临床试验现场单次采血制备外周血单个核细胞团块及血浆用于生物标志物分析

摘要

本方案详细介绍了在临床试验现场可实际应用的高质量外周血单个核细胞（PBMC）和血浆生物样本的制备方法，可用于转化生物标志物分析。

摘要

外周血中生物标志物的分析在临床试验中正变得越来越重要，可用于验证治疗作用机制、评估治疗效果，并协助确定药物的剂量和给药方案。通过单次采血，可分离并处理外周血单个核细胞（PBMC），用于分析和定量蛋白质标志物；同时，血浆样本可用于循环肿瘤DNA、细胞因子及血浆代谢组学的分析。治疗过程中的纵向样本可提供特定蛋白质标志物动态变化、患者突变状态及免疫微环境演变的信息。只有在外周血样本于临床现场得到高效处理，并且从床旁到实验室的整个过程中样本均被妥善保存的情况下，上述目标才可实现。本文介绍了一种优化的通用型实验方案，可在多中心临床试验的各临床现场实施，用于获取PBMC沉淀和血浆样本，使医院实验室的临床专业人员无论其技术水平高低，均能成功提供高质量的样本。此外，还提供了针对特定下游分析方法优化的替代性方案变体。我们应用该方案研究X射线照射血液中针对DNA损伤应答（DDR）的蛋白质生物标志物，以证明该方法在已采用DDR药物和/或放射治疗的肿瘤学临床场景，以及需要进行机制性假设验证的临床前阶段中的适用性。

引言

药物研发旨在提供针对未满足医学需求的新型治疗方法，以及更精准、个性化的医疗手段。目前有多种药物作用机制正处于积极研究之中，包括酶抑制（如激酶¹、蛋白酶²或多聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP)抑制剂³）、蛋白质降解剂⁴、治疗性抗体⁵以及抗体偶联药物（ADCs）⁶等。在肿瘤学领域，为获得更优治疗方案的一个实例是使用激酶抑制剂，以期阻断促使癌细胞持续增殖的信号级联反应^1,7。检测这些激酶特异性底物磷酸化水平，是量化此类抑制剂作用机制的最佳药效动力学生物标志物⁸。其他药物可能调节特定蛋白质的表达水平，此时，在整个治疗过程中纵向定量其靶蛋白浓度变化的能力至关重要。因此，无论药物或疾病的具体特征如何，评估生物标志物以建立药物暴露与靶点调节之间的药代动力学（PK）/药效动力学（PD）关系，是早期临床开发中的最佳实践，有助于确定安全且耐受的药理活性剂量和给药方案⁹。

在肿瘤学的临床开发中，尽管通过活检进行生物标志物分析可能是验证药物作用机制的最佳途径，但试验中可获得的活检样本数量通常非常有限^10,11. 或者，外周血样本对临床试验具有重要价值，因其采集过程创伤小、快速且易于获取，便于进行纵向分析，成本低于活检，并可提供 大量信息可用于实时监测治疗效果。在外周血中评估药效学生物标志物的另一优势在于，可利用同一生物样本同时定量药代动力学（PK），从而精确建立PK/PD定量关系，并进行后续的PK/PD建模^12,13外周血单个核细胞（PBMCs）可从全血中分离，用于研究蛋白质标志物，这些标志物的表达水平或翻译后修饰可能发生改变。此外，PBMCs还可用于免疫表型分析。^14,15，免疫功能检测，例如评估抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）¹⁶ 通过RNA提取进行表观遗传学分析。同样，全血中的血浆可用于定量细胞因子，以表征患者的免疫学反应，开展代谢研究，以及分离和测序循环肿瘤DNA（ctDNA），从而监测疾病在治疗药物选择压力下的克隆演化过程，常为治疗耐药提供机制性依据^17,18,19 促进后续几代治疗药物的开发²⁰最后，从外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs）可用于通过纵向计数、DNA/RNA测序以及蛋白质生物标志物分析来评估疾病进展。²¹尽管这种分离方法与本文所述方案相容²²，许多癌症类型及疾病早期阶段中循环肿瘤细胞（CTCs）的丰度较低，这使得使用专用采血管更为合适 最大限度减少CTC降解²³.

近年来，液体活检的应用提高了临床试验中获得的信息质量，许多研究已将外周血单个核细胞（PBMC）的采集纳入其中，用于监测靶点结合情况及作用机制验证，这些监测可直接在某些血液系统恶性肿瘤的肿瘤细胞中进行，或在PBMC本身上作为肿瘤细胞的药效学（PD）替代指标^24,25,26。高质量样本的制备有助于确定针对特定病理状况最安全且最有效的治疗方案；但根据我们的经验，来自不同临床机构的PBMC制备样品质量存在较大差异，导致部分样品 无法满足后续分析的要求，进而影响了从这些研究中可获取的药效学数据量。

