使用荧光显微镜在剪切流下描述单分子构象变化

Summary

我们提出了一种在微流体器件中固定单个大分子和量化其在剪切流下其一致性变化的协议。该协议可用于描述流动环境中蛋白质和DNA等生物分子的生物力学和功能特性。

Abstract

机械扰动下的单分子行为被广泛描述为了解许多生物过程。然而，原子力显微镜等方法的时间分辨率有限，而Fürster共振能量转移（FRET）仅允许推断一致性。另一方面，荧光显微镜允许在各种流动条件下对单个分子进行实时原位可视化。我们的协议描述了使用荧光显微镜捕获不同剪切流环境中单生物分子的构象变化的步骤。剪切流在微流体通道内产生，由注射器泵控制。作为该方法的演示，冯·威尔布兰德因子（VWF）和lambda DNA被标记为生物素和荧光素，然后固定在通道表面。使用总内部反射 （TIRF） 和共聚焦荧光显微镜在可变剪切流下持续监测其一致性。VWF的可逆分解动力学有助于理解其功能在人类血液中的调节，而 lambda DNA 的构象提供了对大分子生物物理学的见解。该方案还可用于研究聚合物，特别是生物聚合物在不同流动条件下的行为，以及研究复杂流体的流变学。

Introduction

生物分子对环境刺激的反应机制得到了广泛的研究。特别是在流动环境中，剪切力和伸长力调节构象变化，并可能调节生物分子的功能。典型的例子包括剪切引起的羊羔DNA和冯·威勒布兰德因子（VWF）的分解。Lambda DNA已被用作一种工具，了解个体、柔性聚合物链的构象动力学和聚合物溶液^{1、2、3、4}的流变学。VWF 是一种自然流动传感器，可聚合血管伤口部位的血小板，剪切速率和流动模式异常。VWF 的分解对于激活血小板与 A1 域的结合和胶原蛋白与 A3 域结合至关重要。此外，高剪切诱导A2域展开允许VWF的裂解，调节其分子量分布在循环^5，6。因此，直接可视化这些分子在流动下如何运行，可以大大增强我们对它们的生物力学和功能的基本理解，进而支持新的诊断和治疗应用。

描述单分子一致性的典型方法包括光学/磁性钳子、原子力显微镜（AFM）和单分子Fürster共振能量转移^{（FRET）7。}单分子力谱谱是研究与生物分子的构象变化相关的力和运动的有力工具。然而，它缺乏绘制整体分子一致性⁸的能力。AFM能够成像高空间分辨率，但时间分辨率^9，10是有限的。此外，尖端和样品之间的接触可能会混淆由流量引起的响应。其他方法，如FRET和纳米孔分析，根据分子内距离和排除体积的检测，确定单分子蛋白折叠和展开状态。然而，这些方法还处于起步阶段，在直接观察单分子一致性^{11、12、13、14}方面还很有限。

另一方面，在荧光显微镜下直接观察具有高时空分辨率的大分子，提高了我们对许多生物过程中单分子动力学的理解^15，16。例如，Fu等人最近首次实现了VWF伸长和血小板受体结合的同步可视化。在其工作中，VWF分子通过生物素-链球素相互作用固定在微流体通道表面，并在不同剪切流环境中在总内部反射荧光（TIRF）显微镜下成像^17。应用与Fu类似的方法，我们在这里证明，VWF和lambdaDNA的一致性可以在TIRF和共聚焦荧光显微镜下直接观察到。如图1所示，微流体装置用于创建和控制剪切流，生物分子固定在通道表面。应用不同的剪切速率后，记录同一分子的一致性以测量延伸长度，如图1所示。该方法可广泛应用于复杂流动环境下研究其他聚合物行为，用于流变学和生物学研究。

