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通过电刺激建立大鼠急性脑桥梗死模型

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DOI：

10.3791/60783

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2020年8月27日

 ,  ,  ,  , 
1The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过单次电刺激在大鼠模型中建立急性脑桥梗死的实验方案。

摘要

脑桥梗死是后循环中最常见的卒中亚型，但目前尚缺乏模拟脑桥梗死的啮齿类动物模型。本文提供了一种成功建立急性脑桥梗死大鼠模型的实验方案。选用体重约250 g的大鼠，使用立体定位仪将带有绝缘鞘的探针注入脑桥，在单次电刺激下形成病灶。采用Longa评分、Berderson评分和平衡木实验评估神经功能缺损。此外，通过粘附去除躯体感觉实验检测感觉运动功能，通过肢体放置实验评估本体感觉。随后采用磁共振成像（MRI）进行活体梗死评估，并通过TTC染色法进行体外梗死确认。结果显示，成功诱导出位于脑桥前外侧基底部的梗死灶。综上所述，本文描述了一种建立急性脑桥梗死大鼠模型的新方法。

引言

自20世纪80年代以来，由硅胶线栓诱导的中动脉闭塞（MCAO）模型已广泛应用于基础卒中研究1。其他方法（例如结扎大脑中动脉的一个分支2以及光化学诱导的局灶性梗死）也已被使用。这些模型被称为基于大脑中动脉的卒中模型，极大地推动了对卒中病理生理机制及潜在治疗方法的研究。尽管这些实验模型存在一定的局限性3,4，但这些方法已被众多实验室采用5,6。基于大脑中动脉的卒中模型代表了前循环卒中；然而，模拟后循环卒中的模型研究报道较少7。

前循环卒中与后循环卒中在病因、发病机制、临床表现及预后方面存在显著差异8。因此，从前循环卒中模型中获得的研究结果不能直接应用于后循环卒中。例如，前循环的再灌注时间窗已延长至6小时，部分研究根据影像学发现将其扩展至24小时9。然而，根据既往报道10及我们的临床经验，后循环的时间窗可能超过24小时。这一延长的再灌注时间窗需在实验模型中进一步研究并加以证实。

在后循环卒中中，脑桥梗死是最常见的亚型，占所有缺血性卒中病例的7%11,12。根据梗死的解剖分布，脑桥梗死可分为孤立性脑桥梗死和非孤立性脑桥梗死13。根据其发病机制，孤立性脑桥梗死可分为三种类型：大动脉疾病（LAD）、基底动脉分支疾病（BABD）和小动脉疾病（SAD）。目前对脑桥梗死的发病机制、临床表现及预后的认识主要来源于临床病例研究14。然而，模拟脑桥梗死的啮齿类动物模型研究相对较少。

既往研究已探讨过累及脑桥的弥漫性脑干被盖损伤7。有研究团队尝试通过结扎基底动脉（BA）建立脑桥梗死模型15。另一团队则使用10-0尼龙单丝缝线选择性地结扎基底动脉近端的四个位点16。该模型模拟了LAD，但大多数脑桥梗死由BABD和SAD引起。此外，选择性结扎基底动脉手术操作复杂，且死亡率较高。

本文提供了一种通过电刺激建立急性脑桥梗死大鼠模型的详细方案，该方法操作简便、易于重复且成功率高。

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方案

本方案经广州医科大学附属第二医院机构动物护理和使用委员会审查并批准，该机构已获得AAALACi认证。实验大鼠由南方医科大学动物中心提供。

1. 动物

  1. 使用体重为250 ± 10 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。
  2. 运输后，将大鼠在环境温度25 °C、相对湿度65%、12 h/12 h明暗循环的受控环境条件下饲养至少1周，然后进行手术。
  3. 提供食物和水 随意摄取.  

