LarvaSPA：一种幼虫固定方法 果蝇 用于长期延时成像的幼虫

摘要

本方案描述了一种安装方法 果蝇 幼虫，以实现对完整活体动物超过10小时的连续延时成像。该方法可用于成像靠近幼虫体壁的多种生物学过程。

摘要

活体成像是一种研究细胞生物学问题的宝贵方法。果蝇幼虫特别适合进行体内活体成像，因为其幼虫体壁和大多数内部器官具有透明性。然而，对完整的果蝇幼虫进行超过30分钟的连续活体成像一直具有挑战性，原因是难以在不造成损伤的情况下长时间固定幼虫。本文介绍一种名为LarvaSPA的幼虫装片方法，可实现对活体果蝇幼虫持续超过10小时的高时间与空间分辨率连续成像。该方法通过使用紫外反应性胶将幼虫部分粘附于盖玻片，并利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）块进一步限制幼虫运动，从而实现稳定固定。该方法适用于从二龄到游走期三龄的各个发育阶段的幼虫。我们展示了该方法在研究果蝇体感神经元动态过程中的应用，包括树突生长以及损伤诱导的树突退化。该方法还可用于研究发生在幼虫体壁附近的多种其他细胞过程。

引言

延时活体成像是一种研究动态细胞过程的有力方法。延时录像所提供的时空信息能够揭示回答细胞生物学问题所需的重要细节。Drosophila 幼虫因其透明的体壁可实现对内部结构的无创成像，已成为活体成像研究中广泛使用的体内模型^1,2。此外，Drosophila 拥有大量可用于荧光标记解剖结构和大分子的遗传工具³。然而，对 Drosophila 幼虫进行长期延时成像仍具挑战性。与静止的早期胚胎或蛹不同，Drosophila 幼虫会持续运动，因此活体成像时必须将其固定。有效的活体 Drosophila 幼虫固定方法包括使用含氯仿的卤代烃油封片⁴、采用异氟烷或敌敌畏溶液进行麻醉⁵，以及通过盖玻片与载玻片之间加压固定⁶。尽管其中一些方法已被用于显微成像，但均不适用于长期活体成像。另有方法被开发用于在爬行幼虫中利用传统共聚焦显微镜或光片显微镜对体壁神经元进行成像^7,8,9，但由于幼虫的运动，这些方法在监测细胞动态方面并不理想。

已开发出新方法以实现长期延时成像 果蝇 幼虫。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS） "幼虫芯片", 果蝇 幼虫可通过特制微室中的真空负压吸附实现有效固定，且无需麻醉。然而，该方法在细胞生物学研究中无法提供较高的时间分辨率，且对动物体型有严格限制。¹⁰另一种使用麻醉装置的方法实现了活体成像 果蝇 在多个时间点对幼虫进行观察，并已应用于神经肌肉接头的研究^{11,12,13,14,15,16}然而，该方法同样无法实现超过30分钟的连续成像，且需要反复使用地氟烷，后者可能抑制神经活动并影响所研究的生物学过程^17,18最近，一种结合微流控装置与低温麻醉的新方法已被用于在短时间内（数分钟）固定不同大小的幼虫¹⁹然而，该方法需要使用冷却系统等专用设备，且长时间固定需要对幼虫进行重复冷却。

在此，我们介绍一种多功能的固定化方法 果蝇 适用于持续超过10小时无间断延时成像的幼虫培养方法。我们称之为 "通过部分附着实现幼虫固定" （幼虫SPA，LarvaSPA）涉及将幼虫表皮粘附到盖玻片上，并置于定制的成像室中进行成像。本方案描述了如何制备成像室以及如何固定不同发育阶段的幼虫。在LarvaSPA方法中，利用紫外光反应性胶水将幼虫特定体节固定于盖玻片上。此外，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）长方体对幼虫施加压力，防止其移动逃逸。成像室内保持空气与湿度，确保部分固定的幼虫在成像过程中维持存活。相较于其他技术，LarvaSPA具有以下优势：（1）它是首个允许对完整幼虫进行连续活体成像的方法 果蝇 幼虫可进行数小时的高时空分辨率成像；（2）该方法对幼虫尺寸的限制较少；（3）成像室和PDMS立方体可低成本制备，且可重复使用。