Protocol

1. 准备 VWF

1. 重组人类血浆VWF，为标记反应做好准备。将 100 μ0 μL 的去离子 （DI） 水加入 100 μg 的冻干 VWF，以创建 1 mg/mL VWF 库存溶液。
2. 透析VWF库存溶液，以去除多余的甘氨酸，从而提高生物锡和荧光剂标签效率。
   1. 将 50 μL 的 VWF 库存溶液转移到 0.1 mL 透析单元中，该透析单元具有 10，000 个分子量的截止和带盖的密封。将剩余库存溶液储存在-20°C。VWF 库存将在 -20 °C 下稳定长达 1 年。
   2. 在 500 mL 的 1x 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （0.01 M 磷酸二钠， 0.0018 磷酸钠， 0.0027 M 氯化钾， 0.137 M 氯化钠， pH 7.4 在 25 °C） 中运行透析 1 小时，在 4 °C 下缓慢搅拌。使用 500 mL 的新鲜 PBS 重复透析一小时。
3. 开始生物锡标记反应。在反应前先溶解DI水中的固体，制备2mM的NHS-PEG_4-生物锡溶液。允许NHS-PEG_4-生物锡在水中长时间停留将导致NHS-酯组水解，从而降低标签效率。
   1. 在含有 VWF 库存溶液的透析单元中加入 2 mM NHS-PEG₄-生物锡的 2.5 μL。与VWF单体相比，这将导致生物锡的20倍过量。VWF的主要胺将与NHS-酯组发生反应，从而通过酰胺连接与PEG_4-生物锡组共价结合。
   2. 将透析装置放入 1.5 mL 微离心管中。用相应的盖子密封透析单元。用帕拉胶片固定管透析组件。保持直立，在室温下离开40分钟。
4. 开始荧光量标记反应。通过溶解 DI 水中的荧光固结，制备 Alexa 488 四氟基酯 （TFP-ester） 荧光染料（激励_最大值= 498 nm，最大排放_最大= 519 nm）的 2.8 mM 溶液。在反应前立即执行此操作，以防止TFP-酯组水解。
   1. 将2.8 mM 488荧光的2.9 μL添加到透析单元。与 VWF 单体相比，这将导致 34 倍的摩尔过量的荧光。VWF剩余的原发性胺将与TFP-酯组发生反应，从而通过酰胺连接与荧光团共价结合。
   2. 将2.0 μL的1M碳酸氢钠（溶解在DI水中）加入透析单元。这将反应的pH量调整到接近8.0，从而提高TFP酯和原胺反应的效率。
   3. 如同步骤 1.3.2 中一样，将透析单元固定在微离心管中。存放在黑暗中，以防止光漂白，并在室温下离开1小时30分钟。
5. 将透析单元置于 900 mL 的 1x 无菌 PBS 中，并在 4°C 下进行通宵透析。这将产生约70 μL的标记VWF浓度为0.71毫克/mL或2.84μM（单体浓度）。
6. 将标记的 VWF 转移到微离心管中。用铝箔盖住管子，防止光线照射。储存在4°C。对于长期储存，将抗微生物剂阿齐德钠加入到0.02%的最终浓度（w/v）。
   注: 可以在此处暂停该协议。

2. 制备兰姆达DNA

1. 生物素线性lambda DNA通过填充其内聚端点（cos位点）与生物素-14-dCTP核苷酸根据标准协议，重复在这里的步骤2.1^18。用dATP、dTTP和dGTP核苷酸填充余量点。
   1. 在10x反应缓冲液（500 mM氯化钠、100 mM盐酸三重物、100 mM氯化镁、10 mM二硫磷醇、pH 7.9在25°C时）中制备1 mM溶液的dATP、dTTP、dGTP和生物素-14-dCTP溶液。
   2. 将 48 μL 的 500 纳克/μL lambda DNA 放入 PCR 管中，并在 65°C 下加热 5 分钟。圆形lambda DNA的cos位点在高温下分离，使分子线性化，使单链悬伸为生物素化做好准备。紧接着，放在冰上，以防止场地重新退火。
   3. 在 lambda DNA 中加入 5 μL 的 1 mM dATP、dTTP 和 dGTP 和 4 μL 的 1 mM 生物素-14-dCTP。也加入2.5 μL的5U/μL Klenow片段（3'+5'外兆-）催化DNA合成。
   4. 在37°C下孵育反应混合物1小时。
   5. 添加 1.2 μL 的 0.5 M EDTA。然后在70°C下加热反应混合物5分钟。这将停用克莱诺碎片和生物异化反应。
2. 使用可容纳10-70 μL且分子量截止的旋转柱，从lambda DNA中去除多余的核苷酸。
   1. 将柱子放在 2 mL 微离心管内。将柱和管在1000 x g下离心2分钟。处理在管中收集的流过。
   2. 使用步骤 2.1.1 中相同反应缓冲液的 1x 溶液替换柱缓冲器。为此，向列添加 500 μL 的 1x 缓冲区。在1000 x g下离心1分钟。处理流通过。重复这些 2 次，以便总共向列添加 1500 μL。
   3. 将柱子放入 1.5 mL 微离心管中。小心地将解决方案从步骤 2.1.5 添加到列的顶层。在1000 x g下离心4分钟。
   4. 从微离心管中收集流通（40-70 μL），并放入PCR管中。这含有纯化的，生物素化的lambdaDNA。
3. 标签 lambda DNA 与荧光 YOYO-1 染料 （激发_最大= 490 nm， 发射_最大= 509 nm） 根据标准协议， 重复在这里的步骤 2.3.1²⁰.
   1. 制备YOYO-1染料和lambdaDNA溶液，用染料对碱基对摩尔比为1:10。假设在纯化步骤中没有丢失DNA，以计算lambda DNA的碱基对浓度。全长羔羊DNA有48，502个碱基对。
      注:例如，如果从步骤2.2.4中回收50μL溶液，则添加7.4 μL的500μM YOYO-1染料。
   2. 在黑暗中在50°C下加热溶液2小时，以完成反应。
   3. 用铝箔盖住管子，防止光线照射。储存在4°C。该解决方案现已准备好注入微流体设备。
      注: 可以在此处暂停该协议。

