利用荧光显微镜表征剪切流中单分子构象变化

摘要

我们介绍一种在微流控装置中固定单个大分子并量化其在剪切流中构象变化的实验方案。该方案可用于表征蛋白质和DNA等生物分子在流动环境中的生物力学特性与功能特性。

摘要

单个分子在机械扰动下的行为已被广泛表征，以理解多种生物学过程。然而，原子力显微镜等方法的时间分辨率有限，而荧光共振能量转移（FRET）仅能推断分子构象。相比之下，荧光显微镜能够在不同流动条件下对单个分子进行实时原位可视化观察。本实验方案描述了利用荧光显微镜捕捉单个生物大分子在不同剪切流环境中的构象变化的具体步骤。剪切流由微流控通道内通过注射泵控制产生。作为该方法的应用示例，血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）和λ DNA 被分别标记上生物素和荧光染料，并固定在通道表面。通过全内反射（TIRF）和共聚焦荧光显微镜，在可变剪切流条件下持续监测其构象变化。VWF 可逆的展开动力学有助于理解其在人体血液中功能调控的机制，而λ DNA 的构象变化则为大分子的生物物理学特性提供了重要信息。该方案还可广泛应用于研究聚合物（尤其是生物聚合物）在不同流动条件下的行为，以及复杂流体的流变学特性。

引言

生物分子如何响应环境刺激的机制已被广泛研究。特别是在流动环境中，剪切力和拉伸力可调控生物分子的构象变化，并可能影响其功能。典型的例子包括剪切力诱导的λ DNA解缠和血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）的展开。λ DNA已被用作研究单个柔性聚合物链的构象动力学以及聚合物溶液流变学的工具^1,2,3,4。VWF是一种天然的流动传感器，在血流剪切速率和流动模式异常的血管损伤部位促进血小板聚集。VWF的展开对于激活血小板与A1结构域的结合以及胶原与A3结构域的结合至关重要。此外，高剪切力诱导A2结构域的展开，使VWF被剪切，从而调节其在循环中的分子量分布^5,6。因此，直接观察这些分子在流动条件下的行为，将极大促进我们对其生物力学和功能的基本理解，并进一步推动新型诊断和治疗技术的发展。

表征单分子构象的典型方法包括光镊/磁镊、原子力显微镜（AFM）以及单分子荧光共振能量转移（FRET）⁷。单分子力谱技术是研究生物分子构象变化过程中相关作用力与运动的有力工具。然而，该方法无法全面描绘分子的整体构象⁸。原子力显微镜能够以高空间分辨率成像，但在时间分辨率方面存在局限^9,10。此外，探针尖端与样品之间的接触可能干扰流场诱导的响应。其他方法如FRET和纳米孔分析技术，则基于分子内距离和排阻体积的检测来判断单个蛋白质分子的折叠与去折叠状态。然而，这些方法仍处于发展初期，对单分子构象的直接观测能力仍然有限^11,12,13,14。

另一方面，在荧光显微镜下以高时间和空间分辨率直接观察大分子，已显著加深了我们对多种生物过程中单分子动态行为的理解^15,16。例如，Fu 等人最近首次实现了 VWF 伸长与血小板受体结合的同步可视化。在该研究中，VWF 分子通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在微流控通道表面，并在不同剪切流动环境下利用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行成像¹⁷。我们采用与 Fu 相似的方法，展示了在 TIRF 和共聚焦荧光显微镜下均可直接观察 VWF 和 λ DNA 的构象。如图1所示，利用微流控装置产生并控制剪切流，生物大分子被固定在通道表面。施加不同剪切速率后，记录同一分子的构象变化以测量其伸展长度，结果如图1所示。该方法可广泛应用于复杂流动环境中其他聚合物行为的研究，适用于流变学和生物学领域的多种研究。

