可重复的阶梯步骤测定，以访问杂草水稻的过敏性潜力（Oryza sativa ssp.）

Summary

在种植系统中，过敏病已显示出作为一种有用的补充杂草控制策略的希望。为了确定所需植物标本的均感电位，提供了阶梯式筛选方法。

Abstract

杂草竞争大大加剧了全球种植系统的产量损失。许多杂草物种对持续施用除草剂的抗药性演变，对额外的管理方法提出了需求。过敏病是一些植物物种拥有的生理过程，它使植物比其邻居具有优势。过敏性作物品种将具备抑制周围竞争对手生长的能力，从而减少杂草干扰的潜在产量损失。本文重点研究在温室环境中对接收杂草物种（Echinochloa crus-galli）进行阶梯式测定的构建和操作，用于筛选供体物种（Oryza sativa）的均感电位。本文描述的结构是植物样品的支架，并纳入了用于积累和分配过敏性化学物质的时分浇水系统。植物根部生产的过敏液可以分别流经四个罐子，然后通过电动泵回收回顶部植物。这种筛选方法为供体工厂的过敏性化学品在没有任何资源竞争的情况下到达接收厂提供了一条途径，从而允许定量测量所选供体植物的过敏性电位。通过接收装置的高度降低，可以测量同源电位。该方法有效性的初步筛选数据表明，接收物种，谷仓草（E.crus-galli）的高度降低，因此，来自供体植物，杂草米（Oryza sativa）的过敏性残留物的存在。

Introduction

在过去的几十年里，过敏病是一种自然而复杂的现象，是许多植物科学家关注的焦点。自20世纪30年代以来，与作物的过敏机制有关的机制一直是许多研究的主题，当时莫利施观察到，植物通过生产和将化合物分泌到环境中对邻近植物有直接或间接的影响^1。过敏病是生产二次代谢物，对一些植物物种的生长和发芽有抑制作用。释放的同理性化合物有助于向供体植物提供竞争优势，向周围的环境添加植物毒素^2。许多因素导致同源性活动。它在有效性上是有选择性的，并且因品种、环境条件、生长阶段、压力、环境和营养供应而不同^3。

近年来，过敏病在研究中被强调为对持续和不断增长的杂草控制危机的可能补充。随着全球人口的增长，对可持续食品和纤维生产的需求增加了^4.杂草控制是农学家^5，6面临的生产面临的最大威胁之一。传统的杂草控制方法侧重于机械、化学和文化实践。除草剂的连续使用虽然有效、有用和高效，但以惊人的速度促进了抗杂草种群的进化^。基因工程和育种实践已被有效地利用，使作物比杂草具有竞争优势，通过设计它们能够承受其邻居无法生存的化学应用^。虽然有效，这些技术并不总是可持续的，有时造成交叉的关注^9。如果要^达到增加粮食产量的目标，就必须引入补充杂草管理做法。阿洛帕西表现出极好的前景，作为一个新的防御工具作物，以提高其质量，并超过他们的竞争对手^1，7。

过敏化学通常是次要产品，由于其生产受到环境因素的很大影响，与植物抑制相关的特定化合物可能难以识别^3。生产要素包括遗传学和二次代谢物的联合行动，可以协同作用^11，12。将过敏性活动与自然存在于作物-杂草相互作用中的竞争区分开来是具有挑战性的，因此，当对过敏症进行筛查时，必须有一套标准的结果，使检测符合有效和可重复性。下面是一套标准，根据 Olofsdter 等人概述的一组结论，说明过敏性结果，一种植物必须证明以一种模式抑制另一种植物;2） 以生物活性量释放到环境中的化学品必须由捐赠植物生产;3） 所生产的化学品必须运输到接收装置;4） 接收装置中必须存在一定的接收机制;6） 观察到的抑制模式不得有其他排他性解释（例如，资源竞争）¹²。