2. 脑桥梗死的建立

  1. 手术前称量大鼠体重，并根据下文所述的行为学测试（第3节）评估其神经功能表现。
  2. 在麻醉开始前立即预热加热垫。
  3. 将颅骨钻安装到立体定位仪支架上的固定装置中。
  4. 腹腔注射给予大鼠50 mg/kg 氯胺酮和5 mg/kg 赛拉嗪。检查足趾夹捏反应是否消失。
  5. 将大鼠以俯卧位固定于立体定位仪上，耳杆置于耳道上方以固定头部。确保颅骨保持水平，以避免注射位置偏移。
  6. 通过带有进气和出气口的立体定位鼻罩装置，使用异氟烷（100%氧气，2.5%异氟烷）维持麻醉。使用加热垫将体温维持在37 °C，并在整个手术过程中持续监测体温。
  7. 使用眼药膏防止角膜干燥。用镊子轻轻夹捏足掌，确认无疼痛反应。
  8. 使用微型剃刀剃除颅骨区域的毛发。 以手术切口为中心，用洗必泰外科消毒液由内向外环形涂抹进行消毒。
  9. 使用手术刀从双侧外眦连线至后囟门后0.5 cm处做一条3 cm长的正中切口，后囟门位置应事先用外科标记笔标出。
  10. 使用棉签清除出血。
  11. 在皮瓣两侧各贴一条手术胶带，以充分暴露颅骨区域（图1）。
  12. 用浸有0.9% NaCl的棉签轻轻去除颅骨表面的结缔组织。若未清除干净，结缔组织可能在钻孔时缠绕钻头。
  13. 确定前囟位置。以前囟中心点为原点，使用细头黑色外科标记笔进行标记。
  14. 将钻头置于前-后方向6.0 mm、内-外方向2.0 mm处（范围0.5–3.0 mm，图2A）。
  15. 使用自动钻进行开颅（直径1 mm）。操作需谨慎，因该位置靠近静脉窦。
  16. 将钻头从立体定位仪上取下。
  17. 将一根带绝缘鞘的22 G探针安装至立体定位仪上（图3A）。探针尖端应位于鞘管近端上方2 mm处（图3A,B；图2B）。
  18. 确保鞘管进入脑组织深度为7 mm（7 mm 背-腹方向，图2B；图1C）。
  19. 沿鞘管推进探针（图1D），直至探针尖端位于脑表面下9 mm处（图2D）。
  20. 将电极连接至电刺激器（图3C）。将阳极按图示连接至探针（图1D），阴极连接至大鼠（通常连接至大鼠耳部）。
  21. 开启电刺激器并设置以下参数：单脉冲宽度 = 4,050 ms；电压 = 50 V；电流 = 4 mA（图3C）。电刺激期间，大鼠会出现颤抖。本研究中，对照组大鼠用于行为学测试、MRI和TTC染色时，该设备不开启。
  22. 刺激结束后保持探针原位5分钟。
  23. 从脑组织中移除探针（图1F）。
  24. 使用骨水泥覆盖开颅孔。在缝合伤口前让水泥充分干燥。
  25. 使用4-0聚酰胺缝合线缝合切口。每缝合三到四针后，打2-1-1标准外科结。
  26. 腹腔注射青霉素（0.25 mL，80 IU溶于4 mL生理盐水）以预防感染。
  27. 皮下注射美洛昔康，剂量为2 mg/kg，之后每24小时重复一次。
  28. 每15分钟监测一次大鼠状态直至完全清醒，并将其放回带有加热垫的笼中。提供自由获取的食物和水直至处死。
    注意：所有操作均应遵循无菌外科原则。手术前，洗手消毒后穿戴刷手服、外科口罩和无菌手套。缝合材料应始终保持在无菌区域内。 

3. 行为学实验

  1. Longa 评分17
    1. 将大鼠放置在桌面表面。
    2. 评分记录如下：0 = 无神经功能缺损；1 = 对侧前肢不能完全伸展，轻度局灶性神经功能缺损；2 = 向左侧转圈，中度局灶性神经功能缺损；3 = 向左侧倾倒，重度局灶性功能缺损；4 = 无自发行走，意识水平下降。
  2. Berderson 评分18
    1. 抓住大鼠尾巴，使其前肢可伸向桌面。评分记录如下：0 = 双侧前肢均触及桌面；1 = 仅一侧前肢触及桌面。
    2. 将动物置于粗糙表面上。评分记录如下：0 = 在粗糙表面抓握有力，推动时有良好抵抗；1 = 仅在一侧前爪观察到轻微抵抗；2 = 向一个方向推动时无抵抗。
    3. 将大鼠放入一个封闭区域（18 英寸 × 36 英寸），允许其自由活动。评分记录如下：0 = 沿围栏全长行走且不转圈；1 = 沿围栏全长行走但伴有转圈；2 = 无法走完全长但可转圈；3 = 几乎无法移动。以每项任务评估得分的总和作为最终评估得分。
  3. 平衡木实验19
    1. 确保装置为一条宽 3 cm、长 70 cm 的横梁，离地面高度 20 cm。在横梁远端放置一个带有狭窄入口的暗箱。
    2. 在横梁起始端放置白噪音发生器和强光源。噪音和强光用于促使大鼠穿越横梁并进入目标箱。
    3. 当动物进入暗箱后终止刺激。记录大鼠到达目标箱的潜伏期（单位：秒）以及穿越横梁时后肢的表现。
    4. 各项表现评分记录如下：0 = 姿势稳定，保持平衡；1 = 抓住横梁侧边；2 = 紧抱横梁且一个肢体滑落；3 = 紧抱横梁且两个肢体滑落，或在横梁上旋转超过 >60 秒；4 = 尝试在横梁上保持平衡，但在超过 >40 秒后滑落；5 = 尝试在横梁上保持平衡，但在超过 >20 秒后滑落；6 = 滑落且在少于 <20 秒内未尝试保持平衡或抓握横梁。
  4. 粘附物移除躯体感觉测试20
    1. 将大鼠放入透明有机玻璃箱中，允许其探索新环境 2 至 3 分钟。
    2. 在每侧前肢拇指上方及腕部内侧表面贴上直径为 10 mm 的绿色粘性标签。
    3. 将大鼠重新放回有机玻璃箱中。
    4. 分别记录大鼠移除第一个标签及所有其他标签所需的时间。最长允许时间为 3 分钟。该测试应在训练阶段进行 2 次。
  5. 肢体放置测试
    1. 将大鼠保持水平姿势并限制其移动。
    2. 当大鼠肢体脱离桌面接触（被动肢体移动）时，用桌面边缘对足爪施加触觉和本体感觉刺激。
    3. 评估足爪是否成功放置到桌面边缘（成功或失败）。
    4. 评分记录如下：0 = 无放置动作；0.5 = 放置未完成和/或延迟放置；1 = 立即且完整地完成放置。