除了描述幼虫装片方法外，我们还提供了该方法在研究果蝇（Drosophila）树突状分支（da）神经元树突发育和树突退化中的若干应用实例。

方案

1. 制作成像室

1. 金属框架可在普通机械加工车间使用铝块加工而成。框架的具体参数如图1A所示。
2. 构建成像室时，使用长盖玻片（22 mm × 50 mm）和紫外胶将金属框架底部密封（图1A）。使用手持式紫外灯固化紫外胶。

2. 制备PDMS立方体

1. 准备PDMS立方体的模具。
   1. 将包装胶带的层粘贴到矩形（80 mm × 55 mm）培养皿或圆形细胞培养板的内表面。对于二龄幼虫使用一层（0.063 mm厚），早期三龄幼虫使用两层（0.126 mm厚），晚期三龄幼虫使用三层（0.189 mm厚）（图1B）。
   2. 用剃刀片将胶带切成特定宽度的条状：单层胶带宽度为1.5 mm，双层或三层胶带宽度为2 mm。条带的宽度和厚度将决定最终PDMS立方体所能容纳的幼虫大小。两条胶带之间至少保留5 mm的间距，并移除覆盖该区域的胶带层（图1B）。
   3. 使用粘性胶带清除培养板内表面的灰尘。模具现已准备就绪，可供使用。
2. 制备PDMS混合物。
   1. 在小容器中充分混合7 g PDMS基质与0.7 g固化剂（10:1比例）。
   2. 将容器置于真空干燥器中至少15分钟，以去除混合物中的空气。
   3. 缓慢将约5.5 g PDMS混合物倒入模具中，使其厚度达到1–2 mm（图1B）。
   4. 再次将PDMS混合物放入真空干燥器中至少15分钟，以去除残留的气泡。使用移液器吸头刺破最后残留的几个气泡。
   5. 将PDMS在65 °C的恒温培养箱中于平坦表面固化2小时。
   6. 用剃刀片沿模具边缘轻轻撬动固化的PDMS，使其脱离模具。将PDMS置于两片大面积粘性胶带之间，室温保存。
   7. 对于早期和晚期三龄幼虫，沿胶带条形成的凹槽中心（步骤2.1.2）将PDMS切割成8 mm × 2 mm × 1 mm的立方体（沿图1B中的虚线），立方体长边中心对准凹槽（图1B,C）。对于二龄幼虫，将立方体切割为8 mm × 1 mm × 1 mm。

3. 长时间延时成像用幼虫的制备

1. 准备用于固定的上层盖玻片。
   1. 选择六个PDMS立方体，其凹槽尺寸需与幼虫大小相匹配。根据步骤2.1.1、2.1.2和2.2.7中推荐的PDMS凹槽尺寸进行选择。
   2. 使用粘性胶带清除PDMS表面的灰尘。
   3. 在长盖玻片（22 mm × 50 mm）上粘贴四段双面胶（12 mm × 5 mm），用于后续固定PDMS立方体。两段双面胶之间的间距应与PDMS凹槽的宽度相同。
   4. 在每个PDMS立方体的凹槽内加入少量紫外胶（约1.2 μL），并在盖玻片上双面胶之间的区域滴加六小滴紫外胶。
2. 准备待固定的幼虫。
   1. 使用镊子将幼虫在水中清洗，以去除体表附着的食物残渣。
   2. 将清洗后的幼虫放置于一个无盖的小型（35 mm）培养皿中的湿润滤纸片上。将该小培养皿放入一个较大的（60 mm）培养皿中，大培养皿内放置一片干燥滤纸。在通风橱中，使用塑料移液器向干燥滤纸上滴加8–12滴（160–240 μL）异氟烷，然后盖上大培养皿的盖子。
   3. 等待2–3分钟并观察幼虫状态。当幼虫口钩停止运动时，将其从大培养皿中取出。
3. 固定动物样本。
   1. 若需成像动物背侧结构，将已固定的幼虫放置于盖玻片上双面胶之间的紫外胶上，使幼虫背侧表皮朝向盖玻片。
   2. 将每个幼虫覆盖一个PDMS块，并将幼虫躯干部分嵌入PDMS凹槽中，头部和尾部保留在凹槽外。注意避免紫外胶堵塞幼虫的气门。
   3. 轻轻按压PDMS块的两端，使其粘附于双面胶上，但不要对凹槽区域施加压力。轻拉幼虫尾部，使PDMS下方的表皮展平。
   4. 使用手持式紫外灯在高功率模式下照射4分钟，固化紫外胶（光照强度约为0.07 mW/mm²）。
      注意：使用紫外灯时需佩戴护目镜以保护眼睛。
   5. 将盖玻片翻转，重复步骤3.3.4。
   6. 用20 µL–30 µL水润湿一小片镜头纸（15 mm × 30 mm），并将润湿的镜头纸置于成像室底部（图1A,D）。
   7. 将盖玻片放置于成像室上，使幼虫朝向室内一侧。使用紫外胶将盖玻片两端粘附于金属表面（图1A,D）。此时幼虫背侧已准备好用于共聚焦显微镜成像（图1E）。

