本文介绍了一种利用整体免疫荧光染色、组织透明化、共聚焦显微镜和三维重建技术对小鼠胚胎的第3、4和6对咽弓动脉进行可视化与分析的实验方案。
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摘要
摘要
咽弓动脉（PAAs）3、4和6的形成异常或重塑缺陷导致了部分最严重类型的先天性心脏病。为了研究PAAs的形成过程，我们建立了一种结合整体免疫荧光染色、苯甲醇/苯甲酸苄酯（BABB）组织透明化处理以及共聚焦显微镜成像的实验方案。该方法能够以较高的细胞分辨率清晰显示咽弓动脉的内皮结构，并呈现血管系统的三维连接关系。通过软件分析，我们进一步建立了定量评估PAAs中内皮细胞（ECs）数量的方法，同时可定量分析位于第3、4和6咽弓内PAAs周围血管网状结构中的内皮细胞数量。该技术应用于整个胚胎时，可实现对胚胎血管系统的全面可视化观察与定量分析。
引言
在小鼠胚胎发育过程中，咽弓动脉（PAAs）以对称的双侧成对动脉形式出现，连接心脏与背主动脉1随着胚胎发育，第一对和第二对动脉弓退化，而第三对rd, 4th，以及6th PAAs 经历一系列不对称重塑事件，形成主动脉弓动脉2.
第3、4和6对咽弓动脉（PAAs）通过血管发生（vasculogenesis）形成，即血管的从头生成3。这些弓动脉在形成或重塑过程中出现缺陷，可导致多种先天性心脏病，例如DiGeorge综合征患者所表现出的畸形4,5。因此，阐明调控PAAs发育的机制，有助于更深入理解先天性心脏病（CHD）的病因学。
目前用于可视化和分析咽弓动脉（PAA）发育的方法包括组织切片的免疫荧光染色、血管铸型、印度墨水注射、高分辨率表层显微成像以及/或者整体免疫组织化学染色1,4,5,6,7。本文中，我们描述了一种结合整体免疫荧光染色、共聚焦显微镜和三维图像重建的技术流程，以获取、分析并定量体积数据、血管连接性及细胞身份信息。此外，我们详细阐述了一种对每个咽弓中的内皮细胞（ECs）进行分区和定量的方法，用以研究咽弓血管网的形成及其向咽弓动脉（PAAs）的重塑过程。尽管该方案旨在分析咽弓动脉的发育过程，但也可用于研究其他正在发育的血管网络。
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方案
动物使用和操作程序已获得罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 溶液的配制
- 配制 1 L 含 0.1% Triton-X-100 的磷酸盐缓冲液（PBST），过滤除菌。该溶液可在室温（RT）下保存至少一年。
- 配制 600 µL 封闭缓冲液，其中含 10% 正常驴血清的 PBST。每次使用时新鲜配制。
- 在通风橱中配制以下甲醇（MeOH）稀释液各 50 mL：25% MeOH 的去离子水（dH2O）溶液、50% MeOH 的 dH2O 溶液和 75% MeOH 的 dH2O 溶液。涡旋混匀。室温保存。
- 在 50 mL 锥形管中配制以下苯甲醇-苯甲酸苄酯（BABB）溶液。
- 配制 100% BABB 时，将 32 mL 苯甲酸苄酯加入 16 mL 苯甲醇中（体积比 2:1）。
- 配制 50% BABB 时，将 16 mL 苯甲酸苄酯和 8 mL 苯甲醇加入 24 mL 甲醇中。
- 用铝箔包裹锥形管以避光。这些溶液可在室温下保存长达一年。
注意：BABB 具有毒性和腐蚀性，应按照材料安全数据表（MSDS）进行操作和处置。
2. 胚胎解剖与固定