4. 通过 MRI 确认梗死灶

  1. 术后24小时进行MRI扫描。
  2. 使用异氟烷麻醉大鼠（诱导浓度5%，维持浓度1%–1.5%）。
  3. 将大鼠头部固定于大鼠脑阵列线圈中，并与仅发射的容积线圈组合使用。
  4. 将线圈及大鼠放入MRI扫描仪中，使用门齿杆和耳杆将大鼠固定于扫描床内。
  5. 在MRI扫描过程中，使用闭路温控加热外套维持大鼠体温在37 °C ± 0.5 °C。
  6. 使用定位序列确保扫描几何位置正确。
  7. 采用快速自旋回波序列采集T2加权图像：回波时间（TE）= 33 ms；重复时间（TR）= 8,000 ms；视野 = 30 mm × 30 mm；采集矩阵 = 512 × 512；50层；层厚0.4 mm。
  8. 采集四次激发自旋回波平面成像DWI扫描：回波时间 = 30.5 ms；重复时间 = 8000 ms；矩阵 = 96 × 96；视野 = 25 mm × 25 mm；三个方向 = x、y、z；b值 = 0 和 1,000 s/mm2；1,000 s/mm2；50层连续轴位切片；层厚0.4 mm。
  9. 将大鼠放回笼中。

5. 通过TTC染色确认梗死灶

  1. 根据实验设计的时间点处死大鼠。在本实验中，我们在手术后 24 h 处死大鼠。
  2. 在处死前配制 2% 的 TTC 溶液。将 0.2 g TTC 粉末加入 10 mL 0.01 M PBS（pH 7.4）中。将稀释后的溶液转移至一个用锡纸包裹、并在水浴中预热至 37 °C 的 10 cm 培养皿中。 
  3. 将大鼠暴露于 5% 异氟烷直至意识丧失。随后将大鼠暴露于 CO2（每分钟笼体积的 20%–30%）直至呼吸停止，再持续通入 CO2 2 分钟。
  4. 通过以下体征确认死亡：无胸廓起伏、无法触及心跳、黏膜颜色苍白、脚趾夹捏无反应、眼球颜色改变或浑浊。
  5. 实施颈椎脱位。
  6. 将动物四肢用胶带固定于无菌操作台上。从锁骨至耻骨联合做正中切口，从剑突沿肋缘向左做侧向切口。沿肋缘切开膈肌，并做胸骨正中切口以暴露心脏。
  7. 将针头（27 G）尖端连接至含有 4 °C 的 0.01 M PBS 的灌注泵，并插入左心室。
    注意：将针尖沿心室左侧边缘推进，以避免进入心房。启动灌注泵以确认针尖位于左心室，随后剪开右心房。若液体从鼻孔流出，则表明针尖位于心房，需调整或重新插入。
  8. 使用约 100 mL 保持在 4 °C 的 0.01 M PBS 进行灌注。关闭灌注泵，直至肝脏变为白色。
  9. 将大鼠断头，使用剪刀和镊子取出完整脑组织。用吸水纸吸去脑表面的水分。
  10. 将完整脑组织置于 -80 °C 冰箱中保存 1 分钟（冷冻后更易于切片）。
    注意：若脑组织无需冷冻即可良好切片，此步骤可省略。
  11. 将脑组织背侧朝上放入切片模具中。
  12. 参照图 1G所示，在脑表面确定穿刺孔位置，并插入厚度为 0.21 mm 的不锈钢刀片。通常梗死面积最大的区域位于探针平面，因此应在该区域插入一片刀片。
  13. 以 2 mm 间隔插入其余刀片。
  14. 同时一次性将所有刀片从模具中取出，并将带有刀片的完整脑组织放入培养皿中的 TTC 溶液中。小心移除刀片。
    注意：由于颅底存在部分残留的软脑膜，脑切片可能不易从液体中取出。若仍有切片滞留在模具中，可用小刮铲将其转移至培养皿中。
  15. 将含有 TTC 溶液和脑切片的培养皿置于 37 °C 水浴中。
  16. 每 5 分钟检查一次培养皿，确保切片无重叠。
  17. 向培养皿中加入 10 mL 4% 多聚甲醛溶液以终止 TTC 反应。
  18. 将切片按头端至尾端方向排列并拍照。