本文详细描述了一种易于遵循的实验方案，用于在临床环境中通过单次采血高效地同时分离外周血单个核细胞（PBMCs）和血浆样本。该方案基于单个核细胞分离管制造商提供的操作说明，并结合了实际应用中的经验改进，针对临床机构报告的执行难点进行了优化，例如离心问题、处理延迟以及向冻存管转移样本等操作。此外，也有其他商业化的替代方法可用于单个核细胞的分离，这些方法依赖于使用多糖溶液进行密度梯度离心，可选择性地加入或不加入将溶液与血液分隔的屏障²⁷。如果相关临床机构已熟练掌握此类替代方法，则可合理采用这些方法替代本方案。在此类情况下，需考虑两个因素：部分替代方法需要将全血从采集管转移至另一分离管，这一额外的人源性原始生物材料转移步骤可能带来轻微增加的安全风险；而无屏障分离的方法则依赖关键操作步骤，例如将血液样本小心地铺置于密度梯度介质之上，这需要较高的技术水平，而此类技术能力在医院实验室环境中并不总是具备。尽管如此，总体而言，这些技术在细胞活力和回收率方面具有可比性^15,28。因此，方法的选择在一定程度上取决于既往的技术经验。但在我们的实践中，单个核细胞分离管在广泛的临床背景下均能成功应用，故为我们的推荐方案。

本方案的一个终点是制备用于进一步处理成裂解物的外周血单个核细胞（PBMC）沉淀，但PBMC收集物也可用于其他最终应用，例如核酸的提取，或制备适用于免疫组织化学（IHC）方法的PBMC涂片或PBMC包埋块。重要的是，由于从患者采集的每份生物样本至少在某种程度上属于侵入性操作，本方案通过同时分离血浆以用于细胞因子分析、代谢组学研究或循环肿瘤DNA（ctDNA）测序，最大限度地提高了每份样本的可用材料利用率。

在外周生物标志物分析中，外周血单个核细胞（PBMC）裂解物在肿瘤学临床试验中有多种应用。其中一个例子是评估化疗、放疗或使用DNA损伤应答（DDR）相关酶抑制剂（如磷脂酰肌醇-3激酶相关激酶（PIKKs）⁷和PARPs^3,13）治疗过程中的DNA损伤应答。这些治疗方法旨在增加增殖细胞中的DNA损伤，从而对DDR机制和细胞周期检查点功能受损的细胞（如癌细胞）产生高毒性。本文展示了一个示例，即对接受X射线照射后的外周血中DDR生物标志物进行 研究。

方案

在每个司法管辖区，必须获得患者的知情同意，并完全遵守相关的国家伦理要求，例如《人体组织法案》（HTA——英国，2004年）和《健康保险可携性与责任法案》（HIPAA——美国，1996年）。在开始任何涉及人源材料的工作之前，务必确保已获得充分记录的伦理审批。本方案优化过程中所使用的血液样本来自英国国家健康研究所（NIHR）剑桥临床研究机构管理的“志愿者推进医学小组”（VAMP）（伦理编号16/EE/0459，研究编号CRF494，子研究编号001），并已获得适当的知情同意，该样本提供行为依据与英国国家健康研究所（NIHR）剑桥生物医学研究中心签订的人体生物样本供应协议执行。英国阿斯利康生物样本库已获得英国人体组织管理局的许可（许可证号12109），并已获得国家研究伦理服务委员会（NREC）作为研究用组织库（RTB）的批准（伦理审查委员会编号17/NW/0207）。

1. 一般准备指南

注意：本方案中所有涉及未固定的人体材料（如血液、血浆和外周血单个核细胞）的操作，均须假设这些材料可能携带潜在的传染性病原体，因此必须在适当的生物安全防护条件下进行。对于已检测为已知病原体阴性的患者样本，不得认定其无传染性，仍须采取相应的安全防护措施。由此类材料产生的废弃物也应遵循相同的生物安全防护要求，并根据当地规定进行处理和处置。

1. 选择使用柠檬酸钠或肝素钠作为抗凝剂的两种单个核细胞制备管之一。对于许多下游应用，这两种抗凝剂可互换使用，但在试验中选定其中一种之前，应先对两种抗凝剂进行测试。
2. 用患者的编码ID标记一支8 mL单个核细胞制备管，用于血液采集。将试管置于室温（18–25 °C）保存。
3. 将1×PBS储存于室温（18–25 °C）。每次制备使用30 mL。
4. 确保用于分离血浆样品的试管以及用于PBMC样品的冻存管均按照实验室手册相应部分的规定，用唯一的标识符准确标记。
5. 如果PBMC将用于检测磷酸化蛋白，请配制添加磷酸酶抑制剂的PBS：将5 mL PBS与50 µL磷酸酶抑制剂混合液2和50 µL磷酸酶抑制剂混合液3混合。现配现用，并在使用前置于冰上保存。
6. 如果PBMC将进行冷冻保存，按每份样品配制1 mL冻存液，由90% FBS + 10% DMSO混合而成。

2. PBMC 的采集（图1A）

1. 使用制造商所述的标准技术，将8 mL血液抽入单个核细胞制备管中。轻轻倒置管子8到10次，使抗凝添加剂与血液充分混匀。切勿剧烈震荡，以避免溶血。记录采血时间。
2. 采集后，将试管直立置于室温下，直至进行离心。应尽快处理样本，最好在采血后1小时内开始处理，最迟不得超过4小时。记录开始处理血液的时间。
3. 离心前立即再次轻轻倒置试管8至10次，以重新混匀血液样本。
4. 将试管/血液样本管置于水平转子（摆动吊篮式）离心机中，在室温（18–25 °C）下以1,500 – 1,800 x g 离心30分钟。确保所有试管均平衡放置。

