基于脑血流的静息态脑功能连接光学漫散斑光谱研究

摘要

本方案演示了如何使用定制的扩散相关光谱仪器测量人前额叶皮层的静息态功能连接。报告还讨论了实验的实际操作要点以及数据分析的详细步骤。

摘要

为了全面了解人脑功能，希望利用脑血流量（CBF）作为对比源，因为CBF是与脑部供氧密切相关的关键血流动力学参数。基于氧合对比的静息状态下低频波动已被证明能够提供功能连接区域之间的相关性。本方案采用光学漫散斑相干光谱技术（DCS）来评估人脑中基于血流的静息态功能连接（RSFC）。在人脑额叶皮层中基于CBF的RSFC结果表明，左右皮层内的区域内部RSFC显著高于两个皮层之间的区域间RSFC。本方案将对采用多模态成像技术研究人脑功能的研究人员，特别是在儿科人群中开展研究者，具有重要意义。

引言

当大脑处于静息状态时，功能相关的脑区会表现出高度同步的自发性活动，这些区域可能在空间位置上彼此邻近，也可能相距较远。这些同步活动的区域被称为功能网络^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。这一现象最初由一项功能磁共振成像（fMRI）研究发现，该研究采用血氧水平依赖（BOLD）信号来反映脑部血液的氧合水平^5,10，也称为静息态功能连接（RSFC）。RSFC的异常已与自闭症¹¹、阿尔茨海默病¹²和抑郁症¹³等脑部疾病相关联。因此，RSFC是一种有价值的工具，可用于研究那些难以完成基于任务评估的患者。然而，许多患者（如年幼的自闭症儿童）并不适合接受fMRI检查，因为该检查要求患者在狭小的空间内长时间保持静止不动^14,15。光学成像技术具有快速、可穿戴的优点，因此适用于大多数患者，尤其是儿科人群^{16,17,18,19,20,21,22,23,24}。利用这些优势，功能性近红外光谱成像（fNIRS）能够量化脑内血红蛋白浓度和氧饱和度参数，已被用于测量人类的RSFC（包括儿科人群^4,8,25以及自闭症患者¹¹）。

光学扩散相关光谱（DCS）是一种相对较新的光学技术，可量化脑血流量，该参数与氧气供应和代谢密切相关^{6,17,26,27,28,29}。研究表明，与氧合对比相比，DCS 量化的光学流速对比在大脑中具有更高的敏感性³⁰。因此，利用 DCS 衍生的脑血流参数来评估静息态功能连接（RSFC）具有优势。

扩散相关光谱（DCS）对流动的血细胞具有敏感性。当扩散的光子与流动的血细胞发生散射时，会导致探测到的光强度随时间发生波动。DCS通过测量基于时间的强度自相关函数，其衰减速率依赖于光学参数和血流状态。这些数值最终用于获得脑血流指数（CBFi）。血细胞运动越快，强度自相关函数的衰减也越快。因此，可以通过对随时间变化的散射光波动进行测量，推导出组织深层（例如大脑）中运动信息^{27,31,32,33,34,35}。DCS是一种与广为人知的功能性近红外光谱（fNIRS）互补的技术，后者用于测量血液氧合状态^17,36。由于fNIRS和DCS均为具有毫秒级高时间分辨率的光学脑成像技术，因此其光学成像系统对运动伪影的敏感性远低于功能性磁共振成像（fMRI）。这两种技术也已成功应用于包括婴幼儿在内的儿科人群的功能性脑成像研究¹⁶。此前，已有研究在小鼠的临床前实验中利用表层血流测量来评估静息态功能连接（RSFC）³⁷。本研究则以九名健康成人为对象，利用血流参数对RSFC进行量化，作为一项概念验证研究^38,39。

本研究使用了一种商用的FD-fNIRS系统和一套自行设计的DCS系统（参见材料表）。该自行搭建的DCS系统包含两个785 nm、100 mW、长相干长度的连续波激光器，激光器通过FC接头连接，以及八个单光子计数模块（SPCM），并与一个自相关器相连。此外，还专门为该系统开发了自定义的软件图形用户界面（GUI），用于实时显示和保存每个SPCM通道的光子计数、自相关曲线以及半定量血流数据。该系统所用组件在DCS研究中广泛应用^{16,17,31,32,40,42,43,44}，所得结果已在本实验室内部验证，并应用于最近的一项研究中³⁹。