为了克服对支持过敏症和品种发育的机制缺乏了解之间的障碍，可以确定和选择与全病性品种相关的型型特征，供进一步研究和使用。一些已知具有过敏症品质的植物有黑麦、高梁、大米、向日葵、油菜籽和小麦^13。在早期观察作物的过敏病时，由于田间实验中杂草生长的显著边界，有人提出化学品是参与的，而不是对资源的竞争^。然而，大多数研究都是实地实验，使得不可能消除竞争作为一个因素^14。在实验室和温室实验中，消除竞争的努力让位于实验室和温室实验，以证明和量化水稻和其他作物的过敏性活动。田间和温室方法筛选植物的过敏症表明，在两种生长条件^11，15中都存在所有前型倾向。一些批评家认为，实验室筛查可能只具有有限的价值，由于缺乏自然条件，这可能会影响结果^15。

建议的筛选植物内过敏潜力的方法，提供了足够的资源和空间，并消除了资源竞争与使用楼梯级结构^11，17。该方法是从以前的实验中修改和修改的，这些实验探索了草草和大麦^17、18的过敏病。这些研究发现，类似的系统能够产生准确的结果，对目标植物的过敏潜力，同时消除任何怀疑，认为观测可以归因于自然竞争。阶梯式方法可创建循环系统，其中来自储液罐的营养液可以通过几个步骤循环到孵化盘。然后，电动泵将溶液与生产^的任何过敏性化学品一起回收。这样的方法在时间、空间和资源上都是有效的。它还为工厂提供了类似的现场条件，并消除了任何资源竞争。用于筛选的方法和工具很容易操作，以适应所需的研究目标、条件和特定物种。本研究的目的是通过使用楼梯步法对谷仓草进行高度抑制测量，确认杂草水稻的过敏性。

Protocol

1. 支架施工

注: 木材的测量值列为厚度 （cm） x 宽度 （cm） x 长度 （m）。

1. 将木材切成适当的尺寸和数量如下:5个10.16厘米 x 5.08厘米 x 0.91米木件，3个10.16厘米x5.08厘米x0.76米木片，三个10.16厘米x5.08厘米x0.61米木片，5件10.16厘米x5.08厘米x0.46米木制品，三件 10.16 厘米 x 5.08 厘米 x 0.3 米木件，三件 10.16 厘米 x 5.08 厘米 x 0.15 米木制品。
2. 对于最高等级，在边缘两端的两个 0.91 m 件上站在一个 2.44 m 板上，并将两颗螺钉垂直钻入 0.91 件。拧出一个 0.91 m 件 1.22 m 的两端进行支撑，并在 0.91 m 支架的背面放置一个 2.44 m 板，并拧入到位以进行支撑。
   注:8 个 3.175 厘米 x 15.24 厘米 x 2.44 m 保持不变，可不切割，用作每个工作台的台面。
3. 重复步骤 1.2 下一个工作台水平与 0.76 m 件。
4. 对下一个工作台重复步骤 1.2，将 0.61 m 件向下到第六个工作台，为 0.15 米。
   注:3⁄6 号长凳不需要支撑 2.44 m 板。最后的看台有六个长凳，每个长凳有三个垂直支撑，每端一个，中间一个。
5. 线长按降高顺序排列，悬垂的嘴唇面向背面，接触上面的长凳，允许水平之间的间隙。
6. 沿地面在长凳的每个底部边缘上放置一个 0.91 厘米板，并将工作台拧入到位。
7. 水平拧下 0.46 m 板，用于支撑结构两侧最高的三个长凳，距离地面 0.61 米。
8. 将三个角支架拧到最高长凳的前端和中心。
9. 将一个 2.54 厘米 x 5.08 厘米 x 20.32 厘米的木块拧在支架上，距长凳底座 2.54 厘米。
   注:制作一个0.91米乘0.91米乘2.44米结构。有关最终基础产品，请参阅图 1。尺寸会随着实验需求而变化。所述结构设计适合15.24厘米的锅。台架之间的高度设计为适合本实验中使用的锅和植物材料，以保持由重力从一个锅到另一个锅的亚洛氏化学和溶液的稳定流动。

图1:木制底座支架的正面视图。木制底座是植物样品的支架。系统的材料将根据实验所需的样品数量进行组装和添加。在这项研究中，两个支架作为31个样本的基地。请点击此处查看此图的较大版本。

