小鼠巨噬体化学术的延时成像

免疫细胞通常以阿米博激素方式^11，22在2D表面上单独迁移，这涉及到前部突起的重复循环，由集成素介导的细胞粘附和后方的回缩。一个先决条件步骤是细胞极化，其中细胞形成前端和后端³。化学学开始于通过G蛋白耦合受体检测化学吸引剂，以及由膜锚定异质G蛋白和小单体G蛋白以及磷脂结合的球苷核苷酸交换因子（GeFs）4、5的介导的复杂信令网络。^4,5激活的Rho GTPass的Cdc42和Rac子家族诱导突出在前⁶和Rho子家族的成员，特别是RhoA，激活收缩后^55，7。7在三维（3D）环境中，白细胞迁移的集成体在很大程度上是多余的，RhoA对于通过狭窄的通道⁸挤压细胞变得更加重要，而Cdc42或Rac诱导的Arp2/3激活对于化学策略转向^99、1010仍然很重要。

免疫细胞可能面临不同的化学吸引物，特别是在组织损伤、病原体入侵和炎症的环境中。在邻细胞补剂C3a和C5a上表达的内源性化学吸引剂，通过补充级联的激活迅速产生，并通过补充C3a和C5a受体得到识别。类似地，坏死细胞通过形式基肽受体招募邻肠细胞，这种受体能识别线粒体衍生物以及细菌衍生的形态基肽^11。免疫细胞还表达G蛋白耦合受体的化学素，一个家族化学吸引肽参与调节免疫细胞贩运在平衡和炎症。化学素分为四组，取决于前两种半胱氨酸 （C） 残留物的间距:C、CC、CXC 和 CX₃C 细胞因子，其中 X 是氨基酸。因此，体内免疫细胞需要对高度复杂的空间和时间信号作出适当反应，使化学疗法的研究成为一项艰巨的任务。下面，我们提供了化学学的简要历史，从生命内成像方法开始。

白细胞化学研究可追溯到1888^年12年，当时眼科医生西奥多·卡尔·古斯塔夫·莱伯清楚地描述了白细胞定向向心肌（真菌）角膜炎模型中的炎症部位的迁移和积累。莱伯强调，病原体衍生物质对消除有害微生物的病原体来源物具有重要作用，而梅奇尼科夫（又称梅奇尼科夫）在^13世纪初曾描述过这种病。20世纪20年代，克拉克和克拉克^14岁，15岁也进行了体内实验，他们利用小龙骨的透明度，发现由鳄鱼油¹⁴或其他刺激物¹⁵引起的无菌炎症导致白细胞粘附在血管上，随后是分片（转皮迁移），并通过组织空间迅速向刺激性细胞迁移。利用让·科曼顿¹⁶日开发的微成像方法进行体外实验表明，白细胞向细菌等颗粒化学吸引物来源^迁移。当时，化学战术因子的分子特性是未知的。在20世纪60年代，斯蒂芬·博伊登¹⁸日认识到，缺乏研究可溶性物质化学活性的技术。他设计了一个隔间，后来被称为博伊登室，两个隔间由滤纸膜隔开。将细胞悬浮液添加到上部隔间，并将测试物质添加到两个隔间或仅添加到下腔室中。孵育期过后，滤膜被移除，细胞固定并染色。通过比较有多少细胞通过滤膜向下井迁移，在两个隔间、两个隔间或仅在下腔室中的测试物质中，可以确定化学策略活性。Transwell测定方法今天仍然很流行，并且已经以各种方式进行了修改，包括使用不同的聚碳酸酯膜，其孔径和密度^{为19，20。,20}Transwell 测定的一个主要缺点是，直接可视化细胞迁移是不切实际的，穿过膜的迁移路径通常不超过免疫细胞的直径。