注意：本方案适用于从任何小鼠品系中分离的 E9.5 和 E10.5 小鼠胚胎（雄性或雌性）。对于更早期或更晚期的胚胎，应通过实验确定孵育时间，以最大化荧光信号的信噪比。
- 将一个35 mm和一个60 mm的培养皿中装满1×PBS，并置于冰上备用。
- 通过吸入CO2处死一只怀孕小鼠。以颈椎脱位作为辅助的安乐死措施。
- 用70%乙醇清洁母鼠腹部区域。使用镊子夹起腹部皮肤，在腹壁中线基部开始，用手术剪做V形切口；继续切开胸腔。提起腹壁组织，将肠道移向一侧，以暴露子宫角。
- 在阴道管基部做一切口，用镊子将子宫从母体中拉出。在每侧卵巢处再做切口，以完全分离子宫。将子宫转移至含有冷1×PBS的60 mm培养皿中。
- 使用直头剪刀在每个着床部位之间的子宫壁上剪开。用玻璃移液管拾取一个蜕膜组织，并转移至含有1×PBS的35 mm培养皿中。在解剖显微镜下，将直头剪刀插入蜕膜与子宫壁之间的间隙，剪开并去除子宫壁。
- 使用精细镊子，沿组织做横向切口并小心将组织从卵黄囊上剥离，从而去除胚胎周围的蜕膜和Reichert膜。通过小心地将组织从胚胎上拉开，并在尿囊和脐静脉处做切口，去除卵黄囊和羊膜囊。
注意：卵黄囊可用于胚胎基因型鉴定。 - 用玻璃移液管将每个胚胎转移至装有1 mL 1×PBS的独立2 mL离心管中。为每根离心管标记唯一标识符。
- 为固定胚胎，小心吸除1×PBS，并加入含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液。在4 °C条件下轻轻振荡孵育过夜。
注意：4% PFA固定适用于本方案中提及的抗体。然而，若使用其他抗体，应优化固定条件。
3. 胚胎染色
注意：本步骤中，胚胎需进行通透化处理，并用一抗和二抗染色。由于PAA的发育进程迅速，胚胎发育阶段的差异将显著影响后续分析结果。因此，在进行后续操作前，必须通过精确计数体节来匹配对照组与突变组胚胎的发育年龄。
- 洗涤胚胎时，小心移除4% PFA，加入1× PBS。轻轻翻转离心管数次。将离心管正立放置，让胚胎沉底。重复洗涤3次。将含有胚胎的离心管置于冰上。
注意：（可选暂停点）洗涤完成后，胚胎可按照第1.3节中的方法，在梯度浓度的甲醇（MeOH）中进行脱水处理（每种浓度30分钟），然后在100% MeOH中于-20 °C保存，最长可保存6个月，以备后续使用。 - 对于E10.5胚胎，使用玻璃移液器将一个胚胎转移至盛有预冷1× PBS的35 mm培养皿中。用精细镊子在后肢上方轻轻夹住胚胎，并进行横向切割，去除胚胎后半部分。此操作可使胚胎在第4.2步中以矢状位平展放置。将胚胎放回含有新鲜1× PBS的2 mL离心管中。
注意：在第3.3至3.8步中，可将对照组和突变组胚胎配对，并在同一管中使用相同的抗体溶液进行染色。- 若在同一管中染色两个胚胎，可用精细镊子夹住其中一个胚胎的第一咽弓上方部位，进行横向剪切以去除头部。此操作可区分同一管中两种不同基因型的胚胎。
- 为使胚胎通透，用移液器小心吸出离心管中的1× PBS，注意避免触碰胚胎。加入1 mL PBST。将离心管置于4 °C，温和振荡过夜。
注意：（可选暂停点）胚胎可在4 °C的PBST溶液中保存数天。 - 为防止抗体非特异性结合，首先小心吸除离心管中的PBST，避免触碰胚胎。向胚胎中加入600 µL封闭缓冲液。在4 °C下温和振荡封闭过夜。
注意：封闭液在使用前需立即在台式离心机上以最高速度离心，以去除杂质。 - 为染色并定量内皮细胞（ECs），使用抗VEGFR2和抗ERG抗体。抗体溶液使用封闭缓冲液配制。抗VEGFR2抗体按1:200稀释，抗ERG抗体按1:1000稀释。
