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方法文章

粪菌移植及肠道中IgA包被细菌丰度的检测

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DOI：

10.3791/60772

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2020年7月23日

 ,  , 
1Department of Rheumatology and Immunology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Sciences, Nanjing University

本文内容

摘要

我们建立了一种在三天内高效清除肠道细菌的方法，随后通过灌胃移植来自小鼠新鲜或冷冻肠道内容物制备的粪便悬液，实现粪便微生物群的移植。我们还提供了一种优化的方法，用于检测肠道中IgA包被细菌的频率。

摘要

肠道微生物群在人类健康与疾病中发挥着多效性作用。粪便微生物群移植（FMT）是一种有效的方法，可用于整体或在物种水平上研究肠道细菌的生物学功能。已有多种不同的FMT方法被发表。本文介绍一种FMT方案，可在数天内成功清除小鼠肠道微生物群，随后将来自新鲜或冷冻供体肠道内容物的粪便微生物群移植至普通小鼠体内。采用实时PCR检测细菌清除效果，再通过16S核糖体RNA（rRNA）测序分析受体小鼠肠道微生物群的相对丰度及种类组成。此外，我们还介绍了一种基于流式细胞术的检测方法，用于检测肠道中免疫球蛋白A（IgA）包被的细菌。

引言

肠道微生物群的多样性在维持宿主稳态中发挥着重要作用。该微生物组参与多种生理过程，包括食物中营养物质的消化与吸收、抵御病原体感染、调节免疫系统的发育以及维持免疫稳态1。肠道微生物组成的变化已被证实与多种疾病相关，包括癌症2、自身免疫性疾病3、炎症性肠病4、神经系统疾病5以及代谢性疾病6,7。无菌（GF）小鼠是研究粪便微生物移植模型中微生物群生物学效应的有力工具8。然而，无菌饲养环境要求极为严格，且在这些小鼠中进行粪便微生物移植（FMT）成本高昂。此外，与普通小鼠相比，无菌小鼠具有不同的屏障结构和黏膜特性，从而影响细菌的穿透能力9。这些因素限制了无菌小鼠在研究中的广泛应用。一种替代方案是使用抗生素鸡尾酒疗法清除普通小鼠体内的微生物群，随后进行粪便微生物移植（FMT）。既往报道的FMT方法描述不充分且缺乏一致性，因此有必要建立一种可行、高效且可重复的利用普通小鼠进行FMT的实验方案。

成功的粪菌移植（FMT）涉及多个关键步骤。其中，微生物群清除的效率是首要的重要环节。在细菌清除方面，已有研究报道可使用单一广谱抗生素（例如链霉素10）或多种抗生素组合（三联或四联抗生素治疗）11,12。包含氨苄西林、甲硝唑、新霉素和万古霉素的四联抗生素治疗方案被证明是最有效的干预措施，并已在多项研究中应用13,14,15。除了所用抗生素的种类外，给药途径、剂量和治疗持续时间也会影响细菌清除的效果。一些研究人员通过饮水方式给予抗生素，以清除胃肠道内的细菌15。然而，这种方法难以精确控制每只小鼠实际摄入的抗生素剂量。因此，在后续研究中，研究人员通常采用灌胃方式对小鼠进行为期1–2周的抗生素处理12，以实现充分的微生物清除。但长期使用抗生素可能存在一定问题，因为抗生素本身可能会影响啮齿类动物模型中的某些疾病表型16。因此，亟需开发更快且更高效的微生物群清除方法。

粪便液体的制备是确保粪菌移植（FMT）成功的关键步骤之一。在胃肠道中，pH值从胃部的1变化至近端和远端肠道的79。由于胃内酸性较强，其微生物群受到限制，主要包括Helicobacter pylori17。近端肠道产生胆汁酸以实现肝-肠循环，并含有与脂肪、蛋白质和葡萄糖消化相关的微生物群。远端肠道则富含厌氧菌，且表现出较高的微生物多样性18。鉴于肠道微生物群的空间异质性，从肠道不同区域分离肠内容物以制备粪便液体至关重要。此外，其他因素如供体样本的性质（例如新鲜或冷冻样本）、移植频率和持续时间在实施FMT时也十分关键。在定植常规小鼠的人肠道微生物群时，最常使用冷冻粪便样本19。相比之下，在动物模型中，使用来自动物供体的新鲜粪便进行FMT更为合适且更为常见20,21。FMT的频率和持续时间根据实验设计和模型的不同而有所变化。在以往的研究中，FMT可每日进行或每隔一天进行一次，移植持续时间从3天22到5周23不等。除上述因素外，维持无菌手术环境并使用灭菌的手术器械对于避免意外的环境细菌污染也至关重要。