Sally H. Zigmond 开发了一种化学型室^21，能够利用荧光染料对梯度形成和细胞形态进行可视化。造型室由一个有机玻璃（丙烯酸）滑道组成，带有两个平行线性井，每个井的体积为±100 μL，由滑动上平面下方的1毫米宽桥3×10μm隔开。用细胞种子播种的盖玻片被倒置并放置在滑轨上，使其跨越两个井。在其中一口井中加入化学吸引剂后，在桥上形成陡峭的化学吸引物梯度，通常在30-90分钟内。 在Zigmond腔室中观察到人类多态核白细胞（颗粒细胞）向化学吸引物的方向。据报道，Zigmond室的变化，包括邓恩²²和Insall23室，这²³两个房间都使用盖玻片种子，细胞被放置在两个井上，由一个1毫米宽的桥隔开。Dunn 室由由圆形桥隔开的同心井组成，而 Insall 腔室与 Zigmond 室的关系更为密切，但提供两个不同宽度的桥梁，0.5 mm 和 1 mm。Zemgel等人²⁴日描述了一种新型化学型腔室，称为#-Slide Chemotaxis，由塑料注射成型制造。化学室由两个 40 μL 储层组成，由 1 mm 宽通道隔开，长度为 2 mm，高度为 70 μm。造型室的底部由透气、薄塑料片形成，其厚度和光学特性与1.5号玻璃盖玻片²⁴相同。在这里，我们描述了一种化学疗法测定，使用μ-Slide化学室来可视化小鼠常驻围锥巨噬细胞在化学策略（补充C5a）梯度中长达14小时的迁移。

这些协议遵循我们当地研究伦理委员会的准则以及动物护理准则。

注:图 1显示了化学化测定的工作流。

1. 预填充化学幻灯片

1. 使用经过修改的 RPMI 1640 HEPES 介质预填充一个或两个化学型滑轨的 1 mm 宽和 2 mm 长连接通道，包括不含碳酸氢盐的 RPMI 1640 介质，含有 20 mM 4-（2-羟基苯甲酸）-1-管氨酸硫酸 （HEPES），10%热灭活胎儿牛血清（FBS），以及抗生素，如青霉素（100 U/mL）和链霉素（100微克/米），通过稀释100x青霉素/链霉素制备， 和 1 μg/mL 脂多糖（来自大肠杆菌）和一个收费样受体 4 配体使用激活单元格。
   1. 将化学滑片（图2A）放入圆形（直径为10厘米）的细胞培养盘中，既预热至37°C，又将菜放在加热（37°C）铝块上。将插头插入端口 1 和 4（图 2B）。
      注:铝块保持在37°C，并放置在层流罩内，可用于制备化学室。理想情况下，加热块应为各种管（如 50 mL 管和 2 mL 微离心管）提供平坦的工作区域和井。
   2. 使用带有倾斜尖端的 10×200 μL 移液器尖端，将 15 μL 的改进型 RPMI 1640 HEPES 介质沉积到灌装口 3（图 2B）。接下来，当体积仍设置为 15 μL，并且 （2~20 μL 体积） 移液器的控制按钮按下时，将移液器尖端插入端口 2，以中等快的速度吸进 15 μL（图 2B）。这将预填充 1 mm x 2 mm 连接通道（观察区域）以及两个侧翼供应通道（分别位于中央观察区域和端口 2 和 3 之间）。用盖盖住填充端口 2 和 3。
   3. 预灌装后，将化学滑轨放在 37 °C 下干燥且不含 CO₂的封闭湿度室的机架上。
      注:使用正确的移液器尖端填充化学滑轨非常重要。倾斜移液器将楔子插入灌装口的顶部，而常用的尖移液器尖端可以更深地插入灌装口，并可能大大提高对流体流动的阻力。

2. 小鼠居民围锥形巨噬细胞的隔离

1. 使用高浓度挥发性麻醉异氟兰（空气中的>5%）或二氧化碳^25，然后宫颈错位，牺牲一只3⁄4个月大的小鼠。啮齿动物右反射的丧失与人类意识的丧失有关^26。用水中用80%乙醇清洁小鼠腹部，然后用带有钝尖的手术剪刀进行1⁄2厘米的中线皮肤切口。剥回皮肤，露出底层的腹壁。
2. 将 24 G 塑料导管插入心内腔。使用 5 mL 塑料注射器，使用 2 x 4.5 mL 冰冷 Hank 的缓冲盐溶液 （HBSS） 对腔进行清除，无需 Ca²⁺和 Mg²⁺。将大约 0.5 mL 的剩余 HBSS 留在注射器中，以便无意中吸到导管尖端的组织可以排出。
3. 将洗网介质（通常共 8-8.5 mL）转移到 14 mL 聚丙烯圆形底管中。在室温下，将管子在 300 x g下离心 6.5 分钟。
   注:圆形底部管允许上清液完全去结，并减少细胞结块。
4. 在经过修改的RPMI 1640 HEPES介质的200μL中丢弃上清液细胞并重新悬浮圆锥细胞（通常每只小鼠+4 x 10⁶细胞）。稀释细胞悬浮液的样本1:20，并使用计数装置，如Neubauer改进的计数室，对细胞进行计数。接下来，使用加热铝块将细胞悬浮液稀释至最终浓度为10 x 10⁶细胞/mL，并将细胞保持在圆形底部 2 mL 聚丙烯微离心管中 37°C。