注意：抗体溶液在使用前需立即在台式离心机上以最高速度离心，以去除颗粒物。- 孵育胚胎与一抗时，小心吸除离心管中的封闭缓冲液，避免触碰胚胎。每管加入600 µL一抗溶液。在4 °C下温和振荡孵育4–5天。
- 为洗去胚胎中的抗体溶液，首先从离心管中移除一抗溶液。在室温（RT）下，每小时用1 mL PBST轻轻振荡洗涤一次。当天洗涤4–5次后，在4 °C下温和振荡过夜孵育。次日重复洗涤操作。
- 用封闭缓冲液将抗山羊Alexa Fluor 488和抗小鼠Alexa Fluor 555二抗按1:300稀释，配制二抗溶液。将储备液DAPI按1:1000稀释于封闭缓冲液中。
注意：抗体溶液在使用前必须在台式离心机上以最高速度离心，以去除颗粒物。此外，也可使用其他Alexa Fluor荧光染料替代488或555。- 孵育胚胎与二抗时，从离心管中移除PBST。每管加入600 µL二抗溶液。在4 °C下温和振荡孵育4–5天。
- 为洗去胚胎中的抗体溶液，首先从离心管中移除二抗溶液。在室温（RT）下，每小时用1 mL PBST轻轻振荡洗涤一次。当天洗涤4–5次后，在4 °C下温和振荡过夜孵育。次日重复洗涤操作。
4. 将胚胎包埋在琼脂糖中
注意：在第4节中，将把胚胎（或胚胎）包埋在琼脂糖中。此包埋过程有两个目的：一是在成像前正确地定位胚胎的方向，二是便于在胚胎经BABB透明化处理后（步骤5.2.2 - 5.3.2）重新找到该胚胎。
- 取 2 g 琼脂糖加入 200 mL 去离子水（dH2O）中，配制 200 mL 的 1% 琼脂糖溶液。微波加热至琼脂糖完全溶解。
注意：剩余琼脂糖溶液可于 4 °C 保存，后续使用时重新加热即可。 - 使用塑料石蜡模具和玻璃移液管，将一个胚胎轻轻转移至模具中。小心移除胚胎周围的 PBST 溶液。将胚胎置于矢状位。迅速向模具中加入约 0.5 mL 热琼脂糖溶液，用量以刚好覆盖胚胎并填满模具为宜。确保胚胎周围无气泡产生。
- 将模具置于冰上，并用铝箔覆盖，直至琼脂糖完全凝固。
注意：在移除 PBST 后，切勿让胚胎干燥。琼脂糖溶液必须保持足够温度，以确保加入胚胎时仍处于液态。加入的琼脂糖应足以覆盖胚胎，但不宜过多，否则将影响成像效果。成像深度部分取决于物镜的工作距离。
5. 脱水与组织透明化
注意：本步骤中，胚胎经甲醇梯度脱水后，使用有机溶剂 BABB 透明，并置于两个盖玻片之间，盖玻片间以橡胶垫片隔开；本方案使用 Fast Well 橡胶垫片。Fast Well 垫片具有双面粘性表面。该垫片用于形成一个腔室，胚胎将被放置并固定于其中的两个盖玻片之间。
- 甲醇脱水
- 为新的 2 mL 管标记编号，每个胚胎对应一管。每管加入 1 mL 的 25% 甲醇（MeOH）。
- 使用洁净的手术刀，轻轻切割胚胎周围的琼脂糖，保留足够多的琼脂糖包裹胚胎，以便用镊子夹取。用精细镊子轻轻夹住含有胚胎的琼脂糖块，将其放入已标记、含 25% MeOH 的管中。注意镊子不得接触胚胎本身。
- 将胚胎在室温下避光孵育 1 小时，期间轻柔振荡。
- 小心移除管中的 25% MeOH，避免触碰胚胎。每管加入 1 mL 的 50% MeOH。在室温下避光轻柔振荡孵育 1 小时。
- 小心移除管中的 50% MeOH，避免触碰胚胎。每管加入 1 mL 的 75% MeOH。在室温下避光轻柔振荡孵育 1 小时。
- 小心移除管中的 75% MeOH，避免触碰胚胎。每管加入 1 mL 的 100% MeOH。在室温下避光轻柔振荡孵育 1 小时。重复使用 100% MeOH 洗涤两次。
- 使用 BABB 透明化处理
- 小心移除管中的 100% MeOH，避免触碰胚胎。每管加入 1 mL 的 50% BABB。在室温下避光轻柔振荡孵育 1 小时。