图 1：实验流程总览及离心机的代表性图像。（A）PBMC 和血浆制备流程的示意图。*如果时间有限，步骤 2.4 可缩短至 20 分钟，步骤 3.3 至 3.6 可省略。** 如需计数细胞，可取部分样本进行。*** 若进行 ctDNA 分析/代谢组学分析，需额外增加两次离心步骤。（B）用于步骤 2.4 的水平转头离心机设置图像。（C）转子图像，包含两个装有适配器的吊篮，用于离心单个核细胞制备管。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：x g（也称为相对离心力，RCF）与 RPM（每分钟转数）是不同的单位。务必将离心机设置为 x g（RCF）。请使用在线换算计算器（见材料表）进行单位转换。若仅可使用固定角转子，则在此步骤中以 1,500 – 1,800 x g 离心 10 分钟。

5. 离心后，检查屏障下方是否存在深红色层（主要含有红细胞），以及屏障上方的两层。最上层为血浆（呈稻草色），其下方的白色层为含有外周血单个核细胞（PBMCs）的血沉棕黄层（buffy coat）。将离心管置于深色或黑色背景前观察时，这些层次可被清晰区分。

图 2：用于分离 PBMC 的试管。（A）离心前（步骤 2.4）的试管图像，左侧为空试管，右侧为含有血液的试管。（B）离心后（步骤 2.5）PBMC 层成功分离。（C）离心后保留少量血浆以确保收集全部 PBMC 的图像（步骤 2.7）。请点击此处查看此图的放大版本。

注意：如果这些层不可见，可能表明离心机设置有误。请确保使用了正确的离心机转子适配器，并正确设置了“x g” 的离心力。重复步骤 2.4。

6. 离心后立即使用血清移液管将约一半的血浆（大约 4–5 mL）转移至已标记的带盖 15 mL 圆锥形离心管中，注意不要扰动 PBMC 层。将此含血浆的离心管暂时置于湿冰上保存，留待后续步骤 4 使用。暂存备用。
7. 使用巴斯德移液管插入 PBMC 细胞层中，完整收集整个 PBMC 层，并转移至另一个带盖的 15 mL 圆锥形离心管中。必要时可连同少量血浆一并吸取，以确保完全获取 PBMC 层。通常体积为 1–2 mL。随后立即进行下文的步骤 3。

3. PBMC 洗涤步骤

注意：洗涤步骤的目的是稀释并去除外周血单个核细胞（PBMC）沉淀中残留的血小板和血浆。所有离心步骤均应在室温（18–25 °C）下进行。

1. 加入室温的 PBS 至 PBMC 管中，使总体积达到 15 mL。盖紧管盖，轻轻倒置管子 5 次以混匀细胞。
2. 在 300 x g 条件下离心 15 分钟。请注意，此步骤的离心力度远比初次离心温和。
3. 将管子置于深色/黑色背景前观察沉淀。通过真空抽吸或移液器去除上清液（图 3A）。弃去上清液，仅留下约 500 μL 液体覆盖在呈白色絮状的 PBMC 沉淀上方。

图3：外周血单个核细胞（PBMC）沉淀。（A）第一次洗涤步骤（步骤3.3）中获得的沉淀。（B）第二次洗涤（步骤3.7）中分离得到的沉淀。（C）在采血后超过4小时处理血液所得样本，在第二次洗涤（步骤3.6）中获得的出现严重溶血的沉淀。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 通过轻轻吹打残留的上清液，重悬细胞沉淀。
5. 加入额外的 1× PBS，使总体积达到 10 mL。盖紧管盖，轻轻倒置混匀 5 次。如果研究方案中需要进行细胞计数，请转至步骤 3.5.1；若无需计数，则直接进入步骤 3.6。
   1. 取 40 μL 重悬的细胞，与 40 μL 台盼蓝混合，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞。
6. 将步骤 3.5 中的细胞悬液在 300 x g 条件下离心 10 分钟。尽可能多地移除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
7. 使用细口巴斯德吸管或移液器小心吸除并弃去细胞沉淀上方残留的上清液，避免扰动细胞沉淀。完成此步骤后，沉淀上方应仅留极少或不留液体。如果本方案的终点为 PBMC 沉淀，则进入步骤 3.8；如果终点为冻存的 PBMC，则进入步骤 3.10。
8. 向沉淀中加入 50 µL 新鲜 PBS（或根据实验终点需要，使用步骤 1.5 中配制的补充 PBS），用移液器轻轻吹打，均匀重悬所有细胞。将全部细胞悬液转移至已标记的 1.5 mL 冻存管中，并立即置于湿冰上，直至进行样品冷冻。
9. 通过将标记好的样品置于液氮或干冰中进行冷冻。也可使用细胞冻存盒在 -80 °C 冰箱中冷冻细胞。若采用此方法，需先将冻存盒在 -80 °C 中充分预冷后再放入细胞管。记录细胞沉淀的冷冻时间。细胞冻结后，储存于 -80 °C，运输时需保持在干冰上冷冻状态。
10. 可选：如需冻存 PBMC，将沉淀重悬于 1 mL 冻存液（步骤 1.6）中，并转移至标记好的冻存管。后续操作按步骤 3.9 所述进行，但此情况下仅允许使用细胞冻存盒进行样品冷冻。样品在冻存盒中至少放置 24 小时后，再转移至液氮中用于运输和长期储存。