3. 将内锥细胞播种到化学片幻灯片中

1. 移液细胞悬浮液上下5倍后，移液器体积设置为100 μL（或悬架体积的一半），以减少结块，轻轻将10μL的细胞悬浮液沉积到化学室的端口3中（图2C）。将移液器尖端放入端口 2 中，然后缓慢地将电池悬架绘制到连接通道中（图 2C）。一旦引入电池悬浮液，拆下端口 1 和 4 处的插头，这将有助于阻止电池悬浮液的流动。在所有四个填充端口上放置盖。
2. 对所有化学室重复步骤 3.1。使用小型倒置显微镜和 10 倍相位对比客观透镜，检查化学片幻灯片中是否有不需要的气泡。
3. 将用圆锥细胞种子的化学滑轨置于37°C的湿度室中，温度为2~3小时。

4. 填充储层并添加化学吸引物

1. 使用倒置显微镜检查观察区域（连接两个 40 μL 储液罐的通道）。
   注:在此阶段，细胞密度将高于填充储液罐后，因为弱粘细胞，主要是CD19⁺细胞（B1细胞），将在填充过程中冲出观察区域（图2C+E）。
2. 将插头插入填充端口 1 和 2（图 2D）。确保填充端口 3 顶部充满中度和无气泡。如果需要，使用无菌的 27 G 注射器针去除不需要的气泡。
3. 使用 10×100 μL 体积的机械移液器，吸气 ±60 μL 的改性 RPMI 1640 HEPES 介质，并将移液器尖端放入灌装口 3。使用移液器的体积设置环缓慢而稳定地将介质注入储液罐中，使介质在 1⁄2 分钟后到达填充端口 4 的顶部（图 2D）。
4. 填充第二个储液罐。将插头从端口 1 中移动，然后缓慢地将其插入端口 3（图 2D）。接下来，吸气 ±50 μL 的改进型 RPMI 1640 HEPES 介质，并将移液器尖端放入灌装口 4。使用 10×100 μL 体积移液器的体积设置环缓慢而稳定地将介质注入第二个储液罐中，使介质在 1⁄2 分钟后到达填充端口 1 的顶部（图 2D）。
5. 将495μL的改性RPMI 1640 HEPES介质放入（圆形底部）2 mL微离心管中，加入5μL的专利蓝V（库存溶液:磷酸盐缓冲盐水[PBS]中的10mg/mL），这种蓝色染料用作浓度梯度形成的视觉指标。通过短暂的涡旋混合。加入5.4 μL的重组小鼠补补C5a（库存溶液:50 μg/mL在PBS与0.1%牛血清白蛋白）和混合通过短暂的涡旋。
6. 沉积 15 μL 的蓝色，补充含 C5a 的介质到填充端口 1（图 3A），在确保端口顶部的浅凹陷是中等无中（否则下降可能会溢出）。
7. 将 10×200 μL 移液器尖端插入灌装口 4，缓慢而稳定地旋转 10×100 μL 体积移液器的体积设置环，以绘制蓝色滴，将含有 C5a 的介质补充到相反储液罐中（图 3B）。空气将开始进入加注端口 1 的短垂直列。将空气拉入，直到液-空气接口位于垂直柱的中间，然后缓慢地将插头插入端口。
8. 用另一只手轻轻地从端口 4 上提起移液器，以确保滑道保持固定到位。最后，缓慢插入端口4（图3B）。
9. 在倒置显微镜上检查化学滑轨。
   注:观察区域中的剩余粘附细胞应以巨噬细胞为主。这可以通过荧光标记的抗F4/80抗体（F4/80是小鼠巨噬细胞的特定标记）进行确认。B细胞可以使用荧光标记的抗CD19抗体和F4/80^-/CD19^-细胞可以使用蓝色荧光核酸染色检测细胞（图4）。