方案

该方案已获得莱特州立大学机构审查委员会的批准，且在实验开始前已从每位参与者处获得知情同意。

1. 受试者准备

1. 在开始任何受试者测量之前，先启动 FD-fNIRS 和 DCS 系统并预热至少 10 分钟（详见第 2 和第 3 节）。图 1 展示了使用紧凑型 DCS 仪器进行受试者测量的示例。
2. 首先，使用卷尺测量每位受试者头部鼻根点（nasion）到枕外隆凸点（inion）之间的距离（图 2A）。
3. 以鼻根点为起点，用记号笔标记出至枕外隆凸点距离的 10% 处位置。该点对应脑电图 10/20 定位法中 Fp1 与 Fp2 之间的中点（图 2A）。
4. 使用 EEG 10/20 帽（见材料表），调整帽的位置，使所标记的点位于 Fp1 与 Fp2 之间。
5. 标记 Fp1 与 F7 之间（左侧皮层）以及 Fp2 与 F8 之间（右侧皮层）的点。这两个点分别代表左侧和右侧半球的上额叶前皮层与背外侧前额叶皮层（DLFC）之间、以及 DLFC 与下额叶前皮层（IFC）之间的边界（图 2A）。
6. 使用一个 3D 打印的探头，将多模光纤（MMF）放置在新标记的点上（图 2C 中的“S”点），并将每根光纤连接至 785 nm 激光光源（图 2B,C）。
7. 将单模光纤（SMFs）放置在距离 MMF 2.75 cm 的位置。其中两根光纤置于 DLFC 区域（位置标记为“DLFC,1”和“DLFC,2”），一根置于 IFC 区域（位置标记为“IFC”）。在皮层两侧均按相同方式布置 SMF，共放置六根 SMF（图 2c）。
8. 在皮层两侧的“D_s”位置，于 MMF 下方 1 cm 处再各放置一根 SMF（用于检测头皮血流），并将每根 SMF 连接到独立的单光子计数装置（图 2C）。

p class="jove_title">2. FD-fNIRS 设置与校准

1. 关闭所有光源，并启动 FD-fNIRS 系统以准备校准。
   警告：作为一般预防措施，请勿直接注视光源和光纤输出端，以免造成眼睛损伤。请使用红外传感器卡（材料表）。
2. 避免探测器暴露于室内光照水平下，以确保无噪声运行并防止探测器受损。
3. 通过启动系统并使其在光源开启、调制开启和探测器电压开启的状态下运行至少 10 分钟（建议最佳时间为最少 20 分钟，最长 1 小时），以预热光源和探测器，确保系统达到最佳的准确性和稳定性。
4. 运行基于图形用户界面（GUI）的数据采集软件。将传感器牢固地连接并固定在已知光学特性的校准模型（基于聚二甲基硅氧烷的模型，参见 材料表）上，然后按下“自动偏置”按钮，调节探测器增益以获得最佳信号。如果出现过压警告闪烁，请降低增益。
5. 在调节探测器增益以获得最大信号后，断开其中一个光源光纤与探测器的连接，并验证对应光源光纤的直流（DC）信号在每个测量周期内低于 20 计数。如果高于此值，则可能存在过多的室内光线泄漏进入探测器⁴⁵。若如此，应关闭系统电源，阻挡或移除室内多余光源，然后重复步骤 2.4–2.5。
6. 验证每个光源和探测器的信号水平是否正常。系统定义正常信号范围为每个测量周期内计数在 100 以上且低于 1,500。
7. 在图形用户界面中点击“校准”按钮执行校准。系统将自动采集测量数据，并应用校准因子以准确测量已知模型的光学特性。这些校准因子将被保存，并在后续的活体测量中自动应用。
8. 记录校准数据，以便留存系统在标准模型上的性能记录。

