表示。光照后，9-顺式视黄醛发生去质子化并异构化为全反式视黄醛，光照后视紫红质的光谱以红色曲线表示。各去垢剂的化学结构以插图形式展示。（B）A₂₈₀/A₄₈₈（蓝色柱）和 A₂₈₀/A₃₈₀（红色柱）的比值分别反映视紫红质在暗态和光态下的稳定性。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：在10种不同去垢剂中纯化的视紫红质及视紫红质–mini-G_o复合物的尺寸排阻色谱图谱。（A）左图显示在经典型去垢剂中纯化的样品的SEC图谱，右图显示在NPG型去垢剂中纯化的样品的SEC图谱。标准分子量标记蛋白的图谱叠加显示，并与DDM样品一同展示。以DMNG为例说明峰图谱的解读，其中DDM、DM、Cymal-6、Cymal-5和OGNG显示出理想情况（无聚集）。（B）OGNG样品在12–14 mL洗脱体积范围内的放大图谱。所有样品均使用Superdex200 Increase 10/300 GL色谱柱进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：视紫红质及视紫红质/mini-Go复合物的SDS-PAGE分析。 （A）在去垢剂中纯化的视紫红质样品。50 kDa以上出现的弥散条带归因于SDS-PAGE上样缓冲液诱导形成的视紫红质寡聚体。（B）经尺寸排阻层析（SEC）纯化的视紫红质/mini-Go复合物样品。图中显示了含有1个和2个N-糖链的视紫红质以及mini-G_o。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：视紫红质中糖基化的鉴定。 （A）使用 PNGase F 和 Endo F1 去除视紫红质糖基化的 SDS-PAGE 分析。（B）视紫红质在未进行（上图）和经 Endo F1 去糖基化处理后（下图）的液相色谱-质谱（LC-MS）图谱。为了制备用于结晶的视紫红质–mini-G_o 复合物，我们选择使用 Endo F1 而非 PNGase F，因为 Endo F1 能产生单一且均一的视紫红质组分。 请点击此处查看该图的放大版本。

去垢剂	工作浓度 (%)	临界胶束浓度 (%)
DDM	0.025	0.0087
DM	0.12	0.087
Cymal-6	0.05	0.028
Cymal-5	0.2	0.12
C9G	0.5	0.2
LMNG	0.01	0.001
DMNG	0.01	0.0034
Cymal-6NG	0.015	不可用；应低于 0.056
Cymal-5NG	0.02	0.0056
OGNG	0.15	0.058

表1：缓冲液C的去垢剂浓度。

时间（分钟）	溶剂 A（%）	溶剂 B（%）	溶剂 C（%）	流速（ml/min）
0	0	95	5	0.5
1	0	95	5	0.5
5	20	75	5	0.6
25	85	10	5	0.6
26	90	5	5	0.6
30	90	5	5	0.6

表2：柱洗脱参数。

讨论

蛋白质结晶的成功在很大程度上依赖于蛋白质样品本身，尤其是膜蛋白及其复合物，这主要是由于去垢剂带来的复杂性所致。本报告展示了针对G蛋白偶联受体（GPCR）–mini-G蛋白信号复合物的去垢剂筛选及样品质量评估方法。目前已有多种方法被广泛用于研究膜蛋白的生化特性，例如使用荧光染料进行热稳定性检测^16,17，通过测量色氨酸荧光信号的变化来检测复合物形成的结合实验¹⁸，或利用生物传感器进行共振能量转移检测¹⁹。然而，这些方法所使用的化学环境与结晶样品制备条件存在显著差异：例如，基于荧光的测量中蛋白质浓度通常低至结晶条件的千分之一，或者蛋白质被嵌入脂双层中，或仅处于一种固定的去垢剂环境中。在本实验方案中，所采用的方法已在大规模结晶前样品制备过程中实现标准化。因此，优化后的参数可直接应用于结晶规模的样品制备，无需再进行大规模的额外筛选和优化。

本实验方案的目的是优化制备稳定且均一的G蛋白偶联受体（GPCR）–mini-G蛋白复合物，以用于蒸汽扩散法结晶及X射线晶体学结构解析。该方案整合了一系列方法，用于在制备视紫红质–mini-G_o复合物过程中，定性评估去垢剂和去糖基化处理的影响。已有研究报道，在使用辛基葡萄糖苷（C8G）^20,21,22和C9G^23,24作为去垢剂纯化的情况下，无论是否结合转导素肽段，处于非活性状态或光激活状态的视紫红质均成功获得了晶体。然而，使用C8G和C9G纯化的视紫红质–mini-G_o复合物未能形成晶体（数据未显示），因此我们采用所述策略（图1）进一步探索了更广泛的其他去垢剂种类。利用视紫红质对光敏感的特性，我们可在280 nm以外的波长下有效监测视黄醛的再结合情况。在紫外-可见光谱（UV-VIS）和尺寸排阻色谱（SEC）中，我们均在380 nm或488 nm处检测到视黄醛信号。然而，大多数膜蛋白在纯化过程中并不具备如此便于追踪功能活性的发色团。其他可选方法包括通过添加可被光学检测的发色团使配体可被检测，或采用放射性配体结合实验及热迁移实验²⁵。