肠道微生物群可能调控表达免疫球蛋白A（IgA）的细胞的积聚。IgA是一种主要的抗体同种型，在通过中和和排除作用保护宿主免受感染方面具有关键作用。高亲和力的IgA可转胞吞进入肠腔，并能够结合并包被致病菌。相反，IgA包被可能为某些细菌提供定植优势24。与病原体诱导产生的IgA不同，由内源性共生菌诱导产生的IgA具有较低的亲和力和特异性25。据报道，在某些疾病中，被IgA包被的肠道细菌比例显著升高25,26。被IgA包被的细菌可启动IgA产生的正反馈循环27。因此，IgA包被细菌的相对水平可用于预测肠道内炎症反应的强度。事实上，该组合可通过流式细胞术进行检测28。Floris等人27、Palm等人25以及Andrew等人29利用基于IgA的分选方法，从小鼠粪便中分离出IgA+和IgA-细菌，并通过16S rRNA测序对菌群特异性的包被肠道微生物群进行了表征。

本研究中，我们描述了一种优化的方法，可高效耗竭肠道优势菌群，并利用从小肠和结肠内容物中分离的新鲜或冻存粪便微生物群对常规小鼠进行定植。我们还展示了一种基于流式细胞术的方法，用于检测肠道中与IgA结合的细菌。

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方案

动物实验按照中国现行的动物护理和使用的伦理规定进行。

注意：动物饲养在25 °C、12小时光照和12小时黑暗循环的特定病原体排除（SPF）级可控环境中。小鼠食用的饲料在使用前经过辐照处理。饮用水和笼具在使用前均经过高压灭菌。实验选用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，在适应环境1周后进行实验。根据实验设计将小鼠分为若干组，每组至少包含3只小鼠。

1. 肠道微生物群耗竭

  1. 抗生素混合液的制备
    1. 在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中配制抗生素溶液，含0.5 mg/mL盐酸万古霉素、1 mg/mL甲硝唑、1 mg/mL氨苄青霉素钠盐和1 mg/mL硫酸新霉素。
      注意：抗生素应保存在 2–8 °C 环境中，避免光照。抗生素混合液需现配现用。
  2. 治疗方案
    1. 连续3天，使用10号针头对小鼠灌胃给予200 μL制备好的抗生素混合液。用一只手垂直固定小鼠，另一只手调整针头角度，避免插入胃部。
      注意：必须轻柔地处理小鼠，以避免其挣扎，因为食管和胃的表面损伤可能导致炎症或死亡。
    2. 按照步骤1.1.1中指示的相同浓度，将抗生素加入饮水中。
    3. 三天后，通过 CO 处死小鼠2 窒息
    4. 使用无菌器械无菌解剖腹部。在距离盲肠2 cm处截取一段2 cm长的回肠。用无菌镊子夹住肠段一端，将新鲜内容物挤出并收集至预先称重的离心管中。
    5. 用手术剪将盲肠剪成两半以收集其内容物。将每半盲肠的内容物挤入预先称重的离心管中。
  3. 评估肠道菌群耗竭效果。
    1. 称取来自未处理小鼠和抗生素鸡尾酒处理小鼠回肠或盲肠的肠内容物，使用试剂盒按照制造商说明书提取粪便微生物DNA。根据以下公式确定DNA浓度：

      浓度样本 (μg/mL) = OD260 ×50
       
    2. 构建标准曲线。
      1. 扩增 大肠杆菌 使用 V3-V4 区域通过聚合酶链式反应（PCR）扩增基因 特异的 引物。95 °C 预变性 1 分钟，进行 40 个循环：95 °C 变性 10 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒。
      2. 通过将扩增产物连接至TA载体来构建质粒。根据制造商说明书，使用TA载体试剂盒进行克隆培养。
      3. 根据OD值测定质粒浓度（ng/μL）260 步骤1.3.1中所述的值
        注意：质粒浓度的单位与DNA浓度的单位不同。
      4. 使用以下公式计算拷贝数，其中 MW 代表分子量：