2. 系统组装

1. 从 1 L 苏打水瓶中取出盖子，用黑色油漆喷漆。
   注:汽水瓶将作为系统顶部的储液罐，用于一列。油漆为光提供方块，减少或防止藻类生长。
2. 在每个汽水瓶的底部，钻一个小孔，刚大到足以嵌入一个0.35厘米的内径（ID），0.64厘米外径（OD），5.08厘米长的塑料PVC管。
3. 插入后，在孔边缘涂抹一层硅胶防水密封剂，以防止任何泄漏。让它完全干燥。
4. 对用于容纳锅的每个塑料盘子重复步骤 2.2 和 2.3。
   注:一列需要四道菜。
5. 取下盖子，用黑色油漆喷漆 2.27 L 塑料罐的外侧。这些罐子将作为每列底部的收集罐。
6. 在罐子的上背部钻一个小孔。
   注:步骤 2.1_2.6 中列出的耗材构成一列。列数取决于所需的实验所需的样本数。一个示例需要两列。所有尺寸都可根据实验需求而变化。
7. 准备好并干燥后，将苏打水瓶放在最高的长凳上，以便 PVC 管悬挂在面向楼梯的边缘上。
8. 在下一个长凳上的苏打水瓶下面，放置一个塑料盘子，其管子挂在长凳的边缘。
9. 对接下来的两个工作台重复步骤 2.8。
10. 将罐子放在底部的长凳上，孔朝靠背面。
11. 通过将管子从盘子中串到罐子背面的孔中，将罐子与上面的盘子连接起来。
12. 在管子穿过的罐边缘涂抹防水密封剂，以防止泄漏。
13. 将 21 W 1，000 L/hr 潜水电动泵放在底部罐内。
14. 将一个 1.07 米长、1.27 厘米 ID、1.59 厘米 OD PVC 管连接到电动泵的喷嘴。
15. 将管子串过长凳之间的缝隙和系统顶部的苏打水瓶背面。
16. 将泵插入数字定时器，并根据需要设置计时器设置。
    注: 在整个实验中，计时器设置为每 3 小时运行 1 分钟。所选时间允许循环收集罐中的最大液体量，每次打开泵时允许大约 10 分钟的流量，同时避免洪水和溢出。

3. 种植

1. 用70%乙醇浸泡30秒，浸泡在5%漂白剂中20分钟，用蒸馏水洗6倍，对所需的所有水稻种子进行消毒。
2. 在培养皿中预灌灭菌的水稻种子，在25°C的生长室中用5mL蒸馏水填充过滤纸。
3. 种子发芽后，将每个咖啡壶的底部与两个大型咖啡过滤器排列，将其放入锅内，形成天然的杯状。
4. 用高压灭、洗涤和筛选特殊分级的石英沙将每个锅填充到过滤器顶部（大约 75% 的锅）。将水倒在砂上，或将盆子放入种植托盘中，稍稍装满蒸馏水，让盆子浸泡水并保持湿气，用蒸馏水来浇砂。将6种预发芽的供体植物幼苗移植到沙中，均匀间隔。
5. 用沙盖住幼苗。
6. 让幼苗建立3周。
   注:沙干燥非常快。因此，将锅放在托盘中是一种有效的浇水技术。不断换水有助于防止霉菌。
7. 在培养皿中预发芽接收植物幼苗（E.crus-galli）3周后，在种植供体植物后，用滤纸和5 mL蒸馏水在盘子底部衬里。将盘子置于25°C的生长室中3~5天。
8. 按照步骤 3.1_3.2 中所述准备罐子。
9. 幼苗发芽后，将三株幼苗移植到准备好的盆中，用沙覆盖。
   注:实验在治疗后一天开始（DAT），或接收机植物幼苗出现并移植并放入系统的第二天。

4. 样品放置

1. 将四盆一个供体植物放在第1栏的四个菜盘中，每排一盆。第1栏仅由供体植物组成。
2. 在列第一排和第三行第2列的菜中放置两盆具有相同加入的供体植物。
3. 在列第二和第四行第 2 列的盘子中放置两盆接收器植物。
4. 对于每个复制，请确保只添加一行接收器设备。两列，第一列仅由捐赠植物组成，第二列交替供体和接收方，进行一种处理（图2）。

图 2:放置图。描述捐赠者（WR/R）和接收设备（BYG）在楼梯步进系统中各自位置的位置的图表。楼梯步进系统的两列，植物就位，包括一种处理。单列接收装置作为一个复制（最右边）的控制，一列供体植物作为每个加入（中心）的控制，治疗列由交替供体和接收方植物组成（最左侧）。请点击此处查看此图的较大版本。