3. DCS 设置

警告：作为一般预防措施，切勿直接注视光源和光纤输出端，以免造成潜在的眼部损伤。请使用红外传感器卡（参见材料表）。

1. 避免探测器暴露于不必要的光源（如室内光线），以获取准确的原始数据用于自相关曲线分析，并防止探测器受损。
2. 开启 DCS 激光光源和 SPCM（见材料表），并使其预热至少 10 分钟（建议最短 20 分钟，最长 1 小时，以获得最佳准确性和稳定性）。
3. 运行基于图形用户界面（GUI）的 DCS 数据采集软件，该软件显示每个探测器的光子计数及半定量的实时血流值。调整光纤位置、角度（光纤端面应垂直于皮肤表面）以及数据采集时机，使信号保持在每秒至少 5,000 计数（以获得足够的信噪比）且低于每秒 1,000,000 计数（避免损坏探测器）（图 3A）。
4. 通过检查显示器上各探测器的光子计数水平及近实时自相关曲线，确认光子计数水平足够（来自步骤 3.3）。
5. 通过检查显示器上自相关曲线的 y 轴截距，确认光纤接触充分且无环境光泄漏。未使用偏振片时，理想值约为 1.5（图 3B）。
6. 通过收紧弹性绑带，确保探头和测量不易受运动伪影影响，绑带应足够紧以抵抗运动，但又不至于使受试者感到不适。同时，用户应持续监测显示器上的自相关曲线，确保自相关曲线在较长相关时间（τ > 10 ms）下衰减至 1（图 3C）。

4. 数据收集

1. 指导受试者在8分钟测量期间尽量减少任何身体活动。
2. 关闭灯光，并确保受试者处于舒适坐姿，双眼闭合。
3. 通过将FD-fNIRS系统的光学探头放置在靠近DCS探头的前额区域，进行基线FD-fNIRS测量。然后，在FD-fNIRS采集GUI中点击“Acquire”按钮。该数据将提供用于量化动态光学参数CBFi的静态光学特性、吸收参数和散射参数（μ_a, μ'_s）^17,20。
4. 完成FD-fNIRS测量后，在DCS数据采集GUI中点击“Run”按钮，开始光学DCS测量的数据采集。总共采集8分钟数据，最大积分时间为2秒（根据每位受试者的信噪比，更短时间更佳）。
5. 如有必要，在初次实验后1小时内重复实验，或在一天中相近的时间段重复实验，以减少疲劳、兴奋剂或温度等外部因素带来的变异。

5. 数据分析

1. 对于频域功能近红外光谱（FD-fNIRS）数据，提取通过斜率法处理得到的光学吸收和散射特性（μ_a, μ'_s）^{46,47,48,49,50,51,52,53}。
2. 对于扩散相关光谱（DCS），由于需要进行后处理，将来自八个通道的每个通道的自相关原始数据导入数据分析软件。
3. 脑血流（CBF）相关参数的量化方法在近期综述中有详细描述^6,27,54。简而言之，从归一化的强度自相关函数（g₂ [r,τ]）出发，利用Sieger关系式提取归一化的漫射电场时间自相关函数（g₁ [r,τ]）：g₂ (r,τ) = 1 + β | g ₁ (r,τ)|²。
   注：β 是一个常数，与检测到的空间模式数量成正比^{6,17,27,55,56}，取值范围为0到1，可通过拟合（归一化的）电场自相关函数 g₁ 获得。
4. 为了从拟合中获得一个与血流相关的参数（αD_B），使用 g₁ 的解析解^6,27,54，并将数据拟合至模型或衰减速率：
   EQUATION ONE
   注：上述方程中，k_o  是光在介质中的波数，α 是与组织血容量分数成正比的因子，D_B 是有效布朗运动系数。αD_B  可定义为血流指数（BFI）^6,54 或 CBFi¹⁷。本文中采用 CBFi。
5. 使用从 FD-fNIRS 获得的光学参数进行模型拟合，主要拟合参数为 CBFi 和 β。
   注：图3A 展示了可用于分析的代表性数据。若出现以下情况，则舍弃 DCS 数据：(1) 自相关函数显著低于1.5（β < 0.5）（例如 图3B 中函数值约为1.2，β < 0.2，这是由于环境光泄漏所致）；或 (2) 在较长相关时间（τ > 10 ms）下，自相关曲线未衰减至1（例如 图3C 中，由于头部或探头移动等运动伪影导致数据不可用）。
6. 使用二阶多项式拟合对量化结果进行去趋势处理，以消除缓慢漂移（图4A）。
7. 使用通带为0.009–0.080 Hz的零相位二阶巴特沃斯滤波器，去除如 Mayer 波等不需要的脑频率信号（图4A）。
8. 使用线性回归，将每个通道的数据相对于短距离测量值进行残差分析，以去除大脑皮层两侧表层头皮信号的影响（图4B）。
9. 计算每对通道之间的皮尔逊相关系数，以识别脑区间静息态功能连接性（图5）。
10. 使用 Fisher Z 变换将相关系数转换为 z 值，并进行 t-检验以获得 p 值（图5）。采用错误发现率（FDR）对多重比较进行校正。