3. 在硅晶片中创建微流体通道模具

1. 使用光刻法在主硅片上根据标准协议¹⁹创建具有适当尺寸的微流体通道（图2）。

4. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流体装置的制备

1. 在称重船中将 5 部分硅胶弹性体底座添加到 1 部分固化剂（按质量） 中。彻底搅拌内容物 1 分钟，以创建预固化的 PDMS 溶液。
2. 将主硅片放入塑料培养皿中。将 PDMS 溶液倒在晶圆上，形成 5 mm 层。盖上盘子，在真空下放在干燥器中 1 小时，以去除气泡。
3. 在60°C过夜孵育覆盖培养皿，将PDMS固化成柔性固体。固化将导致在 PDMS 晶圆接口将微流体通道模制到 PDMS 中。
4. 使用剃须刀将 20 x 10 mm 矩形切割到 PDMS 中，围绕每个微流体通道。拆下带钳子的矩形 PDMS 块。
5. 使用具有锐化边的 25 G 钝端针在通道的一端打孔直径为 0.5 mm，确保孔完全穿过 PDMS 块（图 2）。使用细针从孔中打孔 PDMS。在通道的另一端重复此操作。这将创建一个入口和出口，用于流经通道。
6. 使用乙烯基洁净室胶带清洁 PDMS 块的表面。将压缩氮气吹过 1 号 1/2、22 x 50 mm 盖玻片，以清除碎屑。
7. 将通道侧向上的 PDMS 块和盖玻片放入等离子粘接机的腔室中。开始治疗。
8. 处理完成后，快速将 PDMS 块放在盖玻上，以便通道与滑道接触。沿块的边缘施加压力。将盖玻片-PDMS 组件置于 115°C 的热板上 15 分钟，以增强永久粘结。
9. 将 10 厘米长、0.25 mm 内径的管子插入 PDMS 块顶部的出口孔中。这使得流体能够轻松地流出通道。设备现已完成。

5. 微流体装置表面处理

1. 将溶解在无菌1x PBS中的1xPBS中的10μg/mL生物素牛血清白蛋白（BSA-生物素）注射到用于VWF实验的微流体装置入口。注射<10 μL 1mg/mL BSA-生物素用于lambda DNA实验。注射后，在移液器尖端中保留几微升的BSA-生物锡，让吸头保持嵌入进气。
   1. 始终在尖端周围保留一滴 DI 水。这将防止气泡进入通道。每次将新溶液注入通道时，应用此技术。
   2. 让BSA生物锡在设备中孵育2小时。BSA 将非具体绑定到盖玻片表面 （图 3A）。
2. 拆下移液器尖端。将<10 μL的色壳物阻断溶液注入通道，使其孵育30分钟。箱体将阻断任何自由位点，减少生物分子与表面的非特异性结合（图3B）。
3. 取出尖端，将溶解在无菌1x PBS中的10微克/mL链球菌素的<10 μL注射到通道中，用于VWF实验。使用100μg/mL链球菌素进行lambda DNA实验。孵育10分钟。链球菌与BSA生物素的生物素组结合（图3C）。
4. 取出尖端，将1x洗涤剂溶液（PBS中0.05%补间20）的<10 μL注射到通道中，以洗去多余的链球菌素。
5. 取出尖端，从步骤2.3.3中取出28.4 nM VWF稀释的尖端<10 μL，以案例素溶液或lambda DNA稀释。孵育VWF3分钟.孵化羔羊DNA45分钟（图3D）。
6. 取出尖端，注入5 mM免费生物锡的<10 μL，在案例中溶液中稀释。免费生物锡将阻断通道表面上多余的链球菌结合位点（图3E）。