方案

1. 准备血管性血友病因子（VWF）

1. 重悬人血浆血管性血友病因子（VWF），以准备标记反应。向100 µg冻干VWF中加入100 µL去离子水（DI），配制成1 mg/mL的VWF储备液。
2. 对VWF储备液进行透析，以去除过量的甘氨酸，从而提高生物素和荧光染料的标记效率。
   1. 将50 µL VWF储备液转移至一个截留分子量为10,000的0.1 mL透析装置中，并用盖子密封。将剩余的储备液储存于-20 °C。VWF储备液在-20 °C下可稳定保存长达1年。
   2. 在4 °C下，使用500 mL 1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M磷酸氢二钠、0.0018 M磷酸二氢钾、0.0027 M氯化钾、0.137 M氯化钠，pH 7.4，25 °C）缓慢搅拌透析1小时。再用500 mL新鲜PBS重复透析1小时。
3. 开始生物素标记反应。在反应前立即用去离子水溶解固体试剂，配制2 mM的NHS-PEG₄-生物素溶液。NHS-PEG₄-生物素在水中长时间放置会导致NHS酯基团水解，从而降低标记效率。
   1. 向含有VWF储备液的透析装置中加入2.5 µL 2 mM NHS-PEG₄-生物素。这将使生物素相对于VWF单体形成20倍的摩尔过量。VWF的伯胺基团将与NHS酯基团反应，通过酰胺键共价结合PEG₄-生物素基团。
   2. 将透析装置放入1.5 mL微量离心管中，并用配套盖子密封透析装置。用Parafilm封口固定管-透析装置组件。保持直立，室温孵育40分钟。
4. 开始荧光染料标记反应。在反应前立即用去离子水溶解荧光染料固体，配制2.8 mM的Alexa 488四氟苯基酯（TFP-酯）荧光染料溶液（激发波长_max = 498 nm，发射波长_max = 519 nm），以防止TFP-酯基团水解。
   1. 向透析装置中加入2.9 µL 2.8 mM的488荧光染料。这将使荧光染料相对于VWF单体形成34倍的摩尔过量。VWF中剩余的伯胺基团将与TFP-酯基团反应，通过酰胺键共价结合荧光染料。
   2. 向透析装置中加入2.0 µL 1 M碳酸氢钠（溶于去离子水中）。这将使反应体系pH接近8.0，从而提高TFP-酯与伯胺反应的效率。
   3. 将透析装置固定于微量离心管中，操作方式同步骤1.3.2。避光保存，室温孵育1小时30分钟。
5. 将透析装置置于900 mL 1×无菌PBS中，在4 °C下透析过夜。最终可获得约70 µL标记后的VWF，浓度约为0.71 mg/mL或2.84 µM（以单体浓度计）。
6. 将标记后的VWF转移至微量离心管中。用铝箔包裹管子，避光保护。储存于4 °C。如需长期保存，可加入终浓度为0.02%（w/v）的抗菌剂叠氮化钠。
   注：本实验方案可在此处暂停。

2. 准备λ DNA

1. 根据标准方案，通过用生物素-14-dCTP核苷酸填充λDNA的黏性末端位点（cos位点）对其进行生物素标记，此处步骤2.1¹⁸中重复该操作。使用dATP、dTTP和dGTP核苷酸填充其余的cos位点。
   1. 在10倍反应缓冲液（500 mM氯化钠，100 mM盐酸-Tris，100 mM氯化镁，10 mM二硫苏糖醇，pH 7.9，25 °C）中配制1 mM的dATP、dTTP、dGTP和生物素-14-dCTP溶液。
   2. 取48 µL浓度为500 ng/µL的λDNA置于PCR管中，在65 °C加热5分钟。环状λDNA的cos位点在加热下会分离，使分子线性化并暴露出单链突出端，以便进行生物素标记。加热后立即置于冰上，防止cos位点重新退火。
   3. 向λDNA中加入5 µL 1 mM dATP、dTTP和dGTP，以及4 µL 1 mM生物素-14-dCTP。同时加入2.5 µL 5 U/µL的Klenow片段（3'→5'外切酶缺陷型），以催化DNA合成。
   4. 将反应混合物在37 °C孵育1小时。
   5. 加入1.2 µL 0.5 M EDTA，然后将反应混合物在70 °C加热5分钟，以使Klenow片段失活并终止生物素标记反应。
2. 使用可容纳10–70 µL且截留分子量为6,000的离心柱去除λDNA中过量的核苷酸。
   1. 将离心柱放入2 mL微量离心管中，在1000 × g条件下离心2分钟，弃去收集在管中的穿滤液。
   2. 用步骤2.1.1中的相同反应缓冲液的1倍溶液替换柱内缓冲液：向柱中加入500 µL 1倍缓冲液，在1000 × g条件下离心1分钟，弃去穿滤液。重复此步骤两次，共向柱中加入1500 µL缓冲液。
   3. 将离心柱转移至1.5 mL微量离心管中。小心将步骤2.1.5所得溶液加至柱的上层，在1000 × g条件下离心4分钟。
   4. 收集微量离心管中的穿滤液（40–70 µL），转移至PCR管中。此溶液即为纯化后的生物素化λDNA。
3. 根据标准方案，用荧光染料YOYO-1对λDNA进行标记（激发_max = 490 nm，发射_max = 509 nm），此处步骤2.3.1²⁰中重复该操作。
   1. 配制YOYO-1染料与λDNA的溶液，使染料与碱基对的摩尔比为1:10。计算λDNA碱基对浓度时，假设纯化步骤中无DNA损失。全长λDNA含有48,502个碱基对。
      注：例如，若从步骤2.2.4中回收了50 µL溶液，则加入7.4 µL 500 µM YOYO-1染料。
   2. 将溶液在黑暗条件下50 °C加热2小时，以完成标记反应。
   3. 用铝箔包裹试管，避光保存，置于4 °C。该溶液现已可用于注入微流控装置。
      注：本方案可在此处暂停。

