靶向大鼠小肠：经肠系膜上动脉的长期灌注

摘要

大鼠肠系膜上动脉（SMA）长期灌注通路的建立是一种外科手术，其操作包括对SMA的一个近端分支进行插管。导管从腹部切口引出，并经皮下隧道穿行至肩胛间区域。

摘要

在人类中，可通过股动脉或腋动脉的微创介入放射学导管插入术对肠系膜上动脉进行插管。由于大鼠解剖结构尺寸较小，对其进行肠系膜上动脉插管更为困难。本研究的目的是描述一种用于大鼠肠系膜上动脉插管的外科技术，以实现对自由活动动物的肠系膜上动脉血管床进行长期药物输注，并在术后24小时恢复期后获得较高的导管通畅率。

为了避免直接穿刺导致的肠系膜上动脉（SMA）血栓或出血风险，可游离SMA的一个近端分支，远端结扎后，用外径0.25 mm的聚氨酯毛细导管进行插管，导管尖端推进至接近SMA起源于腹主动脉的位置。随后将导管在皮下潜行引至动物颈部背部，并通过人工瓣膜穿出皮肤。导管的体外部分固定于半刚性支撑系统中，并连接至笼外的连续输注泵，使大鼠可自由活动。

通过术后血管造影和解剖结果证实了套管位置的正确性。在大多数大鼠中，通过观察到泵内液体完全排出，并确认套管可用于血液采样或向肠系膜上动脉区域输注生理盐水24小时后仍保持通畅，从而保证了导管的通畅性。

引言

人类和大鼠的肠系膜上动脉（SMA）均起源于腹主动脉，为从十二指肠至横结肠近端的肠段提供动脉血。SMA发出 numerous 分支。

毛细血管灌注后，肠系膜循环经门静脉引流至肝脏，在此经历肝代谢后重新进入体循环。对肠系膜上动脉（SMA）进行插管可用于诊断、治疗性栓塞以及选择性或连续性药物输注，以评估其对肠道的影响，或更重要的是评估肝脏代谢和化学物质清除情况。在人类中，可通过多种经皮途径（如经股动脉或经腋动脉穿刺和插管）进行微创介入放射学SMA导管插管，用于血管内治疗¹或选择性药物输注²。

文献报道了多种小动物腹部血管插管技术：肠系膜上静脉（SMV）³、肠系膜下动脉（IMA）⁴、肠系膜淋巴管⁵、肝动脉⁶，以及在大鼠中开展的离体肠灌注研究⁷。与静脉侧插管相比，由于肠系膜上动脉（SMA）压力较高，其在大鼠中的插管操作更具挑战性，同时存在血栓形成和出血的风险。尤其当大鼠在手术台上从麻醉状态苏醒时进行插管操作，难度显著增加；若实验要求术后动物在笼内自由活动，则问题更为突出。

最近一篇论文将肠系膜上动脉插管作为动物麻醉状态下实验（血压测量）的一部分进行了描述⁸。然而，目前尚无关于在非限制性动物体内进行肠系膜上动脉长期输注的外科插管技术的详细描述。本文旨在逐步介绍一种通过近端分支进行肠系膜上动脉长期插管的外科技术，该方法可实现药物对肠系膜血管床的选择性输注，持续时间至少24小时或更长。由于稳定且牢固的插管需要对导管插入部位的血管进行永久性结扎和闭合，本技术避免将导管直接插入肠系膜上动脉⁹，而是通过插管其近端分支进入该血管，插管位置应尽可能靠近肠系膜上动脉自腹主动脉发出的起始处。近端输注可使输注的药物到达尽可能广泛的解剖区域，同时不阻断主干血管中的血流。

大鼠肠系膜上动脉插管技术具有多种应用。通过该技术可选择性地向肠系膜动脉腔内给药，从而在胃肠道水平实现局部作用，并避免全身效应及肝脏药物代谢。与较大的动物模型相比，肠系膜上动脉插管大鼠模型具有优势：成本较低、符合伦理要求，且操作和学习更为简便。相较于小鼠模型，大鼠模型中的肠系膜上动脉插管手术也更容易实施。

方案

本研究已获得当地动物伦理委员会（Università Cattolica del Sacro Cuore，罗马）批准，并依照意大利卫生部的规定进行。

1. 准备用于插入肠系膜上动脉近端分支的导管

1. 将外径0.93 mm、内径0.5 mm的较粗导管剪至所需长度（约30 cm）。
2. 将较细导管（外径0.4 mm，内径0.25 mm）剪成约5 cm长，并将其一端插入较粗导管内约1 cm。
3. 使用氰基丙烯酸酯胶水将两根导管固定在一起，注意避免堵塞管腔。
4. 将较粗导管的自由端连接至安装在盛有生理盐水的1 mL注射器上的鲁尔接头（23 G）。
5. 用剪刀将较细导管的自由端剪尖，以便于将其插入肠系膜上动脉（SMA）的分支。
6. 用生理盐水冲洗导管，检查其通畅性。
   ​注意：导管的尖端在动物活动过程中不会损伤动脉，因为导管已被固定，不会在血管内滑动。