- 小心移除管中的 50% BABB，避免触碰胚胎。每管加入 1 mL 的 100% BABB。在室温下避光轻柔振荡孵育 1 小时。重复使用 100% BABB 洗涤两次。
注：（可选暂停点）胚胎可在含 100% BABB 的管中保存约一周。更长时间的储存会导致 BABB 溶解管体塑料。
- 胚胎封片用于成像
- 将 Fast Well 隔离圈贴附于 24 mm × 60 mm 的 #1.5 玻璃盖玻片上，方法是剥离隔离圈一侧的塑料粘合层。通过在橡胶隔离圈顶部的粘合层施加轻压，确保盖玻片与隔离圈之间无气泡。根据胚胎编号、基因型以及所用染色抗体对盖玻片进行标记。
注：可在两片盖玻片之间使用任意间隔物，只要其厚度足以防止胚胎被压碎即可。我们选用 Fast Well 间隔物，因其厚度合适且使用方便，其两侧均带有粘性表面，可牢固固定于盖玻片上。 - 小心用移液器吸出并弃去管中的 100% BABB。在管中观察到嵌有胚胎的琼脂糖块后，使用精细镊子夹取琼脂糖，小心地将胚胎转移至 Fast Well 内的盖玻片上——注意镊子不得接触胚胎。
- 剥离隔离圈另一侧的塑料粘合层，将第二片盖玻片覆盖其上。通过轻压盖玻片排除气泡。操作时注意避免玻璃破裂。
注：若密封良好，样品可在室温避光条件下平放于载片盒中保存长达一年。
- 将 Fast Well 隔离圈贴附于 24 mm × 60 mm 的 #1.5 玻璃盖玻片上，方法是剥离隔离圈一侧的塑料粘合层。通过在橡胶隔离圈顶部的粘合层施加轻压，确保盖玻片与隔离圈之间无气泡。根据胚胎编号、基因型以及所用染色抗体对盖玻片进行标记。
6. 数据采集
注意：在以下步骤中，将使用共聚焦显微镜对第3、4和6咽弓的内皮细胞进行成像。
- 显微镜载物台上玻片的放置
- 为成像胚胎，使用配备20倍水浸物镜（数值孔径0.95，工作距离0.95 mm）和NIS-Elements AR 5.11.01 64位软件的共聚焦显微镜。
- 使用宽场荧光显微技术，目视定位咽弓区域，并将视野中心对准第4对咽弓动脉（4th PAA）。
- 如果物镜的视野无法覆盖整个咽弓区域，则采集一组具有1%重叠区域的大范围图像并进行拼接。为防止在采集大图像过程中样本移动，可使用塑形粘土轻轻将盖玻片组件固定在载物台上。
- 设置采集参数
- 将针孔大小设置为1.0。
- 在ND Acquisition选项卡下，使用粗调功能设定成像的顶部和底部边界。根据软件规格设置Z步进尺寸。成像厚度应由物镜的工作距离和样本的清晰度共同决定。
- 由于胚胎较厚，需在整个Z层扫描过程中调整增益。针对每个通道（405、488和555），在Z层栈中间位置设置激光强度和增益，并在Z Intensity Correction选项卡下分配相应数值。底部切片使用相同的数值。
- 逐层扫描胚胎，直至荧光信号开始变暗。逐步提高各通道的增益，使信号强度与前一片段相似，并在Z Intensity Correction选项卡下记录新的数值。重复此过程直至完成整个Z层栈扫描。随后将设置导回至ND Acquisition。
- 使用Run Z Correction选项执行扫描。
7. 使用 Imaris 软件进行分析
注意：在这些步骤中，将使用显微镜图像分析软件 Imaris 9.2.0 版本分析共聚焦图像。在此分析过程中，我们首先通过创建表面来选择待分析的兴趣区域。接着，我们将使用 Mask 功能对这些区域进行视觉分离。最后，我们将使用 Spot 功能量化每个兴趣区域内的内皮细胞（ECs）数量。
- 根据第6步所使用的成像软件，将图像转换为.ims格式 Imaris 文件转换器.