3. 在硅片上制备微流控通道模具

1. 根据标准方案，采用光刻技术在母版硅晶圆上制作具有适当尺寸的微流控通道（图2）¹⁹。

4. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置的制备

1. 在称量皿中加入5份硅弹性体基础剂与1份固化剂（按质量比）。充分搅拌1分钟，制成预固化PDMS溶液。
2. 将硅母版芯片放入塑料培养皿中。将PDMS溶液倒在芯片上，形成5 mm厚的层。盖上培养皿，并置于真空干燥器中抽真空1小时，以去除气泡。
3. 将盖好的培养皿在60 °C下孵育过夜，使PDMS固化为柔性固体。固化后，PDMS与芯片界面处将形成微流控通道的模塑结构。
4. 使用刀片在PDMS上切割出围绕每个微流控通道的20 × 10 mm矩形。用镊子移除矩形PDMS块。
5. 使用边缘已磨锐的25 G钝头针在通道一端打一个直径为0.5 mm的孔，确保孔完全贯穿PDMS块（图2）。用细针将孔中的PDMS碎屑顶出。在通道另一端重复此操作。这将形成通道流体的入口和出口。
6. 用乙烯基洁净室胶带清洁PDMS块表面。用压缩氮气吹扫22 × 50 mm的No. 1 ½盖玻片，以去除表面碎屑。
7. 将PDMS块（通道面朝上）和盖玻片放入等离子体键合仪的腔室内。启动处理程序。
8. 处理完成后，迅速将PDMS块放置在盖玻片上，使通道面与盖玻片接触。沿PDMS块边缘施加压力。将盖玻片-PDMS组件置于115 °C的加热板上加热15分钟，以增强永久性键合。
9. 将一段长10 cm、内径0.25 mm的管路插入PDMS块顶部的出口孔中。这可使液体顺畅流出通道。至此，器件制备完成。

5. 微流控装置表面的处理

1. 向用于VWF实验的微流控装置入口注入 <10 µL 浓度为10 µg/mL的生物素化牛血清白蛋白（BSA-biotin），该溶液溶于无菌1×PBS中。对于λ DNA实验，注入 <10 µL 浓度为1 mg/mL的BSA-biotin。注射后在移液枪吸头中保留几微升BSA-biotin，并使吸头保持插入入口中。
   1. 始终在吸头周围保留一滴去离子水。这可防止气泡进入通道。每次向通道中注入新溶液时均应采用此技术。
   2. 让BSA-biotin在装置中孵育2小时。BSA将非特异性结合到盖玻片表面（图3A）。
2. 移除移液枪吸头。向通道中注入 <10 µL 酪蛋白封闭液，并孵育30分钟。酪蛋白将封闭所有未结合位点，减少生物分子对表面的非特异性结合（图3B）。
3. 移除吸头，并向通道中注入 <10 µL 浓度为10 µg/mL的链霉亲和素（溶于无菌1×PBS中）用于VWF实验。对于λ DNA实验，使用浓度为100 µg/mL的链霉亲和素。孵育10分钟。链霉亲和素将结合至BSA-biotin上的生物素基团（图3C）。
4. 移除吸头，并向通道中注入 <10 µL 洗涤液（含0.05% Tween 20的1×PBS），以洗去未结合的过量链霉亲和素。
5. 移除吸头，并向通道中注入 <10 µL 浓度为28.4 nM的VWF（用酪蛋白溶液稀释）或步骤2.3.3中的λ DNA。VWF孵育3分钟，λ DNA孵育45分钟（图3D）。
6. 移除吸头，并向通道中注入 <10 µL 游离生物素溶液（5 mM，溶于酪蛋白溶液中）。游离生物素将封闭通道表面残留的链霉亲和素结合位点（图3E）。