2. 大鼠手术前的准备工作

1. 采用氯胺酮/赛拉嗪（100/10 mg/kg）进行肌肉注射麻醉。
   注：麻醉深度充足的标准为足趾夹捏反射消失或几乎消失。
2. 剃除手术区域的毛发：肠系膜上动脉分支插管部位为腹部，导管出口部位为颈背部。
3. 使用外科擦洗剂或溶液以环形动作无菌清洁手术区域，随后用无菌生理盐水或70%乙醇冲洗，重复3次。
   注：所有准备工作均应采用无菌技术进行。
4. 使用外科擦洗剂或溶液以环形动作清洁，随后用无菌生理盐水或70%乙醇处理，重复3次。
5. 将动物置于仰卧位，并固定四肢。

3. 肠系膜上动脉近端分支的插管

1. 在切口前通过测试足垫夹捏反射来确认麻醉深度是否合适。
2. 覆盖无菌、防水的手术巾。
3. 使用手术刀片沿胃系膜区域中线作一条3 cm长的直线切口，逐层切开腹壁直至腹膜腔。
4. 将浸有生理盐水的纱布放置于手术巾上方的剖腹切口周围。使用缝线保持手术切口开放。
   注意：所有棉片和手术器械必须无菌。
5. 使用棉签识别并暴露小肠，沿其自然走向辨认肠系膜。将肠系膜从剖腹切口中取出，并向下置于纱布上（图1A）。
6. 通过触诊搏动识别肠系膜上动脉（SMA）。
7. 使用棉签在肠系膜脂肪组织中"开辟通路"，暴露肠系膜上动脉及其近端2-3个分支。
8. 选择一个足够粗大的SMA近端分支，以便进行插管操作。在其起始处下游3-4 cm处用4-0丝线结扎该分支，结扎时保留较长的线端以备后续操作。
9. 在SMA分支下方放置硬质支撑物。此处可用手术镊的手柄作为支撑。
10. 用优势手持镊子夹住较细导管的一端（另一端连接较粗导管），同时用另一只手牵拉缝线两端，以拉紧血管，便于导管插入（图1B）。
11. 将导管尖端与血管平面呈20°角，朝血流相反方向固定。
12. 轻压导管尖端，使其穿透动脉壁并插入导管。
    注意：插管过程无需切开动脉；导管尖端可自行刺破血管壁以利进入。当观察到血液回流至导管内时，表明插入位置正确。
13. 继续将导管沿动脉分支向靠近SMA起始处推进约1 cm。
14. 使用外科结（4-0丝线）将导管固定于动脉上，并通过注入1 mL无菌生理盐水或采集血样来验证其功能正常。

4. 导管的隧道式穿入及在输注支持系统中的放置

1. 在改变动物体位之前，先在切口处放置无菌手术巾。
   注意：通过使用尖头手术器械在皮下间隙施加压力，形成从背部到腹部的隧道。应在腹部和背部切口处使用无菌手术巾。
2. 在颈部后侧区域做一个1 cm的切口，并置入球形瓣膜。
3. 将导管从剖腹手术通路经皮下组织穿过至颈部放置的瓣膜处（图2A）。使用导管塞封闭导管远端，以防止空气进入。
4. 将小肠复位至腹腔内。用连续的3-0丝线缝合腹壁并关闭皮肤切口。
5. 用缝线将瓣膜固定在颈部皮肤上。 用连续的3-0丝线缝合皮肤切口。