        1 μL 中的拷贝数 = 浓度（ng/μL）× 10-9 × 6.02 × 1023/（MW质粒 x 660
         
      5. 用双蒸水将质粒重新溶解，配制成终浓度为 40 µg/μL 的溶液。制备包含八个梯度的 10 倍系列稀释液。通过绘制 CT 值（Y轴）相对于对数（拷贝数质粒）（X轴）在PCR扩增后，其中CT 代表目标扩增的循环阈值。从图中提取方程（本例中为 y = -3.07x + 45.07，R2 = 0.994).
    3. 扩增步骤1.3.1中提取的1 μL DNA样品 回肠 或 盲肠 来自 naive 对照组和抗生素鸡尾酒处理组的样本，按照步骤 1.3.2.1 中所述方法通过实时 PCR 检测。根据步骤 1.3.2.5 中的标准曲线计算每 1 μL DNA 样本中的拷贝数，然后使用以下公式计算总拷贝数：
      加权样品中的总拷贝数（每毫克）= 拷贝数 × 总DNA体积 / 样品初始重量
  4. 通过测序16S rRNA的V3和V4区分析微生物群DNA。

2. 粪便微生物群移植

  1. 新鲜和冻存粪便样本的粪便液体制备
    注意：所有器械在使用前均需浸泡于75%酒精中，以避免预先存在的细菌污染。在收集回肠和结肠内容物时，必须严格避免污染。
    1. 通过CO2窒息法处死3–5只供体小鼠。
    2. 按照步骤1.2.4所述方法收集回肠内容物。
    3. 为收集结肠内容物，在靠近肛门处做第一道切口，并剪取上方约2 cm的肠段。按步骤1.2.4所述方法提取内容物，整个操作应在1分钟内完成，以减少暴露于空气中的时间。
    4. 对于冻存粪便液体，按照步骤2.1.2和2.1.3所述收集回肠或结肠内容物，并用液氮速冻。
    5. 将样本储存于-80 °C冰箱中，直至使用。
  2. 将内容物混合并称重，加入含珠子的新鲜无菌管中。对于冻存样本，需先在冰上解冻粪便颗粒，再进行称重。
  3. 向管中加入无菌PBS，使用5 mL注射器针头将粪便颗粒重悬于PBS中（每0.2 g粪便颗粒加入1 mL PBS）。利用珠子充分匀浆粪便颗粒，并涡旋振荡3次，每次1分钟。
  4. 以800 × g离心3分钟，随后将上清液通过70 µm细胞筛过滤。将过滤后的粪便液体收集至无菌管中，立即用于粪便微生物移植（FMT）。

3. 粪便微生物群移植操作步骤

  1. 每隔一天通过口服灌胃向无菌小鼠给予 200 µL 制备好的粪便悬液，持续 7 天。对照组小鼠则灌胃 200 µL 无菌 PBS。
  2. 采用 CO2 窒息法处死小鼠，并按照步骤 2.1.2 和 2.1.3 收集回肠和结肠内容物。将样本储存于 -80 °C，待后续处理。
  3. 按照步骤 1.3.1 所述方法提取回肠和结肠内容物中的微生物组 DNA。通过 16S rRNA 测序验证移植小鼠肠道内微生物组的组成。

4. IgA 包被细菌的检测

  1. 样品制备
    1. 按照步骤 2.1.2 和 2.1.3 所述方法，收集供体小鼠的 50 mg 粪便颗粒，并在 1 mL 无菌 PBS 中于 4 °C 下孵育 1 小时。使用珠磨机均质化颗粒，持续 5 秒。
    2. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。通过 70 µm 滤网过滤后收集上清液。
      注意：避免高速离心。
    3. 将 5 µL 上清液加入含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1 mL PBS（FACS 缓冲液）中。在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    4. 将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中，在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      注意：此处使用的体积可能需要优化。此步骤中过多的上清液可能会掩盖 IgA 包被细菌的阳性信号。
    5. 将沉淀重悬于含 10% 山羊血清的 100 µL PBS 中，冰上或 4 °C 下孵育 30 分钟。向管中加入 1 mL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。
  2. 流式细胞术
    1. 将步骤 4.1.5 获得的沉淀重悬于 200 µL 含生物素标记抗小鼠 IgA 抗体（1:100）和 APC 标记抗生物素抗体（1:100）的 FACS 缓冲液中，在 4 °C 下孵育 30 分钟。
    2. 向管中加入 1 mL FACS 缓冲液，在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    3. 向步骤 4.2.2 获得的沉淀中加入含绿色荧光核酸染料（1:200）的 200 µL FACS 缓冲液进行染色，在 4 °C 下孵育 5 分钟。
    4. 加入 1 mL FACS 缓冲液，在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。
    5. 在检测前将沉淀重悬于 250 µL FACS 缓冲液中。
    6. 使用流式细胞仪采集数据，并使用 FlowJo 软件进行分析。