5. 按延时、相位对比显微镜成像巨噬体迁移

1. 将化学滑道滑道放在装有舞台培养箱的倒置显微镜的舞台上。将温度保持在 37 °C。
2. 使用 10 倍相位对比度目标透镜成像 1 mm x 2 mm 观察区域，并专注于巨噬细胞拉梅利波迪亚:薄片状膜突起。以每 2 分钟 1 帧的速度捕获 14 小时的图像。

6. 延时图像分析

1. 使用自动图像分析软件或 Fabrice P. Cordelrees 为 ImageJ 制作的手动跟踪插件分析延时相位对比图像。
   注:自动跟踪程序可用于分析通过延时、相位对比或荧光显微镜成像的细胞。例如，Cordelrees等人²⁷生产的基于Java的软件iTrack4U可用于使用延时、相位对比或荧光图像作为输入进行自动细胞跟踪和分析。手动跟踪更耗时，但 ImageJ 插件手动跟踪生成的轨道可以直接导入，并通过 ImageJ 插件 Chemotaxis 和迁移工具^28、,29自动分析。

图2A显示了用于在化学战术梯度中迁移的小鼠腹腔巨噬细胞延时视频显微镜的化学滑动图。幻灯片包含三个化学室，每个腔室有四个填充端口。可以使用幻灯片上方显示的插头单独关闭端口。或者，非密封盖可以放置在拔下端口上，以保持不育。插入端口 1 和 4 后，端口 2 和 3 之间的观察区域（1 mm 宽 x 2 mm 长 x 70 μm 高通道连接两个储液罐）可以通过将 15 μL 滴入端口 3 并用端口 2 的 2⁄20 μL 体积移液器进行预填充（图 2B）。将10μL的悬浮液放入端口3，并在端口2处缓慢吸气（图2C），将10μL的悬浮液放入观察区域，从而将小鼠常驻围锥细胞（10 x 106细胞/mL）的悬浮液播种到观察区域。图2C显示了使用10倍目标透镜在观察区域中由相位对比显微镜采集的细胞的典型图像。孵育2~3小时后，化学滑轨慢慢填充了介质（图2D）。插入端口 1 和 2 后，通过端口 3 缓慢喷射介质，直到从端口 4 中出现。接下来，插头从端口 1 切换到端口 3，然后通过端口 4 缓慢注入介质填充第二个储液罐，直到在端口 1 处出现。在此阶段，使用倒置显微镜对观察区域的细胞进行了重新检查（图2E）。通过比较水库填筑前（图2C）和后（图2E）的图像，多达三分之二的细胞被冲出观察区。一般来说，弱粘附CD19+细胞（B1细胞）被冲走，其余细胞主要是F4/80+细胞+（巨噬细胞）。荧光显微镜在用荧光标记的特定抗体标记每个细胞类型后证明了这一点（图4）。在图4A中，新分离的小鼠常驻围锥细胞标有绿色荧光荧光结合抗F4/80抗体和红色荧光荧光结合抗CD19抗体，细胞核标有蓝色荧光核酸染色。F4/80是小鼠巨噬细胞30的特定标记，而CD19是B细胞标记。图 4B显示了 F4/80=通过旋转磁盘共聚焦显微镜在化学室观察区域成像的细胞。这些细胞经过一夜化学测定后，经过延时、相位对比显微镜的测定后进行了标记。

在插入端口2和3后，将含有0.54微克/mL（重组小鼠）的15μL介质（重组鼠标）补充C5a（化学吸引剂）引入两个储液罐之一，将C5a（化学吸引剂）放入填充端口1（图3A）。"化学吸引介质通过4号端口用移液器缓慢吸入储层。图 3B显示了将 15 μL 滴入储液罐后蓝色染料的扩散。专利蓝V被用作化学吸引物扩散的间接视觉指标。补充C5a分子比专利蓝V（9.0 kDa对0.57 kDa）的分子大得多，扩散速度较慢。补补C5a在储层中扩散后，其浓度为±0.2 μg/mL（15 μL/40 μL[储液量]x0.54微克/米升=0.2微克/米L），相当于±22.5 μM。3小时后，观察区形成一个中等陡峭的梯度，并继续增加，达到最大在12小时31时左右。图 3C显示了在添加化学吸引剂后在 6-12 小时之间在互补 C5a 梯度中迁移的巨噬细胞的迁移轨迹。细胞速度和化学策略效率，索引为y-FMI（y向前迁移指数;范围:-1至+1）和x-FMI，从迁移图中计算了单个巨噬细胞（图3D）。图 3D还显示了将每个迁移轨道的起始点规范化为框图下方 X = 0 和 Y = 0 后生成的迁移图。迁移图中的内位显示如何为每个迁移轨道计算 y-FMI。