4. 成像

1. 使用合适的显微镜对幼虫进行成像。本方案中展示的所有结果（图2、图3、视频S2、视频S3 和 视频S4）均采用配备40倍（1.30 NA）油镜物镜的共聚焦系统获得。

5. 成像室和PDMS立方体的回收

1. 成像后，使用镜头纸去除顶部盖玻片上的油。用剃刀刀片插入盖玻片与金属框之间的缝隙，将顶部盖玻片从金属框上取下。成像室即可重复使用。
2. 用镊子将PDMS立方体从顶部盖玻片上取下。将PDMS立方体在粘性胶带上滚动，以去除胶残留物和灰尘。PDMS立方体即可重复使用。

结果

幼虫成像室通过将定制的金属框架与两张盖玻片粘合而制成。金属框架的设计详见图1A。Drosophila幼虫被置于成像室内，并借助紫外胶和PDMS立方体固定在顶部盖玻片上。PDMS立方体上的凹槽及其所附着的双面胶共同形成容纳幼虫的空间（图1B,C）。PDMS同时施加轻微压力，以展平幼虫体壁并物理限制其运动。最后，在成像室底部放置一小片湿润的镜头纸以提供湿度。该装置可使Drosophila幼虫固定超过10小时，用于连续成像。大多数幼虫在10小时后仍存活，并可恢复培养至蛹期。该成像室一次最多可容纳九只幼虫。图1D展示了六只晚期三龄幼虫安装在成像室中的情况。幼虫躯干被固定，而头部和尾部仍可自由活动（图1E和视频S1）。该方法已成功用于对二龄至游走期三龄幼虫进行长达15小时的连续高分辨率成像。该成像室设计适用于正置显微镜...

讨论

本文介绍了 LarvaSPA，这是一种用于长期延时成像的活体Drosophila幼虫固定通用方法。该方法无需回收或重新固定幼虫，可实现连续不间断的成像，因此特别适用于追踪耗时数小时才能完成的生物学过程，例如树突的退化与再生。该方法还可用于成像细胞内钙动力学以及微管生长等亚细胞事件。由于在成像过程中幼虫体壁保持稳定，空间和时间分辨率可根据具体成像需求进行调整（例如，用于追踪快速的亚细胞囊泡运动，或监测神经元分支模式的缓慢整体变化）。此外，该方法适用于不同发育阶段的幼虫，且无需特殊设备。因此，LarvaSPA 有望被众多Drosophila实验室用于解决多种科学问题。

影响该方法成功的关键因素，包括PDMS长方体的性质以及幼虫的发育阶段
PDMS长方体的尺寸和沟槽的深度需与幼虫的大小相匹配。若PDMS长方体过宽，可能覆盖幼虫的头部和尾部，导致缺氧；而过窄的PDMS长方体则可能无法有效限制幼虫移动。同样，沟槽过深将无法产生足够的压力来固定幼虫，而过浅的沟槽则无法容纳足够的胶水以将幼虫牢固粘附在盖玻片上。根据...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6061 铝棒	McMaster-Carr	9246K421
3M 双面胶带	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch 包装胶带	3M		1.88" 宽 × 22.2 码
DUMONT #3 镊子	Fisher Scientific	50-241-34
玻璃盖玻片	Azer Scientific	1152250
异氟烷	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica 共聚焦显微镜	Leica	SP8，配备谐振扫描器
镜头纸	Berkshire	LN90.0406.24
培养皿（中号）	VWR	25373-085
培养皿（小号）	VWR	10799-192
剃须刀片	Ted Pella, Inc.	121-20
矩形培养皿	VWR	25384-322
SYLGARD 184 试剂盒（PBMS 试剂盒）	Electron Microscopy Sciences	24236-10
移液管	Thermo Fisher Scientific	1371126
紫外胶	Norland products	#6106, NOA 61	折射率 1.56
紫外灯（Workstar 2003）	Maxxeon	MXN02003
真空干燥器	Electron Microscopy Sciences	71232
擦拭纸	Kimberly-Clark	Kimwipes