粪菌移植及肠道中IgA包被细菌丰度的检测

摘要

我们建立了一种在三天内高效清除肠道细菌的方法，随后通过灌胃移植来自小鼠新鲜或冷冻肠道内容物制备的粪便悬液，实现粪便微生物群的移植。我们还提供了一种优化的方法，用于检测肠道中IgA包被细菌的频率。

摘要

肠道微生物群在人类健康与疾病中发挥着多效性作用。粪便微生物群移植（FMT）是一种有效的方法，可用于整体或在物种水平上研究肠道细菌的生物学功能。已有多种不同的FMT方法被发表。本文介绍一种FMT方案，可在数天内成功清除小鼠肠道微生物群，随后将来自新鲜或冷冻供体肠道内容物的粪便微生物群移植至普通小鼠体内。采用实时PCR检测细菌清除效果，再通过16S核糖体RNA（rRNA）测序分析受体小鼠肠道微生物群的相对丰度及种类组成。此外，我们还介绍了一种基于流式细胞术的检测方法，用于检测肠道中免疫球蛋白A（IgA）包被的细菌。

引言

肠道微生物群的多样性在维持宿主稳态中发挥着重要作用。该微生物组参与多种生理过程，包括食物中营养物质的消化与吸收、抵御病原体感染、调节免疫系统的发育以及维持免疫稳态¹。肠道微生物组成的变化已被证实与多种疾病相关，包括癌症²、自身免疫性疾病³、炎症性肠病⁴、神经系统疾病⁵以及代谢性疾病^6,7。无菌（GF）小鼠是研究粪便微生物移植模型中微生物群生物学效应的有力工具⁸。然而，无菌饲养环境要求极为严格，且在这些小鼠中进行粪便微生物移植（FMT）成本高昂。此外，与普通小鼠相比，无菌小鼠具有不同的屏障结构和黏膜特性，从而影响细菌的穿透能力⁹。这些因素限制了无菌小鼠在研究中的广泛应用。一种替代方案是使用抗生素鸡尾酒疗法清除普通小鼠体内的微生物群，随后进行粪便微生物移植（FMT）。既往报道的FMT方法描述不充分且缺乏一致性，因此有必要建立一种可行、高效且可重复的利用普通小鼠进行FMT的实验方案。

成功的粪菌移植（FMT）涉及多个关键步骤。其中，微生....

方案

动物实验按照中国现行的动物护理和使用的伦理规定进行。

注意：动物饲养在25 °C、12小时光照和12小时黑暗循环的特定病原体排除（SPF）级可控环境中。小鼠食用的饲料在使用前经过辐照处理。饮用水和笼具在使用前均经过高压灭菌。实验选用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，在适应环境1周后进行实验。根据实验设计将小鼠分为若干组，每组至少包含3只小鼠。

1. 肠道微生物群耗竭

1. 抗生素混合液的制备
   1. 在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中配制抗生素溶液，含0.5 mg/mL盐酸万古霉素、1 mg/mL甲硝唑、1 mg/mL氨苄青霉素钠盐和1 mg/mL硫酸新霉素。
      注意：抗生素应保存在 2–8 °C 环境中，避免光照。抗生素混合液需现配现用。
2. 治疗方案
   1. 连续3天，使用10号针头对小鼠灌胃给予200 μL制备好的抗生素混合液。用一只手垂直固定小鼠，另一只手调整针头角度，避免插入胃部。
      注意：必须轻柔地处理小鼠，以避免其挣扎，因为食管和胃的表面损伤可能导致炎症或死亡。
   2. 按照步骤1.1.1中指示的相同浓度，将抗生素加入饮水中。
   3. 三天后，通过 CO 处死小鼠₂ 窒息
   4. 使用无菌器械无菌解剖腹部。在距离盲肠2 cm处截取....

结果

本研究中使用的粪便微生物移植（FMT）方案如图所示 图1经抗生素鸡尾酒处理后，通过测序16S rRNA区域分析肠道微生物群耗竭效率。我们在未处理小鼠的回肠中检测到196个物种，而经过3天抗生素处理后，细菌物种迅速减少至35个图2A）。在仅接受抗生素混合物处理的小鼠中检测到八个物种（图2A）。在属水平上的β多样性分析进一步表明，无特定病原体小鼠回肠中的主要细菌，例如 拟杆菌目S24-7科未分类属，脱硫弧菌属 乳酸杆菌, 和 金黄色葡萄球菌， 经抗生素鸡尾酒疗法处理后被清除。相比之下， 埃希氏菌-志贺氏菌 在抗生素处理的小鼠中，占肠道细菌总数的99%以上（图2B）。除了细菌种类显著减少外，与未处理小鼠相比，接受抗生素混合物的小鼠在回肠和盲肠等量肠道内容物中的拷贝数也显著降低（.......

讨论

在耗竭操作中使用的抗生素具有不同的抗菌特性。万古霉素特异性作用于革兰氏阳性菌³⁰。口服多西环素可显著改变雌性C57BL/6NCrl小鼠的肠道微生物群组成³¹。新霉素是一种广谱抗生素，可靶向大多数肠道定植细菌³²，但不能预防肠道炎症。广谱抗生素鸡尾酒疗法比单一抗生素更有效^13,33,34。一项研究报道，三联抗生素治疗（阿莫西林、磷霉素和甲硝唑）可协同耗竭溃疡性结肠炎中的失衡肠道微生物群落¹¹。四联抗生素治疗在哮喘小鼠模型¹³和高脂饮食小鼠模型¹⁴中成功清除了肠道微生物群。在以往的研究中，通过将单一抗生素溶解于饮水中进行微生物群耗竭需要超过6周的治疗周期

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 注射器针头	Sheng guang biotech	5mL
70 µm 细胞筛	BD biosciences	352350
氨苄青霉素钠盐	AMERESCO	0339
APC 标记链霉亲和素	BD biosciences	554067
生物素标记抗小鼠 IgA 抗体	Biolegend	407003
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	B2064-50G
C57BL/6J 小鼠	成都大硕
CO2	西源生物
大肠杆菌基因组 DNA	TsingKe
Eppendorf 管	Axygen	MCT150-C
Fast DNA 粪便微型操作手册	QIAGEN	51604
甲硝唑	曙雁	S17079-5g
新霉素硫酸盐	SIGMA	N-1876
口服灌胃针	宇科生物	10#
pClone007 通用简单 TA 克隆载体试剂盒	TsingKe	007VS
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Hyclone	SH30256
Precellys 细胞裂解试剂盒	Precellys	KT03961-1-001.2
RT-PCR SYBR MIX	Vazyme	Q411-01
SYTO BC 绿色荧光核酸染料	Thermo fisher scientific	S34855
V338 F 引物	TsingKe		ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R 引物	TsingKe		GGACTACHVGGGTWTCTAAT
盐酸万古霉素	Sigma	V2002
仪器设备
BD FACSCalibur 流式细胞仪	BD biosciences
珠磨式涡旋振荡器	Scilogex
BIORAD CFX Connect	BIORAD
离心机	Eppendorf
Illumina MiSeq	Illumina
Nanodrop 核酸测定仪	Thermo fisher scientific
手术器械	宇科生物
软件
Adobe Illustrator CC 2015	Version 2015
BIORAD CFX qPCR 软件
FlowJo 软件
Graphpad Prism 7
数据库
Silva (SSU132) 16S rRNA 数据库