- 打开 .ims 文件。设置图像为 正交的 在……下方 相机/标签 | 相机类型 面板
- 定位PAAs并调整图像方向以进行表面处理。
注意：首次打开文件时，会显示为所有成像切片的三维整合图像。在此步骤中，需将三维图像转换为二维图像，以定位穿支动脉（PAAs）。二维图像可使PAAs正确排列，便于后续分析。- 在……之下 特性 面板，关闭 体积. 在……之下 特性 面板，单击 添加新的正交切片器设置 切片方向 到 XY平面. 使用 切片位置 滚动图像以找到PAAs。
- 如果PAAs与图像的顶部和底部不平行，请自由旋转图像，使PAAs从屏幕左侧水平延伸至右侧。在 图像处理 下拉菜单，选择 自由旋转 并点击 好的.
- 3的表面化 rd 咽弓 (图2A，B - B")
注意：在这些步骤中，将使用以下方法追踪咽弓和PAAs 表面 工具，用于生成一个“表面化”的感兴趣区域。这将使每个感兴趣区域能够从周围组织中被直观地分离出来。本文描述了对3D结构中内皮组分进行表面化和分析的步骤rd 咽弓。第4和第6咽弓以类似方法进行分析。- 以暴露整个3的内皮rd 咽弓，点击 添加新表面 位于下方的按钮 特性 面板。双击 表面 1 并将新曲面重命名为 "3rd 咽弓".
- 选择 跳过自动创建，手动编辑. 将表面方向设置为 YZ 平面（冠状位方向）。使用切片位置来放置 3rd 咽弓表面平面至第3处rd PAA 与背主动脉连接。
- 旋转图像，使3rd 咽弓表面平面可见。关闭正交切片器1。
- 在……之下 绘制 | 轮廓 | 模式 标签，选择 距离绘图模式 功能。如有需要，调整参数设置。保持样品间表面处理参数的一致性。本示例中， 顶点间距 是 10 μm。
- 开始上样时，按下 退出 键，然后单击 绘制 按钮。描记 3 的周长rd 用鼠标勾勒咽弓轮廓。通过切片位置移动10-25个切片。描记咽弓的周界。重复此操作，直至完成整个咽弓的描记。
- 要生成所追踪区域的表面，选择 创建表面 属性面板中的按钮。
- 3的表面化 rd PAA (图2C - C")
- 暴露3的内皮层rd PAA，首先通过取消选择3来关闭第7.4步中的表面区域rd 咽弓表面盒。然后，点击 添加新表面 按钮再次。双击 表面 1 并将新曲面重命名为 "3rd PAA".