6. 荧光显微镜下观察 VWF 和 Lambda DNA

1. 制备1 mL含2.2 mM原儿茶酸和37 nM原儿茶酸-3,4-双加氧酶的酪蛋白封闭溶液（以减少光漂白）。将溶液吸入注射器并固定在注射泵上。取一段长30 cm、内径0.25 mm的管路，将一端连接至注射器针头。通入溶液以排除气泡。将管路另一端连接至微流控装置的入口。建议在步骤5.6之后3分钟进行此操作。
2. 选择全内反射（TIRF）或共聚焦荧光显微镜的最高倍物镜（即60–100倍）。如有需要，在物镜上滴加一滴浸油。将微流控装置放置在显微镜载物台上，使盖玻片与物镜齐平。
3. 开始明场显微成像。调节焦距，使杂质和气泡等特征清晰可见。然后在X和Y方向调节载物台，直至微流控通道边缘出现在视野中并平分图像。
4. 切换至488通道（FITC）。根据需要调节Z轴位置和TIRF角度，直至可分辨单个绿色球状分子。这些分子为VWF或λ DNA分子。
5. 调节曝光时间和激光强度，以在不过快引起光漂白的前提下观察荧光分子。调节对比度以更清晰地显示分子。
6. 启动注射泵，使酪蛋白封闭溶液流入通道并从出口流出。此操作应在步骤5.6之后精确5分钟进行。通过启停流动观察分子构象的变化。施加流动时，流速控制在5,000至30,000 µL/h之间。在整个微流控装置的不同区域重复此操作。持续进行该过程，以寻找在多次启停流动循环中能够伸展并回缩的分子。
7. 记录分子达到最大伸展并完全回缩成球状所需的时间。在剪切流条件下录制分子连续行为的视频，选择最佳的曝光时间、曝光频率和视频时长，以完整捕捉其伸展行为的全部范围并最小化光漂白。
8. 将视频保存为带标尺的.AVI文件。
   注意：本实验方案可在此处暂停。

7. 构象变化的图像分析

1. 利用流速（Q）以及矩形微流控通道的高度（h）和宽度（w），计算施加在大分子上的壁面剪切速率（）。使用以下公式进行计算：
   
2. 使用自定义的 MATLAB 代码（见补充文件），确定任意生物大分子在不同剪切速率下的长度。创建一个名为videos analysis的文件夹，其中包含以下 MATLAB 代码文件：main.m、save_each_frame.m、get_length.m 和 get_length.fig。在videos analysis文件夹内创建一个名为videos的子文件夹，并将待分析的 .AVI 文件添加到该子文件夹中。
3. 使用 MATLAB 2019a 打开main.m并运行代码。在命令窗口中出现提示请输入要分析的数据文件：后，输入待分析视频文件的名称。
4. 在打开的图形用户界面（GUI）中，将右上角文本框中的阈值（threshold）设置为20，然后点击Set threshold button确认设置。
5. 使用窗口顶部工具栏中的数据光标（data cursor），在标尺条（scale bar）上任意位置选择一个像素。在窗口右侧的Scale bar区域点击Start point按钮，所选像素的（x, y）坐标将显示在按钮右侧。随后点击Pixel size (µm)按钮。每个视频中只需测量一次像素尺寸。
6. 在目标分子上任选一个像素，然后在窗口右侧的VWF区域点击Start point。当所选像素的坐标出现在右侧文本框后，依次点击Left end、Right end和String length，以获取图像中分子的长度。
   注意：尽管代码中该部分命名为VWF，但此步骤可用于分析任意生物大分子的构象变化。
7. 仔细核对分子的左端和右端位置。放大图像并使用数据光标检查感兴趣区域的像素位置。必要时手动重新选择端点像素，并重新计算长度（以像素为单位）。
8. 将测得的像素尺寸（µm）和字符串长度（像素数）记录至 Excel 表格中，并计算出以 µm 为单位的分子长度。
9. 对每帧图像重复上述步骤。使用 GUI 窗口右下角的Last和Next按钮切换同一视频文件中的不同图像。点击Close关闭 GUI 窗口。