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结果

本研究中使用的粪便微生物移植（FMT）方案如图所示 图1经抗生素鸡尾酒处理后，通过测序16S rRNA区域分析肠道微生物群耗竭效率。我们在未处理小鼠的回肠中检测到196个物种，而经过3天抗生素处理后，细菌物种迅速减少至35个图2A）。在仅接受抗生素混合物处理的小鼠中检测到八个物种（图2A）。在属水平上的β多样性分析进一步表明，无特定病原体小鼠回肠中的主要细菌，例如 拟杆菌目S24-7科未分类属，脱硫弧菌属 乳酸杆菌, 和 金黄色葡萄球菌， 经抗生素鸡尾酒疗法处理后被清除。相比之下， 埃希氏菌-志贺氏菌 在抗生素处理的小鼠中，占肠道细菌总数的99%以上（图2B）。除了细菌种类显著减少外，与未处理小鼠相比，接受抗生素混合物的小鼠在回肠和盲肠等量肠道内容物中的拷贝数也显著降低（...

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讨论

在耗竭操作中使用的抗生素具有不同的抗菌特性。万古霉素特异性作用于革兰氏阳性菌30。口服多西环素可显著改变雌性C57BL/6NCrl小鼠的肠道微生物群组成31。新霉素是一种广谱抗生素，可靶向大多数肠道定植细菌32，但不能预防肠道炎症。广谱抗生素鸡尾酒疗法比单一抗生素更有效13,33,34。一项研究报道，三联抗生素治疗（阿莫西林、磷霉素和甲硝唑）可协同耗竭溃疡性结肠炎中的失衡肠道微生物群落11。四联抗生素治疗在哮喘小鼠模型13和高脂饮食小鼠模型14中成功清除了肠道微生物群。在以往的研究中，通过将单一抗生素溶解于饮水中进行微生物群耗竭需要超过6周的治疗周期

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作在四川大学华西医院跨学科杰出项目（资助编号：ZYJC18024）和国家自然科学基金（资助编号：81770101 和 81973540）的资助下完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 mL 注射器针头Sheng guang biotech5mL
70 µm 细胞筛BD biosciences352350
氨苄青霉素钠盐AMERESCO0339
APC 标记链霉亲和素BD biosciences554067
生物素标记抗小鼠 IgA 抗体Biolegend407003
牛血清白蛋白 (BSA)SigmaB2064-50G
C57BL/6J 小鼠成都大硕
CO2西源生物
大肠杆菌基因组 DNATsingKe
Eppendorf 管AxygenMCT150-C
Fast DNA 粪便微型操作手册QIAGEN51604
甲硝唑曙雁S17079-5g
新霉素硫酸盐SIGMAN-1876
口服灌胃针宇科生物10#
pClone007 通用简单 TA 克隆载体试剂盒TsingKe007VS
磷酸盐缓冲液 (PBS)HycloneSH30256
Precellys 细胞裂解试剂盒PrecellysKT03961-1-001.2
RT-PCR SYBR MIXVazymeQ411-01
SYTO BC 绿色荧光核酸染料Thermo fisher scientificS34855
V338 F 引物TsingKeACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R 引物TsingKeGGACTACHVGGGTWTCTAAT
盐酸万古霉素SigmaV2002
仪器设备
BD FACSCalibur 流式细胞仪BD biosciences
珠磨式涡旋振荡器Scilogex
BIORAD CFX ConnectBIORAD
离心机Eppendorf
Illumina MiSeqIllumina
Nanodrop 核酸测定仪Thermo fisher scientific
手术器械宇科生物
软件
Adobe Illustrator CC 2015Version 2015
BIORAD CFX qPCR 软件
FlowJo 软件
Graphpad Prism 7
数据库
Silva (SSU132) 16S rRNA 数据库

参考文献

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