- 选择 跳过自动创建，手动编辑将表面方向设置为 YZ 平面（冠状方向）。使用 切片位置 3 的放置rd PAA 表面平面至 3rd PAA 与背主动脉连接后，重复步骤 7.4。
- 表面结构的遮蔽
注意：在以下步骤中，每个感兴趣的表面区域都将被掩膜化。掩膜化可使感兴趣区域在成像组织中具有视觉上的区分度，并允许对这些特定的感兴趣结构进行定量分析。下文将描述在 Imaris 软件中可视化和分析 PAA 内皮以及丛状结构（即位于咽弓内 PAA 周围的小血管系统）的操作步骤。在这些步骤中，3rd 将对PAA表面进行遮蔽，以便仅使用第7.7节所述的Spot功能对PAAs进行可视化和分析。- 选择 体积 以可视化所有被遮蔽的通道。按下 退出 使用键盘上的键旋转图像，并将图像定位到 XY 位置。
- 在……之下 编辑 标签，选择 口罩选择 3rd PAA。选择 DAPI 通道并点击 好的对剩余通道重复上述步骤。
- 在键盘上按下 Ctrl + D 查看显示调整面板。选择每个新通道并重命名，以明确显示各通道的内容。例如，这将生成三个新通道： "3rd PAA DAPI", "3rd PAA ERG"，以及 "3rd PAA VEGFR2".
注意：在步骤 7.6.4–7.6.7 中，我们将仅为咽弓丛创建通道。 - 为了将内皮网状结构与原始主动脉丛（PAA）分开显示，我们将首先进行选择 口罩选择 3rd PAA 表面。选择 DAPI 通道。取消勾选 选择表面外部的体素 并检查 选择表面内部的体素 按钮，设置 将表面内部的体素设为零. 点击 好的.
- 对剩余通道重复上述操作。此操作将从新的掩膜通道中排除包含PAA的区域。重命名通道，以明确显示每个通道的内容。例如，这将生成三个新通道： "非PAA DAPI", "非PAA型ERG"，以及 "非PAA VEGFR2".
- 为了观察3内的内皮网状结构rd 咽弓，选择 口罩选择 在……之下 编辑 标签，用于第 3 项rd 咽弓表面。选择 非PAA DAPI 通道。点击 好的.
- 对剩余的非PAA通道重复上述操作。重命名通道，以明确显示每个通道的内容。例如，这将生成三个新通道： "Plexus DAPI", "Plexus ERG"，以及 "Plexus VEGFR2".
- EC编号的定量分析
注意：ERG 的表达标记内皮细胞核，因此便于量化内皮细胞（EC）数量。在这些步骤中，将使用“Spot”功能对 PAA 和丛状结构中由 ERG 表达标记的每个内皮细胞生成一个点，从而量化 EC 数量。在第 7.7 节中，将在掩膜后的 PAA 中为每个 ERG 阳性细胞生成点，随后剔除 ERG 阳性但 VEGFR2 阴性细胞中的点。- 在键盘上按下 Ctrl + D 查看显示调整面板。关闭除 PAA ERG 外的所有通道。
- 在属性选项卡下，点击 添加新斑点 按钮。单击 斑点 1 并将其重命名为 "PAA 内皮细胞总数". 点击 蓝色箭头 按钮。对于 来源频道，选择 PAA ERG 通道。调节 估计的 XY 直径 至4 μm。点击蓝色箭头按钮进入下一个面板。
- 使用滑动标尺调整所见斑点数量，确保每个内皮细胞核（由ERG表达标记）对应一个斑点。点击 绿色双箭头 按钮
- 在显示调整中关闭 PAA ERG 通道，开启 PAA VEGFR2 通道以观察 PAA 内皮。
- 为准确量化内皮细胞（EC）数量，需确保每个细胞点均同时表达两种内皮细胞标志物ERG和VEGFR2。为此，请选择 物体表面 在……之下 编辑标签页 | 添加/删除 面板。按下 退出 按住 Shift 键并选择不需要的点，删除所有非 VEGFR2 阳性的点。
注意：在接下来的步骤中，将在已标记的神经丛中为每个ERG阳性细胞生成斑点，随后剔除ERG阳性但VEGFR2阴性细胞中的斑点。 - 在属性选项卡下，点击 添加新斑点 按钮。选择 斑点 1 并重命名为 "Plexus 内皮细胞总数". 点击 蓝色箭头 按钮。在“源通道”中，选择 Plexus ERG 通道。调节 估算的 XY 直径 至4 μm。对Plexus的EC总数重复步骤7.7.1 - 7.7.5。
- 点击 统计标签 每个位点的功能以确定3中的内皮细胞总数rd PAA 和咽弓丛
- 对剩余的PAAs和咽弓丛重复步骤7.7.1至7.7.6。
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结果
本文所展示的全胚胎免疫荧光染色方案可产生清晰且干净的结果，可用于咽弓血管内皮的三维重建，如图1A所示。每个抗体孵育步骤中，必须保证胚胎有足够的孵育时间，以确保抗体充分渗透至整个样本，同时在抗体孵育后需对胚胎进行彻底清洗。图1B中出现的大而明亮的点状信号，是由于抗体或封闭缓冲液中存在颗粒物所致。我们发现，在使用前对每种溶液进行离心处理，并在每次抗体孵育后延长PBST洗涤时间，可有效解决此问题。
图2展示了用于暴露咽弓及咽囊（PAA）以进行分析的操作流程，该流程在方案第7节中有详细描述。通过使用掩膜功能，Imaris软件可将已构建表面的区域在视觉上分离，并实现独立分析。