5. 术后管理

1. 为大鼠穿上外套以保护按钮阀。在输注过程中，使用钢棒保护导管的暴露部分，并将其固定在阀门上（图2B）。
   注意：由于手术是在无菌技术下进行的，因此无需使用抗生素。术前应给予非甾体抗炎药以控制疼痛（5 mg/mL 梅洛昔康注射液，1 mg/kg，每日一次，最多连续3天）。术后将大鼠置于代谢笼中，维持输注所需时间（24小时）。随后通过吸入异氟烷对大鼠重新麻醉，以完成输注系统的拆卸。之后可将大鼠饲养于普通笼中，维持12小时光照/12小时黑暗循环，并自由摄取食物和饮水。
2. 将大鼠置于代谢笼中，维持输注所需时间。此时大鼠已清醒，可在笼内自由活动和进食。
3. 将导管远端连接至充满50 mL无菌生理盐水的弹性体泵（最大容量100 mL，流速5.0 mL/h），开始持续输注24小时（图2C）。
4. 术后第一天，肌肉注射抗生素（恩诺沙星，10 mg/kg，前24小时使用），随后改为口服给药（500 mL饮水中加入100 mg恩诺沙星）。苏醒期间肌肉注射镇痛药物（酮洛芬，5.0 mg/kg），之后数日改为口服（饮水中加入200 mg对乙酰氨基酚）。
   注意：将口服药物溶于饮水中时应适当稀释，以获得可接受的口感。密切监测体重变化及水合状态。
5. 输注结束后（24小时），拆除动物体外输注系统，移除泵、外套、钢棒和阀门。在导管自颈部穿出处将其结扎并剪断，使残端留于皮下，随后缝合伤口。
   注意：此阶段可能需要通过吸入异氟烷对大鼠进行数分钟的短暂麻醉。
6. 将大鼠单独饲养于普通笼中，维持12小时光照/12小时黑暗循环，并自由摄取食物和饮水。
   注意：术后基础食物摄入量约为30 g/天，基础饮水量约为50 mL/天。平均 体重应约为400 mg。

结果

本研究中，对15只大鼠进行了该操作。在生理盐水输注24小时结束时，代谢笼中未观察到生理盐水或血液流失的迹象，所有动物的腹部伤口以及笼具均保持清洁。

在正常笼具中，对大鼠观察5天，每天监测体重以及水和食物摄入量。在此期间，动物经肉眼检查的一般状况良好，未见行为异常迹象。所有大鼠术后立即恢复进食。平均每日食物和水的摄入量逐渐增加，至术后第3天恢复至正常水平，分别如图3A和3B所示。从图3C可以看出，体重增长规律，呈逐渐上升趋势，直至观察期结束。大鼠排便情况无异常改变，每日粪便和尿液排泄量均正常。

24小时后，仅2个泵（分别残留40 mL和20 mL）中存在生理盐水残留（初始装填量为50 mL），而其余泵（86.7%）均已排空。此外，在此输注期结束后，12根导管（80%）仍可正常用于采血和生理盐水输注（5 mL），而3根导管已不再通畅（其中2根连接于有残留液的泵）（表1）。

在尸检时，100%的导管（n=15）仍位于肠系膜上动脉分支内，且未发现大鼠存在肠缺血迹象图4B）或腹腔内出血。发现3根阻塞的套管分别在距肠系膜上动脉分支插入处0.5 cm、1 cm和1.5 cm处发生弯曲。该现象可能与动物在笼内活动所致的移动有关。

在5只大鼠中，手术后立即在连接泵之前，向肠系膜插管内注入2 mL碘化造影剂，通过影像增强器获得血管造影图像（术中进行血管造影）。在每只大鼠（n=5）中，均可观察到肠系膜动脉环以及肠系膜上动脉（SMA）及其主要分支，且造影剂未扩散至腹腔，如图4A所示。这证实插管已准确放置并固定于SMA的分支处。

图1：实验照片。（A）小肠自然平铺于纱布上的状态（可清晰观察到肠系膜上动脉及其所有分支）；（B）操作者将导管插入肠系膜上动脉分支。血管下方必须有稳固支撑，以确保导管顺利插入。远端丝线结扎封闭血管，近端丝线则用于固定导管于分支内。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：输注支持系统。（A）导管经皮下隧道化后，从颈部后部穿出，连接至白色阀门；（B）大鼠穿戴固定夹克以稳定白色阀门，钢杆在输注期间保护导管；（C）大鼠置于代谢笼中，通过弹性泵向导管（经钢杆引出）输注生理盐水的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：大鼠（n=15）在5天观察期内食物摄入量、水摄入量和体重增长的代表性数据。 平均每日食物摄入量（A）和水摄入量（B）逐渐增加，并在3天后稳定于生理水平。平均体重增长（C）在整个观察期内持续稳步上升。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：（A）通过套管注入造影剂后肠系膜动脉区域的血管造影图像（证明套管位置正确）；（B）在尸检过程中套管仍保持良好位置的图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

	弹性泵		导管
	空	有残留	通畅	不通畅
n=15	13	2	12	3
%	86.7	13.3	80	20

表1：弹性泵在生理盐水输注24小时后的排出情况及导管通畅性。通过使用注射器从导管中回抽血液并推注5 mL生理盐水来检测导管通畅性。

讨论

该大鼠肠系膜上动脉灌注模型的主要优势在于其稳定性，在绝大多数动物中可持续至少24小时。抗凝剂的灌注可能延长这一时间间隔。该模型可实现对肠系膜区域的选择性药物灌注，靶向小肠及结肠近端部分。