4. 血浆制备步骤（图1A）

1. 在 PBMC 沉淀物于 -80 °C 保存后，现在准备在步骤 2.6 中暂时置于湿冰上储存的血浆分装样品。如果样品用途为 ctDNA 分析，则执行以下离心步骤以澄清血浆；否则直接进入步骤 4.2。
   1. 将血浆在 4 – 8 °C 条件下，以 1,600 – 2,000 x g 离心 10 分钟（使用固定角转子），或在水平转子中离心 15 分钟。
   2. 小心吸取上清液血浆，注意不要扰动任何沉淀物，并转移至新的 15 mL 离心管中。弃去含有沉淀物的离心管。
   3. 再次将血浆在 4 – 8 °C 条件下，以 1,600 – 2,000 x g 离心 10 分钟（使用固定角转子），或在水平转子中离心 15 分钟。
   4. 小心将血浆上清液转移至新的 15 mL 离心管中，确保不扰动任何沉淀物。弃去含有沉淀物的离心管。
      注意：若无冷藏离心机，每次离心之间可将样品置于冰上 5 分钟，或在低温房间内进行离心。
2. 将血浆以每份 1 mL 分装至 5 个新的 2 mL 微量离心管中。若血浆总量不足以填满 5 个 1 mL 分装管，且预计最后一个管中血浆少于 1 mL，则使用少于 5 个离心管。若血浆总量超过 5 mL，则弃去多余部分。记录每管中血浆的总体积。
3. 立即将分装好的血浆直立放置，并于 -80 °C 冷冻保存。

5. 样品运输

1. 将PBMC沉淀和血浆样本置于干冰中运输。
2. 确保样本在运输前及运输过程中未发生解冻。包装时需加入足量干冰，以保证样本在整个运输过程中保持冻结状态，同时应考虑运输途中可能出现的延误情况。

6. 全血照射及DNA损伤应答生物标志物的Western印迹分析（图4A）

注意：这是一种离体处理方法，在临床实践中大多数情况下并不需要，但这些实验是寻找合适临床生物标志物的宝贵探索策略。血液样本应在采集后尽快处理，以确保获得最佳结果。

1. 预热X射线柜。将三个15 mL离心管分别标记为0、0.2和7 Gy。
2. 取来自同一供体的三个含有新鲜抽取血液的单个核细胞制备管，轻轻倒置混匀8至10次后，将血液转移至上述三个15 mL离心管中。
3. 将标记为0.2 Gy的离心管放入X射线柜中，关闭柜门，选择相应层架和剂量，对管内样本施加0.2 Gy的辐射剂量；随后调整柜内设置，对7 Gy标记的离心管施加7 Gy的辐射剂量。
4. 将三个离心管在37 °C条件下孵育1小时。
5. 将血液重新转移回单个核细胞制备管中，并按照临床操作流程从步骤2.4至步骤3.8进行外周血单个核细胞（PBMC）的制备。
6. 向每个细胞沉淀中加入与沉淀体积相等的裂解缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）（本例中为70 μL RIPA缓冲液），用移液器吹打混匀，在冰上孵育10分钟。若有超声破碎仪，可对样品进行超声处理（3个循环，开启30秒/关闭30秒，4 °C）；若无此设备，可用注射器反复抽吸以剪切核酸，降低样品黏度。
7. 在4 °C条件下，以≥ 15,000 x g离心10分钟。将各上清液转移至新的1.5 mL离心管中，目视评估溶血程度（肉眼观察），并采用任意合适方法测定蛋白浓度。
8. 取40 μg总裂解液与含有SDS和还原剂的上样缓冲液混合，于金属浴中煮沸5分钟。
9. 在4–12% bis-tris蛋白凝胶的每个泳道中上样20 μg样品，每一样品设复孔，进行SDS-PAGE电泳。
10. 电泳分离后，使用商用转膜系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜（20 V，10分钟），随后用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭。
11. 根据目标蛋白的分子量裁剪膜，于4 °C条件下与一抗孵育过夜（抗体种类及稀释比例见材料表）。
12. 弃去一抗，用TBST室温洗涤膜3次，每次5分钟。随后加入HRP标记的二抗，室温孵育45分钟。
13. 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
14. 加入ECL显色试剂，分析所得图像中HRP信号的强度。

结果

为了提高我们在临床试验中PBMC制备的质量，我们制定了一项操作步骤简洁明确的方案，可供医院实验室专业人员遵循，无论其是否具备分子生物学背景或实验室操作技能。我们对生产商提供的方案进行了调整，针对在多个多中心临床试验参与机构中发现或报告存在问题的操作步骤进行了优化。然而，该方案仍可根据具体需求进一步优化，例如临床机构的时间限制或下游分析的类型（参见补充文件）。我们通过检测辐射诱导DNA损伤后PBMC中特定生物标志物的变化，证明了DDR可在PBMC中进行分析。

