本方案描述了一种安装方法 果蝇 幼虫，以实现对完整活体动物超过10小时的连续延时成像。该方法可用于成像靠近幼虫体壁的多种生物学过程。
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本文内容
摘要
摘要
活体成像是一种研究细胞生物学问题的宝贵方法。果蝇幼虫特别适合进行体内活体成像，因为其幼虫体壁和大多数内部器官具有透明性。然而，对完整的果蝇幼虫进行超过30分钟的连续活体成像一直具有挑战性，原因是难以在不造成损伤的情况下长时间固定幼虫。本文介绍一种名为LarvaSPA的幼虫装片方法，可实现对活体果蝇幼虫持续超过10小时的高时间与空间分辨率连续成像。该方法通过使用紫外反应性胶将幼虫部分粘附于盖玻片，并利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）块进一步限制幼虫运动，从而实现稳定固定。该方法适用于从二龄到游走期三龄的各个发育阶段的幼虫。我们展示了该方法在研究果蝇体感神经元动态过程中的应用，包括树突生长以及损伤诱导的树突退化。该方法还可用于研究发生在幼虫体壁附近的多种其他细胞过程。
引言
延时活体成像是一种研究动态细胞过程的有力方法。延时录像所提供的时空信息能够揭示回答细胞生物学问题所需的重要细节。Drosophila 幼虫因其透明的体壁可实现对内部结构的无创成像，已成为活体成像研究中广泛使用的体内模型1,2。此外，Drosophila 拥有大量可用于荧光标记解剖结构和大分子的遗传工具3。然而，对 Drosophila 幼虫进行长期延时成像仍具挑战性。与静止的早期胚胎或蛹不同，Drosophila 幼虫会持续运动，因此活体成像时必须将其固定。有效的活体 Drosophila 幼虫固定方法包括使用含氯仿的卤代烃油封片4、采用异氟烷或敌敌畏溶液进行麻醉5，以及通过盖玻片与载玻片之间加压固定6。尽管其中一些方法已被用于显微成像，但均不适用于长期活体成像。另有方法被开发用于在爬行幼虫中利用传统共聚焦显微镜或光片显微镜对体壁神经元进行成像7,8,9....
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方案
1. 制作成像室
- 金属框架可在普通机械加工车间使用铝块加工而成。框架的具体参数如图1A所示。
- 构建成像室时，使用长盖玻片（22 mm × 50 mm）和紫外胶将金属框架底部密封（图1A）。使用手持式紫外灯固化紫外胶。
2. 制备PDMS立方体
- 准备PDMS立方体的模具。
- 将包装胶带的层粘贴到矩形（80 mm × 55 mm）培养皿或圆形细胞培养板的内表面。对于二龄幼虫使用一层（0.063 mm厚），早期三龄幼虫使用两层（0.126 mm厚），晚期三龄幼虫使用三层（0.189 mm厚）（图1B）。
- 用剃刀片将胶带切成特定宽度的条状：单层胶带宽度为1.5 mm，双层或三层胶带宽度为2 mm。条带的宽度和厚度将决定最终PDMS立方体所能容纳的幼虫大小。两条胶带之间至少保留5 mm的间距，并移除覆盖该区域的胶带层（图1B）。
- 使用粘性胶带清除培养板内表面的灰尘。模具现....
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结果
幼虫成像室通过将定制的金属框架与两片盖玻片用胶粘合而成。图1A 中详细说明了金属框架的设计。成像室内的 Drosophila 幼虫借助紫外胶和PDMS立方块固定在上方的盖玻片上。PDMS立方块上的凹槽及其所附着的双面胶带共同形成容纳幼虫的空间（图1B,C）。PDMS同时施加轻微压力，以展平幼虫体壁并物理限制其运动。最后，在成像室底部放置一小片湿润的镜头纸以提供湿度。该装置可将 Drosophila 幼虫固定超过10小时，用于连续成像。大多数幼虫在10小时后仍存活，并可被回收继续发育至蛹期。该成像室最多可同时容纳九只幼虫。图1D 展示了在成像室内固定好的六只晚期三龄幼虫。幼虫躯干被固定，而头部和尾部仍可自由活动（图1E 和 视频S1）。该方法已成功用于对二龄至游走期三龄幼虫进行长达15小时的连续高分辨率成像。该.......
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讨论
本文介绍了 LarvaSPA，这是一种用于长期延时成像的活体Drosophila幼虫固定通用方法。该方法无需回收或重新固定幼虫，可实现连续不间断的成像，因此特别适用于追踪耗时数小时才能完成的生物学过程，例如树突的退化与再生。该方法还可用于成像细胞内钙动力学以及微管生长等亚细胞事件。由于在成像过程中幼虫体壁保持稳定，空间和时间分辨率可根据具体成像需求进行调整（例如，用于追踪快速的亚细胞囊泡运动，或监测神经元分支模式的缓慢整体变化）。此外，该方法适用于不同发育阶段的幼虫，且无需特殊设备。因此，LarvaSPA 有望被众多Drosophila实验室用于解决多种科学问题。
影响该方法成功的关键因素，包括PDMS长方体的性质以及幼虫的发育阶段
PDMS长方体的尺寸和沟槽的深度需与幼虫的大小相匹配。若PDMS长方体过宽，可能覆盖幼虫的头部和尾部，导致缺氧；而过窄的PDMS长方体则可能无法有效限制幼虫移动。同样，沟槽过深将无法产生足够的压力来固定幼虫，而过浅的沟槽则无法容纳足够的胶水以将幼虫牢固粘附在盖玻片上。根据.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
感谢唐凌峰建立了LarvaSPA方法的早期版本；感谢康奈尔大学奥林大厅机械车间的Glenn Swan制作了成像室的早期原型；感谢Philipp Isermann构建金属框架，并对制备PDMS立方体提供了建议；感谢康奈尔大学BRC成像中心提供显微镜使用权限（由NIH资助项目S10OD018516支持）；感谢Maria Sapar对稿件提出的宝贵修改意见。本研究得到了授予H.J.的康奈尔奖学金、康奈尔大学启动资金以及NIH资助项目（R01NS099125和R21OD023824）的支持。H.J.与C.H.共同构思了研究项目并设计了实验方案。H.J.完成了实验工作。H.J.和C.H.共同撰写了稿件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6061 铝棒 | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M 双面胶带 | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch 包装胶带 | 3M | 1.88" 宽 × 22.2 码 | |
| DUMONT #3 镊子 | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| 玻璃盖玻片 | Azer Scientific | 1152250 | |
| 异氟烷 | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica 共聚焦显微镜 | Leica | SP8，配备谐振扫描器 | |
| 镜头纸 | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| 培养皿（中号） | VWR | 25373-085 | |
| 培养皿（小号） | VWR | 10799-192 | |
| 剃须刀片 | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| 矩形培养皿 | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 试剂盒（PBMS 试剂盒） | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| 移液管 | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| 紫外胶 | Norland products | #6106, NOA 61 | 折射率 1.56 |
| 紫外灯（Workstar 2003） | Maxxeon | MXN02003 | |
| 真空干燥器 | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| 擦拭纸 | Kimberly-Clark | Kimwipes |
参考文献
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.....
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重印与许可