结果

观察VWF和λ DNA等生物大分子的动态行为，在很大程度上依赖于优化其与装置表面的结合。在微流控装置中，按照推荐时间孵育表面处理试剂，对于实现仅通过少数锚定位点的结合至关重要，从而使分子能够在流动变化时自由伸展和回缩。如果蛋白质或DNA通过多个连接位点结合过强，则分子只能部分伸展或完全无法伸展。这种情况在VWF上尤为明显：若其在施加自由生物素阻断前，在装置表面静置超过3分钟，则更容易发生过度结合。VWF在表面静置的时间越长，其生物素基团与表面链霉亲和素基团的结合越多，分子解旋的灵活性就越差。相反，若分子结合过弱，则会在流动作用下脱离表面而消失。若VWF或λ DNA孵育时间过短，导致形成的生物素-链霉亲和素相互作用过少，就可能发生此类情况。此外，当施加极高的剪切速率（>200,000 s^-1）时，生物素-链霉亲和素相互作用会被削弱，分子也可能因此解离脱落。

理想的分子能够结合到这样的程度：在多次启停流动的循环过程中，它仍可解旋并松弛。分子具备这种构象变化的灵活性，通常表现为随着流动范围内剪切速率的升高，其伸展长度逐渐增加。视频1

讨论

为了利用荧光显微镜获得高质量的单分子构象变化数据（如本方法所述），关键在于孵育分子足够适当的时间，尽量减少分子与表面之间的非特异性相互作用，并设置合适的显微镜参数以降低光漂白。分子自由发生构象变化的能力与其和表面之间形成的生物素-链霉亲和素相互作用数量密切相关。如前所述，必须通过在无流动条件下孵育适当时间来控制这一过程。此外，如果盖玻片未被有效封闭，蛋白质或DNA可能会非特异性地结合到盖玻片表面。若未使用推荐的封闭溶液，分子会非特异性地附着在玻璃表面，从而对施加的任何流速均无响应。在早期表面处理过程中使用酪蛋白封闭液，并在流体实验期间持续维持其存在，对于减少此类非特异性相互作用至关重要。最后，捕捉单个分子连续而动态的行为需要在图像采集过程中频繁激发荧光团。如果激光强度、曝光时间和曝光频率过高，则可能导致快速的光漂白。因此，必须协同调整这些参数，并制定策略在不牺牲数据的时间分辨率或图像分辨率的前提下降低其数值。

如果未观察到分子的延伸与松弛现象，则应采取额外步骤。将分子在装置中的孵育时间延长或缩短，超出方案中建议的时间范围。针对每一个测试的时间点，将BSA-生物素和链霉亲和素的浓度分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 标记试剂盒	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 凝胶柱	Bio-Rad	7326221
生物素	Sigma-Aldrich	B4501	在步骤 5.6 中用作游离生物素
生物素-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-生物素	Sigma-Aldrich	A8549
盖玻片	VWR	48393-195	No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP 混合物	Invitrogen	10297018
微型透析装置用浮筒	Thermo Scientific	69588
Klenow 片段 (3'→5' 外切酶缺陷型)	New England BioLabs	M0212S	用于步骤 2.1.1 中的 10X 反应缓冲液和步骤 2.2.2 中的 1X 反应缓冲液
λ DNA	New England BioLabs	N3011S
微型透析装置	Thermo Scientific	69570	10K 分子量截留值，0.1 mL 体积
NEBuffer 4	New England BioLabs	B7004S
NHS-PEG4-生物素	Thermo Scientific	21330
原儿茶酸 3,4-双加氧酶	Sigma-Aldrich	P8279
原儿茶酸	Santa Cruz Biotechnology	sc-205818
PDMS 制备用硅橡胶试剂盒	The Dow Chemical Company	4019862
链霉亲和素	Sigma-Aldrich	85878
封闭液	CANDOR Bioscience	110 050	在整个实验方案中用作酪蛋白封闭液
乙烯基洁净室胶带	Fisher Scientific	19-120-3217
人血浆血管性血友病因子	Millipore Sigma	681300
YOYO-1 染料	AAT Bioquest	17580
内径 0.25 mm 的管路	Cole-Parmer	EW-06419-00
25 号针头	Thomas Scientific	JG2505X