我们从临床机构收到的最常见问题涉及离心步骤，这些步骤直接影响能否成功分离外周血单个核细胞（PBMC）并获得最终的PBMC沉淀。使用适当类型的水平转子离心机（图1B,C）是本实验方案成功的关键。然而，当临床机构仅配备固定角转子离心机时，我们建议在与水平转子相同的相对离心力（RCF）条件下执行步骤2.4，但离心时间缩短至10分钟。这可确保PBMC层与血浆有效分离（见图2B,C）。在将血液叠加于密度梯度分离介质时，离心过程需关闭刹车；而在使用单个核细胞分离管时，由于管内含有凝胶屏障，可防止较重的血细胞成分与PBMC层混合，因此离心时可开启刹车^27,28。

通过8 mL试管格式的血液离心，可获得至少4 mL高质量、未稀释的血浆，该血浆可进一步澄清，用于ctDNA测序或代谢组学研究等特殊分析^29,30（可选步骤4.1.1–4.1.4）。分离得到的PBMC数量、沉淀物大小以及溶血或红细胞污染情况，也是临床机构和样本分析经验中关注的问题。从8 mL血液中获得的细胞数量因患者及疾病状态而异，但通常沉淀体积较小，呈透明/白色（图3A,B）。由于这些特性，在洗涤步骤（2.5和3.3）中应在深色背景下观察沉淀，以避免意外吸除。有时沉淀可能因红细胞污染而呈现红色（图3C），这会对制备质量产生负面影响。为避免丢失如图3所示的小沉淀，在步骤3.7中将PBMC沉淀重悬于50 µL PBS中，有助于将其转移至冻存管。

使用这些试管并采集健康个体血液时，典型的细胞产量在每8 mL血液中为7至21 × 10⁶个细胞，细胞回收率在70%至80%之间，这与我们的经验以及先前报道的结果一致^27,28。该结果取决于个体的细胞计数以及操作人员的技术水平，且与其他采用密度梯度离心法（包括使用带有分离屏障的试管系统）所获得的细胞数量和回收率相当^15,27,28。该方法在不同疾病状态下分离PBMC数量变化的一个示例是慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中PBMC标志物的分析。在研究NCT03328273³¹中，来自7名患者的45个样本应用本方案后，从8 mL单个核细胞分离管中获得的细胞数量在1.62 × 10⁴至1.99 × 10⁹之间（表1）。另一个相关参数是通过该方法获得的PBMC裂解液的蛋白浓度，其取决于分离的细胞数量以及蛋白提取效率。第6节中裂解的细胞沉淀使用RIPA缓冲液并通过超声处理（步骤6.6）制备。通常将细胞沉淀以其相同体积的裂解缓冲液重悬，所得蛋白浓度范围为3至10 mg/mL；在此特定示例中，0、0.2和7 Gy组的裂解液浓度分别为6.8、8.3和8.6 mg/mL。然而，当接收来自未经优化制备的临床机构的样本时，患者疾病状态以及红细胞污染导致的血红蛋白存在，均可能导致较大变异。例如，体积非常小的细胞沉淀需用大于其自身体积的裂解缓冲液进行重悬，以便进行蛋白浓度测定和后续生物标志物分析，从而导致样本更为稀释。在此情况下，若样本浓度低于1 mg/mL，则可能因稀释倍数过高而难以进行如Western blot等检测。相反，在前述CLL样本中，用于重悬细胞沉淀的裂解缓冲液体积在50至500 μL之间，蛋白浓度范围为1.62至19.77 mg/mL（表1）。

当样本出现红细胞污染或溶血（图3C）时，由于红细胞中的血红蛋白被纳入，PBMC裂解液的蛋白浓度会被高估。因此，应按照实验方案第6.7步所述，对这类样本进行肉眼检查和标注。在进行生物标志物分析时，只要实验中包含上样对照，过量上样可在一定程度上弥补血红蛋白的干扰。此外，也可采用其他更定量的方法来检测溶血程度，例如在414 nm处测定吸光度³²。

根据该临床方案获取外周血单个核细胞（PBMCs）并分析其DNA损伤反应（DDR）。为了模拟放射治疗或化疗等可造成DNA损伤的临床治疗情境，我们对健康志愿者的全血进行了体外X射线辐照（图4A）。电离辐射（IR）（如X射线）可诱导多种类型的DNA损伤，包括DNA双链断裂（DSBs）。这些损伤被DNA损伤感应机制识别后，激活PIKK家族激酶，例如共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated, ATM）、ATM及Rad3相关蛋白（ATR）以及DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK），从而启动同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）等DNA修复机制。当DSBs出现时，ATM通过MRN复合物（MRE11-RAD50-NBS1）被募集至损伤位点而被激活，并在多个位点（包括Ser1981）发生自磷酸化。活化的ATM进一步磷酸化MRN复合物的组分及其他蛋白，例如组蛋白变体H2AX在Ser139位点的磷酸化（pSer139-H2AX，也称为γH2AX），从而引起从DSB位点延伸的染色质结构改变，促进其他DDR因子的募集³³。尽管PBMC增殖活性较低，但其对电离辐射具有响应能力，质谱分析方法已实现了对ATM介导的RAD50在Ser635位点磷酸化（pS635）上调的定量检测。在ATM抑制剂存在下，RAD50 pS635的磷酸化水平降低，且通过免疫组化已进一步验证RAD50 pS635可作为肿瘤中临床ATM抑制剂治疗的药效动力学（pharmacodynamic, PD）生物标志物⁸。为评估PBMC对辐射的反应，我们对健康志愿者的血液施加不同剂量的电离辐射，并在37 °C孵育1小时后采集样本（图4A）。为此，血液被转移至塑料管中，以避免因高温导致PBMC分离得率降低（步骤6.2）。我们不仅检测了已有报道的RAD50 pS635，还分析了ATM pS1981和γH2AX的激活情况。在三种情况下，均观察到随着IR剂量升高，这些翻译后修饰水平相应增加（图4B）。有趣的是，在0.2 Gy的低剂量下，ATM和RAD50的磷酸化已较为显著，提示这些翻译后修饰有望作为涉及DNA双链断裂生成的治疗手段的PD生物标志物，具有良好的动态范围，不仅适用于肿瘤组织，也适用于外周血样本。这使得可通过在治疗过程中纵向采集样本，实现对治疗药效动力学反应的动态监测。从采血到样本处理的时间至关重要，必须确保信号通路级联反应仍处于活跃状态；若处理延迟，将影响级联反应的动力学过程，可能导致作为磷酸化标志物的磷酸化事件被遗漏。