6. 在荧光显微镜下可视化 VWF 和 Lambda DNA

1. 用2.2 mM原酸和37 nM原酸-3，4-二氧酶制备1 mL的蛋白阻断溶液（以尽量减少光漂白）。装入注射器并固定在注射器泵中。取长 30 厘米、内径 0.25 mm 的管，并将一端连接到注射器针上。流在溶液中，以去除气泡。将管的另一端连接到微流体装置的入口。建议在步骤 5.6 后 3 分钟执行此操作。
2. 选择总内部反射 （TIRF） 或共聚焦荧光显微镜的最高放大倍率物镜（即 60-100X）。如果需要，在目标上加入一滴浸入油。将微流体装置放在显微镜台上，使盖玻片与目标齐平。
3. 开始明场显微镜。调整对焦，使任何特征（如碎屑和气泡）都可见。然后调整 X 和 Y 方向的阶段，直到微流体通道的边缘可见并一分为二。
4. 切换到 488 通道 （FITC）。根据需要调整 Z 级和 TIRF 角度，直到可以区分单个绿色球状分子。这些是VWF或lambdaDNA分子。
5. 调整曝光时间和激光强度，以可视化荧光分子，而不会太快地对其进行光漂白。调整对比度，使分子更清晰地可视化。
6. 从注射器泵开始流动，以便套位物阻断溶液流入通道并流出出口。在步骤 5.6 之后 5 分钟执行此操作。停止和启动流动，以观察分子构象的变化。应用流量时，使用速率在 5，000 到 30，000 μL/h 之间。继续这个过程，找到分子，可以延长和放松的多个周期的停止和启动流动。
7. 注意分子需要多长时间才能达到最大延伸，并完全放松到球状。录制剪切流下分子的连续行为视频，选择最佳曝光时间、曝光频率和视频持续时间，以捕获所有扩展行为，并最大限度地减少光漂白。
8. 将视频另存为 。带有刻度栏的 AVI 文件。
   注: 可以在此处暂停该协议。

7. 构象变化的图像分析

1. 使用矩形微流体通道的流速 （q） 和高度 （h） 和宽度 （w） 计算应用于大分子的壁剪切速率 （ ） .使用以下公式执行此操作:
   
2. 使用自定义的 MATLAB 代码确定各种剪切速率下任何生物分子的长度（请参阅补充文件）。创建一个名为视频分析的文件夹，其中包含以下 MATLAB代码:main.m、save_each_frame.m、get_length.m和get_length。 在视频分析中创建一个子文件夹，并添加 。要分析到它的 AVI 文件。
3. 使用 MATLAB 2019a 打开main.m并运行代码。在命令窗口中键入要分析的视频文件的名称请在"请输入数据文件"进行分析:。
4. 在打开的图形用户界面 （GUI） 中，将阈值（窗口右上角的框中的文本）设置为20，然后单击"设置阈值"按钮进行确认。
5. 使用窗口顶部工具栏中的数据光标在比例尺的任意位置选择一个像素。单击窗口右侧"比例尺"部分中的"开始点"。所选像素的 （x，y） 位置将显示在按钮的右侧。单击像素大小 （μm）按钮。像素大小只需在每个视频中测量一次。
6. 选择感兴趣分子上的任何像素。单击VWF部分中的起始点。在右侧的文本框中显示所选像素的位置后，单击左端、右端和字符串长度以获取图像中的分子长度。
   注:此步骤可用于分析任何生物分子的构象变化，尽管该代码具有名为VWF的特定部分。
7. 仔细检查分子的左端和右端。放大并使用数据光标检查感兴趣的像素位置。手动选择像素作为结束，并在必要时重新计算长度（以像素为单位）。
8. 将像素大小（以 μm 为单位）和字符串长度（以像素数为单位）记录到 Excel 工作表中，并计算以 μm 为单位的字符串长度。
9. 对每张图片重复上述步骤。使用 GUI 右下角的"最后"下一个"按钮，在同一视频文件中的图像之间切换。单击"关闭"以关闭 GUI 窗口。