6. 统计学

  1. 使用统计分析软件（例如 GraphPad Prism）进行学生 t 检验。
    注：所有数据均表示为均值 ± 标准误。组间差异通过双尾学生 t 检验确定（p < 0.05 定义为具有统计学显著性）。

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结果

六只动物接受了上述手术方案。对照组如图所示。 图 4 由六只大鼠组成。所示的脑切片 图4 每组数据均来自一只大鼠。

MRI 扫描显示，梗死位于脑桥基底部（图 4A）。由于探针注射位置位于中线左侧 2 mm，因此梗死位于外侧。该梗死模型模拟了患者中的脑桥腹外侧梗死（图 4A）。由于使用了绝缘套管，探针尖端以外的区域（包括大脑皮层、小脑和中脑）均未出现梗死（图 4A）。弥散加权成像（DWI）也显示了急性脑桥梗死（图 4A）。

采用TTC染色法在术后24小时确认梗死情况（图4A）。与对照组相比，梗死体积显著增加（

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讨论

本研究提供了一种建立急性脑桥梗死大鼠模型的实验方案。该模型可用于脑桥卒中患者预后及康复（包括卒中后慢性疼痛）的相关研究。

该方法具有多个优势。首先，它为未来的研究提供了一种急性脑桥梗死的大鼠模型。如上所述，脑桥梗死是一种常见的卒中亚型，但目前受到的关注较少。卒中研究的一个主要不足之处在于缺乏特异性的脑桥梗死模型。其次，与通过结扎基底动脉（BA15,16）建立的现有脑桥梗死大鼠模型相比，本模型可根据实验设计调整梗死的位置和体积。例如，可通过改变导管尖端的长度，使梗死范围从脑桥表面开始延伸，正如本研究中所实施的那样。

或者，可通过缩短探针尖端的长度在脑桥建立腔隙性梗死（补充图1）。根据解剖定位设计，也可在脑桥的不同部位（例如，前内侧脑桥梗死）以及脑桥的不同平面（例如，上、中、下平面）建立梗死。在本模型中，选择了脑桥上部平面。第三，该模型易于建立且成功率高。由于可能存在侧支循环，结扎...

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致谢

本研究由国家自然科学基金（81471181 和 81870933）资助于 Y. Jiang，国家自然科学基金（编号 81601011）、江苏省自然科学基金（编号 BK20160345）资助于 J. Zhu，以及广州市卫生健康委员会科研项目（20191A011083）资助于 Z. Qiu。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-0 缝线Shanghai Jinzhong外科器械
医用胶带Shanghai Jinzhong外科器械
动物麻醉系统RWD使用系统时需佩戴口罩
骨水泥Shanghai Jinzhong外科器械
固定夹Shanghai Jinzhong外科器械
普通组织剪Shanghai Jinzhong外科器械
碘伏国药集团消毒
异氟烷RWD217181101
病灶制作装置上海玉研用于制作病灶
MRI 系统Bruker Biospin活体梗死确认
持针器Shanghai Jinzhong外科器械
青霉素国药集团感染预防
探针Anke需进行一些改装
棉签Shanghai Jinzhong外科器械
剪刀Shanghai Jinzhong外科器械
立体定位仪RWD
缝合针Shanghai Jinzhong外科器械
组织固定镊Shanghai Jinzhong外科器械
TTCSigma-AldrichBCBW5177用于体外梗死确认

参考文献

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MRI TTC

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