图4：根据本临床方案对离体辐照血液分离出的外周血单个核细胞（PBMCs）显示DNA损伤反应生物标志物，可用于评估治疗所致DNA损伤的程度。（A）全血辐照后PBMCs制备及DNA损伤反应（DDR）分析流程的示意图。*若需进行循环游离DNA（ctDNA）分析或代谢组学分析，需额外增加两步离心。（B）Western印迹结果显示PBMCs中DNA损伤反应相关磷酸化生物标志物的表达呈剂量依赖性上调。请点击此处查看该图的放大版本。

样本	每 8 mL 血液中的 PBMC 数量	添加的 RIPA 裂解缓冲液体积 (μL)	终浓度 (mg/mL)
A.1	39100000	70	12.16
A.2	97400000	100	4.54
A.3	233000000	150	7.63
A.4	316000000	150	16.87
A.5	387000000	150	12.60
A.6	459000000	150	12.71
A.7	414000000	200	15.67
A.8	253000000	150	14.56
A.9	509000000	300	10.67
B.1	15200000	70	2.96
B.2	10500000	50	4.59
B.3	13200000	50	3.99
B.4	34800000	100	10.41
B.5	1620000	70	7.11
B.6	70200000	100	9.26
B.7	65400000	100	12.10
B.8	91100000	150	11.82
C.1	6330000	70	4.04
C.2	4400000	150	19.77
C.3	68000000	100	8.96
C.4	35100000	50	9.30
C.5	35400000	70	10.55
C.6	99200000	100	16.19
D.1	402000000	70	7.23
D.2	826000000	300	16.95
D.3	1990000000	300	14.87
D.4	1000000000	300	18.34
D.5	1160000000	400	16.13
D.6	806000000	400	19.40
E.1	302000000	300	13.86
E.2	990000000	500	19.04
E.3	1200000000	400	17.13
F.1	4010000	50	1.62
F.2	5170000	50	2.84
F.3	2810000	50	3.69
F.4	3700000	75	3.62
F.5	3460000	70	4.03
F.6	7060000	50	3.32
G.1	60700000	70	6.57
G.2	82100000	150	7.78
G.3	30500000	70	8.28
G.4	134000000	100	15.14
G.5	91900000	100	8.61
G.6	372000000	150	15.88
G.7	574000000	200	15.01
对应于 7 名患者的纵向 PBMC 样本

表1：慢性淋巴细胞白血病患者（CLL）外周血单个核细胞沉淀物的细胞数量和蛋白质浓度。 本表中的数据来自7名参与研究NCT03328273的CLL患者，共45份外周血单个核细胞样本，样本采集于单个核细胞分离管中。这些数据是使用上述引用研究³¹中的样本生成的原始数据。

补充文件：替代实验方案选项。 请点击此处下载该文件。

讨论

高质量的外周血单个核细胞和血浆制备物可在临床试验现场稳定且可重复地制备，对于明确临床试验中外周血预测性和药效动力学转化生物标志物终点具有重要价值。本文提供了一项简明清晰的实验方案，旨在解决既往在临床试验环境中易因操作不当而出现问题的关键步骤。然而，该方案还可根据特定需求进一步优化，例如针对时间限制等条件 临床试验地点或下游分析类型（参见 补充文件).