结果

已成功验证使用扩散相关光谱（DCS）测量功能连接的可行性³⁹。研究测量了九名受试者前额叶皮层的静息态功能连接性。结果（均值 ± 标准差）显示，左侧（0.64 ± 0.25）和右侧（0.62 ± 0.23）皮层的区域内相关性高于区域间相关性，后者分别为左侧（0.32 ± 0.32）、（0.34 ± 0.27）和右侧（0.34 ± 0.29）、（0.34 ± 0.26）皮层。（图5）。同时进行了功效分析，设定功效为0.8、显著性水平为0.05，结果在样本量为八时达到0.82的功效（低于本研究中分析的受试者数量）。

为了检验不同脑区间与同一脑区内静息态功能连接（RSFC）之间是否存在显著差异，首先通过Fisher Z变换将相关系数转换为z值，随后对两个皮层的脑区间和脑区内RSFC进行t检验比较。结果显示p值≤0.0002，表明两者之间存在显著差异，该结果与既往fNIRS研究的发现一致^8,

讨论

为了确定通过扩散相关光谱（DCS）测量的脑血流（CBF）是否能够准确检测到静息态功能连接（RSFC），本研究选取了两个具有已知静息态功能连接特性的脑区进行分析。通常认为背外侧前额叶皮层（DLFC）区域之间以及DLFC与额下皮层（IFC）之间存在功能连接^57,58,59。选择左侧和右侧DLFC内两个位点之间的连接，是因为区域内的连接通常较强；同时选择IFC与DLFC之间的连接，是因为区域间的连接已知较弱。

DCS 技术显示出 DLFC 区域内部具有较高的连接性，但 IFC 与 DLFC 区域之间的连接性较低，这与其他方法（如 fMRI）进行的类似研究结果一致。这些结果表明 DCS 在无创评估人类静息态功能连接（RSFC）方面具有潜力。当与 fNIRS 等其他成像方式结合时，可实现对自闭症等神经疾病进行准确表征。尽管同步进行 fNIRS 与 DCS 测量仍存在挑战，但已有多种方法对此问题进行了探索

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 打印探头	自主研发	N/A	3D 打印 PLA 探头（Craftbot，Craft unique）
785nm，100mW，连续波，FC 耦合激光器	CrystaLaser	DL785-100-S	DCS 组件（光源）
自相关仪	Correlator.com	Flex05-8ch	DCS 组件（向计算机输出 g2 曲线）
数据采集图形用户界面	自主研发	N/A	使用 LabVIEW 编写的用于运行 DCS 系统的图形用户界面
数据分析软件	自主研发	N/A	用于获得 RSFC 结果的 Matlab 代码
EEG 电极帽	OpenBCI	N/A	带有标准 10/20 位置的 EEG 网格帽
多模光纤	OZ Optics	QMMJ-3,2.5-IRVIS-600/630-3PCBK-3	DCS 组件（光源光纤）
Oxiplex 校准模体	ISS	75019，75020	两套 PDMS 校准模体
Oxiplex 肌肉探头	ISS	86010	四通道肌肉探头
Oxiplex 氧饱和度仪	ISS	95205	频域功能性近红外光谱仪（FD-fNIRS，690nm，830nm）
功率计	Thorlabs	PM100D	激光功率调节器
传感器卡	Thorlabs	F-IRC1-S	激光红外光束观察卡
单模光纤	OZ Optics	SMJ-3S2.5-780-5/125-3PCBK-3	DCS 组件（探测光纤）
单光子计数装置	Excelitas	SPMC-NIR-1x2-FC	DCS 组件（探测器）