5. 对每次治疗或供体植物加入重复步骤4.1~4.4（图3）。
   注: 每个复制都需要一列接收器设备样本作为一个复制的控制。在随机完整块设计中，治疗被复制3倍。

图3:最终楼梯步长结构。楼梯步进系统与工厂就位。该系统包含四排植物样品和底部的收集罐，溶液可循环到顶部瓶中，并通过每个罐子通过重力向下。请点击此处查看此图的较大版本。

5. 操作

1. 在 DAT 1 上，在每列底部的收集罐中，在蒸馏水中填充半强度的霍格兰溶液^17，约 1，500 mL。
2. 将计时器设置为在自动关闭设置中根据需要运行。
3. 用黑色塑料盖住收集罐，以限制光暴露和蒸发。
4. 每 2 天向储罐加注 500 mL 的 Hoagland 解决方案，以保持系统持续流动。
5. 白天和夜间分别将温室温度保持在28°C和24°C，分时16/8小时，湿度在53%。

6. 数据收集

1. 在 DAT 1 的楼梯步进系统中测量和记录每个植物的高度，每周一次，一次，一次，一次，一次，一次，以达21的尺子放在每个植物的基地，并观察最高的叶站。
2. 使用叶绿素含量计在DAT 7和14上测量和记录每个植物的叶绿素水平。
3. 在实验的最后一天（即DAT 21），为每个锅贴上一个纸袋的标签。
4. 在底座上切割植物样品，并放入单独的袋子中。
5. 将所有样品放入60°C的烤箱干燥机中，为48小时^16。
6. 将干燥的样品和空内容单独取出到刻度上，并记录重量（以克）。

7. 数据分析

1. 使用以下方程，根据接收装置的抑制百分比计算供体植物的均感电位:
   高度降低 （%） = [控制高度 （cm） = 处理高度 （cm）] = 100
2. 计算捐赠工厂高度降低，以检查接收装置可能对目标工厂产生的任何反向影响。
3. 分析加入作为固定效果，而复制和运行是随机效应^18。
4. 使用费舍尔在统计软件（例如 JMP 14）中保护的最小显著性差值或低于 0.05 概率水平（例如 JMP 14）分隔平均值的一般线性模型分析数据。
5. 通过上传数据，使用 对原始变量进行原理组分分析来可视化原始变量之间的相关性。
   1. 在工具栏中选择"分析"选项卡，选择"按 X 拟合 Y"。在列下，突出显示响应（即高度降低百分比），然后单击Y，以指定 Y 观察到的因子（即高度降低百分比）。对于 X 因子，高光加入并单击X，因子，然后选择"确定"。
   2. 选择单向分析栏上的红色向下箭头，选择"表示/方差"。再次选择单路分析栏上的向下箭头，并突出显示比较均值，然后选择每对，学生的 T。

Results

使用这种方法对9种杂草水稻加入（B2、S33、B83、S97、S94、B81、B88、B84、B14）和5个栽培水稻系（PI338046、雷克斯、朗多、PI312777、CL163）进行了两次初步筛选。杂草水稻加入和水稻系是根据他们在Shrestha（2018）18进行的先前过敏性筛查中的表现而选择的。杂草的水稻种子是从阿肯色州各地收集的。选择的水稻系是在美国常见的种植线，一些已知表示过敏活动（例如，Rondo PI312777），并用作本研究¹⁸的对照。初步数据表明，楼梯步法作为评估对谷仓草（E.crus-galli）的过敏力潜力的方法的潜力。通过水稻根部排泄的均因性残留物，使谷仓草植物的高度显著降低。杂草米和谷仓草之间的资源竞争被消除，所有植物在相同的条件下生长。结果表明，杂草米和水稻品种对谷仓草的过敏活性各不相同。

DAT 14 记录的高度测量用于计算谷仓草高度降低百分比。如图4所示，一些捐赠水稻的身高降...