为实现这一目标，我们展示了如何使用单个核细胞制备管从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）和血浆，以获得适用于多种下游分析的冻存PBMC沉淀和冻存血浆。我们特别强调了在步骤2.5中涉及离心及PBMC层识别，以及在步骤3.3和3.6中PBMC沉淀处理的关键操作环节。历史上，临床机构常出现的错误包括：将离心机设置为错误的单位（混淆相对离心力RCF或×g值与转速RPM值）、延迟血液样本处理、温度控制不当，以及在冻存细胞沉淀上方残留大量PBS液体。在大多数离心机转子中，若将×g值误输入为RPM设置，会导致显著的离心不足，从而造成PBMC层界限不清甚至缺失，并可能在洗涤步骤中因细胞沉淀效率低下而意外丢弃PBMC。然而，即使使用正确的离心参数和转子适配器，若患者出现白细胞减少症（leukopenia），也可能无法观察到PBMC层。该情况可能影响接受化疗或放疗的肿瘤学试验受试者，应予以考虑。本方案中另一个明确指出的关键点是：血液采集后必须在1–2小时内完成样本处理，以降低溶血对实验流程的不利影响。此外，尽量在采血后1小时内完成处理，可减少体外变异，这对药代动力学读数以及受血液保存或活性信号通路影响的生物标志物具有重要影响，如图4所示案例。若延迟样本处理，还可能对细胞活力产生不利影响，特别是当细胞需进行冷冻保存时³⁴。另一个影响PBMC得率和红细胞污染程度的因素是储存与离心温度，应保持在室温（18–25 °C）。较低温度会增加密度梯度介质的密度，导致更多红细胞和粒细胞污染，因为这些细胞聚集效果较差。相反，较高温度会导致PBMC被困在聚集的红细胞之间，从而降低制备得率^15,27,28。最后，至关重要的是，在冻存管中细胞沉淀所携带的液体体积不得超过50–100 µL，否则将对后续PBMC制备物中获得的蛋白裂解液浓度产生负面影响。过量液体将过度稀释样本，导致蛋白浓度极低的裂解液，不适合用于生物标志物分析。此外，任何翻译后修饰的保存效果也将受损，且裂解效率会显著降低。

选择单个核细胞制备管，因其在单次采血中可最简便地同时分离外周血单个核细胞（PBMC）和血浆，且据我们经验，具有优异的可重复性。该血液处理过程无需高度熟练的操作人员，且单管操作避免了血液稀释及转移至其他管的步骤，从而降低了生物危害风险；由于离心过程中可开启刹车，缩短了操作时间；所有试剂均已预置于管内，减少了实验变异。据我们经验，相较于仅使用密度梯度分离介质的传统方法，尽管此类试管成本较高，但其优势更为显著。^27,28 (£ 60个单位需410，而66份50 mL淋巴细胞分离液制备需 £ 215）。它们提供两种抗凝剂类型：肝素和柠檬酸盐，这两种抗凝剂在维持分离所得PBMC功能活性方面具有可比性。³⁵因此，选择一种抗凝剂而非另一种应基于肝素或柠檬酸盐对下游生物标志物研究可能产生的影响。已有研究表明，与肝素或柠檬酸盐相比，EDTA管可提供最高的外周血单个核细胞分离得率¹³仅使用一个试管操作的便捷性可以弥补这一考虑。如果需要分析细胞因子，则抗凝剂可能会影响血浆中检测到的细胞因子水平，因此在为临床试验选择抗凝剂之前，应先对两种抗凝剂进行测试。³⁶若血浆将用于代谢组学研究，建议使用肝素作为抗凝剂³⁷因此，对最终用户或临床试验转化科学家而言，唯一需要根据成本评估来决定的问题是，柠檬酸盐或肝素哪种更适用于其研究目的。

尽管与细胞分离管的局限性（成本较高且可用的抗凝剂种类有限）相比，其优势众多，但在临床试验中（尤其是肿瘤学领域）利用外周血单个核细胞（PBMC）或血浆获取药效学生物标志物的主要局限性可能与分离方法无关。除血液系统肿瘤可直接从外周血中取样外，其他癌症适应症中的血浆和PBMC均为替代性组织，未必能真实反映原发肿瘤的情况。外周组织可能与原发肿瘤在基因组和表观基因组上并不一致，因此，依赖特定肿瘤突变的外周生物标志物分析主要局限于血浆中的循环肿瘤DNA（ctDNA）分析或通过进一步分选PBMC层获得循环肿瘤细胞（CTC）。此外，驱动或促进肿瘤增殖的信号通路在外周血中可能并不同样活跃。这一挑战可通过应用靶向血液的生物标志物发现策略⁸来识别替代性生物标志物，或结合离体处理与血浆³⁸及PBMC制备²⁶的方法加以克服。

在当前方案中，冷冻的PBMC沉淀可在临床场所外轻松处理，以获得可用于Western印迹或ELISA技术检测的蛋白质裂解物。替代方案 已提出利用PBMCs以实现免疫组化（IHC）方法的技术补充文件此外，我们还详细说明了PBMCs的冷冻保存可能性（参见 补充文件用于免疫细胞监测，这在肿瘤学中是一项重要应用，因为免疫检查点抑制剂和抗体药物偶联物（ADCs）正越来越多地在临床试验中进行测试。对免疫功能（如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC）的评估¹⁶ 以及免疫表型分析是可与从单个核细胞制备管中分离的冻存PBMCs兼容的应用¹⁵关于冷冻保存存在一个注意事项，即冷冻可能引起某些表面和内部标志物的下调，并可能损害某些细胞功能；然而，由于在处理来自多个临床中心的样本并转运至外部实验室时存在时间限制，PBMC的冷冻保存是实施这些检测的唯一可行方法。^14,15，而这些不利影响可通过良好的解冻方法和静置期显著克服³⁹.