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讨论
以三维形式可视化小鼠胚胎中的内皮细胞，为研究其发育过程提供了新的见解3。本文介绍了一种可用于实现胚胎高分辨率三维成像、血管连接性可视化以及咽弓动脉（PAA）形成定量分析的实验方案。该方案可用于研究基因改变或环境损伤对PAA发育的影响。本方案中使用针对VEGFR2和ERG的抗体来观察PAA的形成并定量内皮细胞（EC）数量；然而，也可使用其他抗体来可视化和分析咽弓动脉发育的其他方面，例如神经嵴细胞的募集或平滑肌细胞的分化。如果将该方法应用于胚胎发生的较早阶段，需注意本方案中检测的一些抗原（如ERG）可能尚未表达。此时可使用其他细胞核染料（如DAPI或DRAQ5）或带有核标记的谱系示踪剂进行标记，以实现对EC数量的定量。
该方案中有几个关键步骤：必须确保 1）在更换溶液过程中胚胎不会干燥；2）抗体孵育后胚胎被充分洗涤；以及 3）在使用 BABB 进行组织透明化之前，胚胎已用甲醇（MeOH）完全脱水。
组织透明化前的甲醇洗涤具有两个目的：消除胚胎中因荧光蛋白（例如用于谱系示踪的EGFP或...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Brianna Alexander、Caolan O'Donnell和Michael Warkala对本文稿的仔细审阅与编辑。本研究工作得到了美国国立卫生研究院心肺血液研究所（National Heart, Lung and Blood Institute of the NIH）的资助，项目编号为R01 HL103920、R01 HL134935、R21 OD025323-01，资助对象为SA；AJR受到NHLBI HL103920-08S1以及国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所培训基金T32052283-11的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x 浸水物镜 | Nikon | MRD77200 | |
| 琼脂糖 | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 抗山羊抗体 | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 抗小鼠抗体 | Invitrogen | A-31570 | |
| 分析软件 | Imaris 9.2.0 | ||
| 苯甲醇 | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| 苯甲酸苄酯 | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| 盖玻片 | VWR | 16004-312 | |
| DAPI（5 mg/mL 储存液） | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf 管（2.0 mL） | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| 乙醇 | VWR | 89370-084 | |
| Falcon 管（50 mL） | Corning | 352098 | |
| 快速培养小室 | Grace Bio Labs | 664113 | |
| 镊子 | Roboz | RS-5015 | |
| 山羊抗 VEGFR2 抗体 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| 甲醇 | VWR | BDH1135-4LP | |
| 显微镜 | Nikon | A1HD25 | |
| 小鼠抗 ERG 抗体 | Abcam | ab214341 | |
| 正常驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| 培养皿（35 mm） | Genesee Scientific | 32-103 | |
| 培养皿（60 mm） | Genesee Scientific | 32-105 | |
| 塑料模具 | VWR | 18000-128 | |
| 解剖刀片 | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
参考文献
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- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
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