Results

观察生物分子（如 VWF 和 lambda DNA）的动态行为高度依赖于优化其与设备表面的结合。在微流体装置中进行推荐时间的表面处理对于获得几个锚固点的结合至关重要，以便分子在变化流量时可以自由延伸和放松。如果蛋白质或DNA与多重联系结合过强，它们要么延伸至有限长度，要么根本不延伸。在免费生物锡阻断之前，VWF 在设备表面保持无流量超过 3 分钟时，尤其会出现这种情况。VWF在表面停滞的时间越长，VWF生物锡组与表面链球菌群结合的越多，分子的分解灵活性也就越小。如果分子被束缚得太弱，另一方面，它们就会在流动时分离，从视野中消失。如果 VWF 或 lambda DNA 孵育时间太短，导致生物素-链球菌相互作用形成太少，则可能发生此情况。当应用极高的剪切率（>200，000^s-1）时，分子也可以自由释放，从而削弱生物锡-链球菌的相互作用。

理想的分子结合到这样的程度，它可以解开和放松的多个周期的停止和启动流动。当剪切速率在增加的流量范围内施加时，分子改变这样的构象的灵活性通常表现为它能够延伸到增加的长度。使用TIRF显微镜获得的VWF图像在视...

Discussion

为了使用该方法中所述的荧光显微镜获得单分子构象变化的高质量数据，在适当的时间内孵育分子，尽量减少其与表面的非特异性相互作用至关重要并建立显微镜设置，以减少光漂白。分子自由改变构象的能力与分子与表面之间形成的生物链球菌相互作用的数量有关。如前所述，这必须通过在适当的时间内孵育无流量的分子来控制。此外，如果盖玻片没有有效堵塞，蛋白质或DNA可能非特有结合到盖玻片上。如果没有推荐的阻滞溶液，分子可以非具体地附着在玻璃上，并且对施加的任何流速无响应。在早期表面处理期间应用套内块并在流动过程中保持其存在对于减少这些非特异性相互作用至关重要。最后，捕获单个分子的连续动态行为需要在图像捕获过程中频繁兴奋荧光。如果激光强度、曝光时间和曝光频率过高，则可能导致快速光漂白。因此，有必要同时调整这些设置，并制定如何降低其值的策略，同时不影响数据的时间或图像分辨率。

如果不观察到分子的延伸和松弛，应遵循其他步骤。在设备中孵育分子的时间比协议中建议的时间长和短。每次测试时，根据 10 的因子改变 BSA 生物锡和链球菌的浓度。这些测试可能是必要的，以优化分子和表面之间形成的生物链球酸锚固点的数量。例如，如果...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 标记试剂盒	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 凝胶柱	Bio-Rad	7326221
生物素	Sigma-Aldrich	B4501	在步骤 5.6 中用作游离生物素
素-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-生物素	Sigma-Aldrich	A8549
盖玻片	VWR	48393-195	No. 1 ½， 22 x 50 mm
dNTP 套装	Invitrogen	10297018
用于小型透析装置的浮标	Thermo Scientific	69588
Klenow 片段 （3'→5' exo-）	New England BioLabs	M0212S	在步骤 2.1.1 中使用 10X 反应缓冲液，在步骤 2.2.2 中使用 1X 反应缓冲液
lambda DNA	New England BioLabs	N3011S
小型透析仪	Thermo Scientific	69570	10K MWCO，0.1 mL 体积
NEBuffer 4	New England BioLabs	B7004S
NHS-PEG4-生物素	Thermo Scientific	21330
原儿茶酸 3,4-双加氧酶	Sigma-Aldrich	P8279
原儿茶酸	Santa Cruz Biotechnology	sc-205818
用于 PDMS 制造的有机硅弹性体套件	陶氏化学公司	4019862
链霉亲和素	Sigma-Aldrich	85878
封闭溶液	CANDOR Bioscience	110 050	在整个方案中用作酪蛋白封闭溶液
乙烯基洁净室胶带	Fisher Scientific	19-120-3217
von Willebrand 因子，人血浆	Millipore Sigma	681300
YOYO-1 染料	AAT Bioquest	17580
0.25 mm 内径管	Cole-Parmer	EW-06419-00
25 号针头	Thomas Scientific	JG2505X