总之，本方案可在任何配备常规设备和材料的临床机构中可靠地制备PBMC和血浆样本，从而在全球多中心临床试验中稳健地实现外周血的转化研究终点。

最后，我们通过展示关键DNA损伤应答（DDR）因子的剂量依赖性翻译后修饰，证明了PBMC裂解物的分析可在机制层面上揭示对DNA损伤剂的应答，从而有助于指导临床开发。展望未来，采用比Western印迹更定量（例如质谱法⁴⁰）且所需样本量更少的技术（如毛细管Western印迹和ELISA），将有助于推动这些临床前结果向对PBMC患者样本进行更可靠、系统的评估迈进。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 冻存管	Nalgene, ThermoFisher	5000-1020	用于储存 PBMC 沉淀及重悬后的 PBMC
1.5 mL 微量离心管	VWR	525-0990	此为示例，可使用您偏好的供应商
15 mL 无菌聚丙烯锥形离心管	Nunc, ThermoFisher	339651	可使用其他品牌
2 mL 带螺帽的无菌管，帽盖固定	ThermoFisher	3463	用于血浆分装
20X TBS 缓冲液	ThermoFisher Scientific	28358	终浓度为 25 mM Tris、0.15 M NaCl；pH 7.5。此为示例，可自行配制母液或使用其他供应商产品
20X TBS Tween 20 缓冲液	ThermoFisher Scientific	28360	或向 TBS 中添加 0.05% Tween 20 以配制 TBST 缓冲液
自动细胞计数仪或血细胞计数板	ThermoScientific	AMQAX1000	我们使用 Countess 设备及载片，但也可采用其他方法
可调节移液器，可准确量取 50 µL 体积			用于处理小体积液体（如 Western blot、将 PBMC 沉淀转移至 1.5 mL 管）
BD Vacutainer CPT 单个核细胞分离管（含柠檬酸钠或肝素钠），8 mL	BD	362761, 362753	存在 4 mL 规格管，但若条件允许，建议使用 8 mL 管，以便单次采血获得更多的 PBMC
细胞冻存盒	ThermoFisher Scientific	5100-0001	此为示例，可使用您偏好的供应商
离心机转速单位转换器	LabTools		http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/
DMSO	Sigma-Aldrich, MERK	D2438	可使用您偏好的供应商。用于 PBMC 冻存
ECL 辣根过氧化物酶底物	ThermoFisher	34075	根据 Western blot 检测目标生物标志物所需的灵敏度，选择您偏好的试剂。也可使用其他系统，如 IRDye 标记的二抗配合成像系统
Faxitron MultiFocus X 射线柜	Faxitron Bioptics		用于血液辐照。其他型号或制造商亦可使用
胎牛血清（FBS），热灭活	ThermoScientific	102706	可使用您偏好的供应商。用于 PBMC 冻存
细尖头、无菌 1.5 mL 巴斯德吸管	VWR	414004-018	可选
固定角转子离心机			可选，用于 ctDNA/代谢组学血浆样本制备
凝胶成像系统	SYNGENE		用于成像 HRP 显色后的膜
加热块			用于 Western blot 前裂解液的变性，任何配备合适管适配器的厂家设备均可
水平转子（摆动头）离心机	Thermoscientific	Heraeus Megafuge 40R	此为示例
液氮/干冰			用于样本的速冻
Marvel 脱脂奶粉	Premier Foods		此为示例，可使用您偏好的供应商
适用于 1–200 µL 量程的移液器吸头			用于处理小体积液体（如 Western blot、将 PBMC 沉淀转移至 1.5 mL 管）
NuPAGE 4–12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1 mm 厚，10 孔	ThermoFisher Scientific	NP0321BOX	此为示例，可自行灌胶或使用您偏好的供应商
NuPAGE LDS 样品缓冲液（4X）	ThermoFisher Scientific	NP0007	用于成像 HRP 显色后的膜
NuPAGE 样品还原剂（10X）	ThermoFisher Scientific	NP0009	此为示例
PBS，不含钙、不含镁	Gibco, ThermoFisher	14190-144	通常包含在临床试剂盒中
磷酸酶抑制剂混合物 2	Sigma-Aldrich, MERK	P5726-1ML	步骤 3.7 可选
磷酸酶抑制剂混合物 3	Sigma-Aldrich, MERK	P0044-1ML	步骤 3.7 可选
兔抗 GAPDH 抗体	Cell Signaling Technology	CST 2128	在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释
兔抗 γH2AX 抗体	Cell Signaling Technology	CST 2577, lot 11	在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:2000 稀释
兔抗 pS1981 ATM 抗体	Abcam	ab81292	在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:2000 稀释
兔抗 pS635 RAD50 抗体	Cell Signaling Technology	CST 14223	在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释
兔抗总 ATM 抗体	Abcam	ab32420	在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释
兔抗总 RAD50 抗体	Cell Signaling Technology	CST 3427, lot 2	在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释
RIPA 缓冲液	Sigma-Aldrich, MERK	R0278-50ML	用于细胞裂解。此为示例，可使用您偏好的供应商
超声破碎仪	Diagenode	B01060010	使用条件为 4 °C 下循环 3 次，每次 30 秒开启、30 秒关闭。若使用其他仪器，请根据设备性能调整循环次数和强度
无菌 1.7 mL 巴斯德吸管	VWR	414004-030	此为示例，可使用您偏好的供应商
无菌移液管（5 mL 和 10 mL 容量）	Costar	4101, 4051	此为示例，可使用您偏好的供应商
台盼蓝	ThermoScientific	T10282	用于上述自动细胞计数仪
湿冰			用于保持血浆样本和裂解液低温