Discussion

利用过敏病可能作为一种生物控制杂草，很难管理^{1，7，13。}过敏病已显示出巨大的潜力，作为一个可能的解决方案，在水稻的杂草危机，并作为替代或补充化学品和人工杂草控制做法^{5，13，19。}确定所有病种或作物品种的加入是将这一技术纳入杂草管理战略的第一步。如本研究所示，一些加入的杂草米和水稻（O.sativa）表现出更大的抑制谷仓草（E.crus-galli）。在这项研究中表现最好的加入是进一步研究过敏性遗传和作用机制的候选者。

楼梯步法被证明是一种有用的筛选技术，以确定水稻过敏性电位。这些方法不限于任何一个捐赠者或受援植物。可以同时筛选各种不同的植物，并且可以轻松交换目标和受体以获得...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.25 英寸 x 6 英寸 x 8 英尺标准恶劣天气木板	Lowe's，北卡罗来纳州穆尔斯维尔	489248	N/A
2 英寸 x 4 英寸 x 8 英尺白色木钉	Lowe's，北卡罗来纳州穆尔斯维尔	6005	切割成适当的尺寸
63 毫米（2.5 英寸）角支架	Lowe's，北卡罗来纳州穆尔斯维尔	809449	N/A
Asporto 16盎司圆形黑色塑料便携盒 - 带透明盖子，可微波加热 –6.25 英寸 x 6.25 英寸 x 1.75 英寸 - 100 个盒	装 Restaurantware.com，芝加哥，伊利诺伊州	RWP0191B	黑色
ATP 乙烯基柔性 PVC 食品级塑料管，透明，内径 0.125 英寸 x 外径 0.25 英寸，100 英尺	亚马逊，华盛顿州西雅图	B00E6BCV0G	N/A
Ccm-300 叶绿素含量计	Opti-Sciences， Inc. 哈德逊，新罕布什尔州	ccm/300	N/A
常见 1 英寸 x 2 英寸 x 8 英尺松木板	Lowe's， 北卡罗来纳州穆尔斯维尔	1408	N/A
承包商选择承包商 24包42加仑黑色户外塑料建筑垃圾袋	Lowe's，北卡罗来纳州穆尔斯维尔	224272	切割覆盖收集罐
EURO POTS	温室大型商店，丹维尔，伊利诺伊	CN-EU	15厘米短黑色 6英寸直径 4.25英寸高 1.37夸脱体积
费舍尔品牌培养皿，带透明盖子	费舍尔科学， 沃尔瑟姆，马萨诸塞州	FB0857513	N/A
A出流电 220 V-240 V 电气设备 美国插头 21 W 1,000 L/hr 多用途潜水泵	亚马逊，西雅图 WA	B07MBMYQNT	喷嘴尺寸应适合管子，并且可以调整
Woods 50015 WD 户外 7 天重型数字插座定时器	沃尔玛，本顿维尔，阿肯色	565179767 20	设置
GE 硅胶 2+ 10.1 盎司杏仁硅胶填缝剂	Lowe's， Mooresville， NC	48394	用于任何连接管道边缘的密封剂
Great Value蒸馏水	Walmart， Bentonville， AR	565209428	N/A
Great Value White Basket咖啡过滤器 200计数	Walmart， Bentonville， AR	562723371	尺寸可能会有所不同
Grip-rite primgaurd plus #9-3 in pollimerdex螺丝	Lowe's， Mooresville， NC	323974	N/A
霍格兰s No. 2 基础盐混合物	沉箱实验室，INC. 史密斯菲尔德，犹他	HOP01/50LT	½强度率
JMP （14）	SAS Institute Inc. 北卡罗来纳州立大学，北卡罗来纳州		N/A
项目来源平面黑色喷漆	Lowe's，北卡罗来纳州穆尔斯维尔	282254	N/A
项目来源实用程序 1.88 英寸 x 165 英尺灰色管道胶带	Lowe's， Mooresville， NC	488070	N/A
Rubbermaid 2夸脱方形食品储存罐透明	Walmart， Bentonville， AR	555115144	收集罐丢弃盖
密封未增强PVC透明乙烯基管，食品级.5英寸内径x .625英寸外径，100英尺	亚马逊，西雅图 WA	B07D9CLGV3	连接到泵
Short Mountain Silica 50磅 玩沙	Lowe's，Mooresville，NC	10392	沙子应该净化
Steve Spangler 的 1 升汽水瓶 - 6 包 - 用于科学实验 使用	亚马逊，华盛顿州西雅图	UPC 192407667341	顶部步骤罐丢弃盖