该技术的成功依赖于多个关键步骤。为了在非常细小的血管中实现插管，选择体重至少为400 g的大鼠至关重要；性别和年龄则无关紧要。正确选择手术器械和导管类型也非常重要。本实验中，将一根较小的聚氨酯导管（外径0.4 mm，内径0.25 mm）插入较大的导管（外径0.93 mm，内径0.5 mm）中1 cm，以构建一种功能完善且实用的导管，可同时连接小动脉和较大的输注系统。

第一个外科关键步骤是清除肠系膜上动脉（SMA）及其拟用于插管的分支周围的脂肪组织（步骤 3.5）。这有助于避免将套管插入组织与动脉之间，这是常见的错误。然而，此清理步骤较为困难，因为SMA的小分支较为脆弱，容易受损。如果分支受损，可通过结扎止血，并选择另一更近端的分支，以避免浪费实验动物。

为防止套管内形成气泡并避免气体栓塞，插入分支前必须用生理盐水充满套管直至其尖端。为固定套管位置，需在动脉穿刺点与套管尖端之间、导管周围的血管上方使用外科缝线（4-0 丝线）进行结扎。外科结应足够紧以固定套管，但不可过紧导致套管闭塞（步骤 3.12）。

确保插管正确的最佳方法是观察到血液通过导管回流（步骤 3.10）。如果未出现此现象，可能由以下原因导致：

导管未正确插入动脉；

导管位于动脉内，但因位置不正确而被结节阻塞；

导管位于动脉内，且导管中的气泡减缓了液体流动；

导管内已形成血凝块。

错误的插管可能是由于导管置于动脉与脂肪组织之间的间隙所致。此时需要重新插管。当打结时 若血管上方的结扎线阻塞了导管，可非常小心地解开并重新打结。导管中出现的小气泡通常不会影响插管效果，也不危及生命；但若导管内存在较大气泡，则需使用注射器回抽或重新调整导管位置 将导管置入不同的分支。通常，在操作过程中每隔一段时间推注0.2 mL生理盐水团注液，即可避免血栓形成并保持导管通畅。

本研究的一个局限性是对导管在较长时间输注过程中通畅性的评估不足：本实验中，大鼠被饲养在代谢笼内，进行了24小时的输注。若需实现更长时间的输注，可能需要采用抗凝治疗，但本研究未使用此类治疗。然而，在输注期间，大鼠必须饲养在代谢笼中，因为只有该笼具能够支持输注系统。这种环境对动物而言较为不适，若处理时间延长，动物可能会产生应激反应。此外，本实验仅使用了生理盐水进行输注，因此尚无关于特定药物给药效果的结果。该方法的一个局限是无法对用于插管之外的上游动脉分支（如果存在）进行输注。因此，建议选择距离主动脉最近的分支进行插管。

目前文献中尚无其他针对自由活动动物的长期经肠系膜上动脉（SMA）输注的大鼠模型。与多年前描述的肠系膜下动脉（IMA）插管模型相比⁴，本文所述技术具有更广泛的实验应用范围，因其允许在SMA灌注区域进行药物输注，而不仅限于结肠。最近，首次通过选择性插管SMA的一个分支，将肉毒杆菌毒素直接输注至肠系膜动脉区域，以研究其对肠道平滑肌的作用¹⁰，但未来还可测试更多其他药物。例如，可输注抗凝剂以研究肠系膜血栓形成，或作用于肠道微生物群的药物¹¹，甚至可用于炎症性肠病的药物¹²。动脉内输注尤其适用于肠道代谢研究，因为可在血液进入门脉循环（在此将经历肝代谢）之前评估药物效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
克里尔-伍德持针器	2Biological Instruments		尖端形状：直型；尖端宽度：2 mm；夹持长度：14 mm；锁扣：有；剪刀功能：无；合金/材料：不锈钢；长度：15 cm；带齿：是
超细格拉夫镊子	2Biological Instruments		尖端宽度：0.5 mm；尖端尺寸：0.5 × 0.5 mm；合金/材料：不锈钢；长度：10 cm
鲁尔短接适配器	BD Intramedic		23号规格，用于427410导管
膜阀	Biomed	Mod 617
聚氨酯导管	ENKI		外径：0.4 mm，内径：0.25 mm
硅胶导管实验室管路	Healthcare industries	508-002
弹簧剪刀	2Biological Instruments		尖端形状：倾斜型；尖端：锐利；合金/材料：不锈钢
学生用手术剪刀	2Biological Instruments		尖端形状：直型；合金/材料：学生级不锈钢；带齿：否；特点：学生级品质