图1:化学化测定的工作流程。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2:处理化学幻灯片。（A） 带有四个插头和四个盖的化学幻灯片的 3D 视图。该滑道包含三个化学室，每个室由两个 40 μL 储层组成，通过 1 mm x 2 mm 通道连接，该通道高 70 μm，称为观察区域。（B） 连接通道在两端延伸到加注端口 2 和 3。将插头插入灌装端口 1 和 4 后，观察区域通过应用介质到端口 3 的滴，并在端口 2 处使用 10⁄200 μL 移液器尖端进行吸气，从而预填中（红色）。随后，在37°C孵育幻灯片并准备细胞悬浮液之前，将盖涂在端口2和3上。（C） 形成化学吸引梯度的观察区，通过在端口 3 处应用 10 μL 的小鼠常驻圆锥细胞，并在端口 2 处缓慢吸水，用巨噬细胞播种。然后，在37°C的湿度室中孵育2~3小时。右图显示的相位对比图像，通过10倍物镜获得，显示在37°C下播种和孵育后，在37°C下孵育2小时， 比例杆 = 500 μm. （D） 化学室通过堵塞端口 1 和 2，然后通过端口 3 缓慢注入介质，直到在端口 4 出现。通过转动 20×100 μL 体积移液器的体积设置环，可实现缓慢而稳定的灌装。填充第一个储层后，第二个储液罐可以通过堵塞端口 2 和 3 进行填充，然后在端口 4 处缓慢注入介质，直到在端口 1 处出现。（E） 填充两个储层后，上述同一观测区域的相位对比图像 （C）。比例尺 = 500 μm. 埃利亚斯·霍恩提供的图形元素。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:化学测定。（A） 化学吸气剂被引入化学室的两个储层之一，将含有0.54微克/mL补C5a和10 μg/mL专利蓝V的15μL介质滴涂到填气端口1，随后在端口4处缓慢吸入。（B） 最初被吸入储层后，含化学剂的介质呈大致倒落形状，然后缓慢地扩散到整个储层。（C） 在将化学吸引剂引入其中一个储层后，在6-12小时之间在化学吸引物（补充C5a）梯度中迁移的巨噬细胞的迁移轨迹。渐变的方向在右侧指示。每个迁移轨道的末尾由填充的圆圈指示。（D） 速度的 Blox 图、x-FMI（x 转发迁移指数）和 y-FMI（y 向前迁移指数），化学策略效率指数范围从 -1 到 +1。通过分析25条巨噬体迁移轨迹获得数据。随机选择观察区域下半部分的巨噬细胞，并显示至少一个细胞宽度超过6小时的位移进行分析。下面是将起始点规范化为 X = 0 和 Y = 0 后迁移轨道的图。化学指数（y-FMI）的计算方法是将沿Y轴（d）的净位移除迁移路径的累积长度（l），如原理图所示。由埃利亚斯·霍恩提供的面板 A 和 B 中的图形元素。请点击此处查看此图形的较大版本。

图4:通过旋转磁盘共聚焦显微镜获得的活鼠常驻腹腔细胞的荧光图像。（A） 新分离的小鼠圆锥细胞的扩展焦点图像（所有Z-平面的亮点合并），标记绿色荧光抗F4/80（巨噬细胞标记）抗体、红色荧光抗CD19（B细胞标记）抗体和蓝色荧光核酸染色。刻度杆 = 10 μm. （B） F4/80 的快照 （单 Z 平面）=在经过隔夜化学化测定后采集的化学室观察区域中的细胞（巨噬细胞）。细胞标有绿色荧光抗F4/80抗体和蓝色荧光核酸染色。补补C5a和专利蓝V梯度被细胞标记程序冲掉，这解释了为什么化学箱室的原理图中的上储层不是蓝色的。比例条 = 10 μm. Elias Horn 提供的图形元素。请点击此处查看此图形的较大版本。

作者没有什么可透露的。