视紫红质的分子量为 40 kDa。由于其结合的去垢剂质量，其在尺寸排阻色谱（SEC）上的表观分子量约为 120 kDa。因此，迷你G_o（24 kDa）的结合难以通过SEC检测也就不足为奇了，因为这需要区分表观分子量分别为 120 kDa 和 144 kDa 的蛋白质。因此，通过SDS-PAGE分析SEC组分以确认样品纯度和复合物的形成。即使SEC谱图在复合物形成后显示出明显的迁移，仍建议进行SDS-PAGE分析，以确认复合物是由正确的结合伙伴形成，而非与其他共纯化的蛋白质污染物结合所致。

视紫红质和迷你G_o蛋白均被纯化至毫克级别，这使得可以采用对复合物灵敏度较低的检测方法，例如在尺寸排阻层析（SEC）过程中使用紫外-可见光吸收检测，或对SDS-PAGE凝胶进行考马斯亮蓝染色。当样品量有限时，应使用更灵敏的检测方法，例如配备荧光检测器的液相纯化系统，用于追踪蛋白质中色氨酸的信号（激发波长280 nm，发射波长350 nm），以及对SDS-PAGE凝胶进行银染。另一种方法是将荧光蛋白（如绿色荧光蛋白GFP）与目标蛋白融合表达，该方法甚至可在蛋白表达过程中实现检测²⁶，但在结晶前应将其切除。

必须确保纯化的蛋白质不含由可变翻译后修饰（PTM）引起的异质性。在本研究描述的情况下，SDS-PAGE凝胶上观察到的视紫红质的两个条带被鉴定为分别含有一分子或两分子N-连接聚糖。蛋白质的可变修饰可能阻碍高质量衍射晶体的形成，因此我们对视紫红质进行了去糖基化处理。在测试的内切糖苷酶中，Endo F1效果最佳，处理后可得到单一的无糖基化受体形式；而PNGase F仅能部分去除视紫红质上的聚糖，结果产生完全去糖基化的视紫红质与仍保留一个N-连接聚糖的视紫红质的混合物。未经去糖基化处理的视紫红质已成功获得晶体^3,27,28，在这些案例中，视紫红质Asn15位点的N-连接聚糖对于形成晶体接触至关重要。然而，在视紫红质–mini-G_o复合物的情况下，必须使用Endo F1去除N-连接聚糖才能获得晶体。目前尚无在结晶前是否应对目标蛋白进行去糖基化处理的统一标准，但当蛋白质经过大量结晶尝试仍无法成晶时，应考虑去除异质性的翻译后修饰。

本文所述的数据和方法指导我们选择OGNG作为视紫红质–mini-G_o复合物结晶的首选去垢剂，因其具有较小的胶束尺寸以及稳定该复合物的能力。我们还使用了Endo F1以确保纯化的视紫红质为均一的组分。随后获得了晶体，并解析了其晶体结构，分辨率约为3.1 Å⁴，这是继之前两项研究之后第三个被解析的G蛋白偶联受体–G蛋白信号复合物的晶体结构^14,29。

对于结合和未结合伴侣蛋白的膜蛋白，应将其视为两种不同的蛋白质。处于不同功能状态的蛋白质具有不同的构象，并处于不同的能量水平。因此，建议针对每种功能状态优化制备方案，因为非活性状态的参数可能无法完全适用于激活状态。此外，结合伴侣蛋白还会使蛋白质性质发生变化，情况更为复杂。本方案采用标准化的方法制备用于结晶的样品，首先在不同去垢剂中制备非活性膜蛋白，随后进行蛋白质激活及复合物形成，并对蛋白质质量进行表征。因此，只需稍作修改，该方案即可推广应用于其他膜蛋白及其复合物的结构研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1D4 肽	Peptide2.0	按需提供
9-顺式视黄醛	Sigma-Aldrich	R5754
自动进样器 A-900	GE Healthcare		已停产
C9G	Anatrace	N324
cOmplete，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	5056489001
Cymal-5	Anatrace	C325
Cymal-5NG	Anatrace	NG325
Cymal-6	Anatrace	C326
Cymal-6NG	Anatrace	NG326
DDM	Anatrace	D310
DM	Anatrace	D322
DMNG	Anatrace	NG322
Econo 柱	Bio-Rad	7372512
Ettan LC	GE Healthcare		已停产
FRAC-950	GE Healthcare		已停产
HPLC 水 2795 分离模块	Waters AG	720000358EN
InstantBlue 蛋白染色剂	Expedeon	ISB1L
LCT Premier 质谱仪（ESI-TOF）	Waters AG	-
LMNG	Anatrace	NG310
Monitor UV-900	GE Healthcare	18110835
Nanodrop 1000	Witec AG/ThermoFisher		已停产
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶，1.0 mm，15 孔	ThermoFisher	NP0323BOX
NuPAGE MES SDS 缓冲液（20×）	ThermoFisher	NP0002
OGNG	Anatrace	NG311
PAGEr 微型凝胶电泳槽	Lonza	59905
Reprosil 200 C18-AQ 柱	Morvay Analytik GmbH	#s1503
Superdex 200 Increase GL 柱	GE Healthcare	28990944
台式离心机 5424R	Eppendorf	5404000413
超速离心机 Optima XE-100	Beckmann Coulter	A94516
ULTRA-TURRAX T25	IKA WERKE	0003725003
紫外-可见分光光度计	Shimadzu	UV-2401PC
Waters 2487 双 λ 吸收检测器	Waters AG	-