本文介绍了一种利用整体免疫荧光染色、组织透明化、共聚焦显微镜和三维重建技术对小鼠胚胎的第3、4和6对咽弓动脉进行可视化与分析的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
咽弓动脉（PAAs）3、4和6的形成异常或重塑缺陷导致了部分最严重类型的先天性心脏病。为了研究PAAs的形成过程，我们建立了一种结合整体免疫荧光染色、苯甲醇/苯甲酸苄酯（BABB）组织透明化处理以及共聚焦显微镜成像的实验方案。该方法能够以较高的细胞分辨率清晰显示咽弓动脉的内皮结构，并呈现血管系统的三维连接关系。通过软件分析，我们进一步建立了定量评估PAAs中内皮细胞（ECs）数量的方法，同时可定量分析位于第3、4和6咽弓内PAAs周围血管网状结构中的内皮细胞数量。该技术应用于整个胚胎时，可实现对胚胎血管系统的全面可视化观察与定量分析。
引言
在小鼠胚胎发育过程中，咽弓动脉（PAAs）以对称的双侧成对动脉形式出现，连接心脏与背主动脉1随着胚胎发育，第一对和第二对动脉弓退化，而第三对rd, 4th，以及6th PAAs 经历一系列不对称重塑事件，形成主动脉弓动脉2.
第3、4和6对咽弓动脉（PAAs）通过血管发生（vasculogenesis）形成，即血管的从头生成3。这些弓动脉在形成或重塑过程中出现缺陷，可导致多种先天性心脏病，例如DiGeorge综合征患者所表现出的畸形4,5。因此，阐明调控PAAs发育的机制，有助于更深入理解先天性心脏病（CHD）的病因学。
目前用于可视化和分析咽弓动脉（PAA）发育的方法包括组织切片的免疫荧光染色、血管铸型、印度墨水注射、高分辨率表层显微成像以及/或者整体免疫组织化学染色1,4,5,
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方案
动物使用和操作程序已获得罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 溶液的配制
- 配制 1 L 含 0.1% Triton-X-100 的磷酸盐缓冲液（PBST），过滤除菌。该溶液可在室温（RT）下保存至少一年。
- 配制 600 µL 封闭缓冲液，其中含 10% 正常驴血清的 PBST。每次使用时新鲜配制。
- 在通风橱中配制以下甲醇（MeOH）稀释液各 50 mL：25% MeOH 的去离子水（dH2O）溶液、50% MeOH 的 dH2O 溶液和 75% MeOH 的 dH2O 溶液。涡旋混匀。室温保存。
- 在 50 mL 锥形管中配制以下苯甲醇-苯甲酸苄酯（BABB）溶液。
- 配制 100% BABB 时，将 32 mL 苯甲酸苄酯加入 16 mL 苯甲醇中（体积比 2:1）。
- 配制 50% BABB 时，将 16 mL 苯甲酸苄酯和 8 mL 苯甲醇加入 24 mL 甲醇中。
- 用铝箔包裹锥形管以避光。这些溶液可在室温下保存长达一年。
注意：BABB 具有毒性和腐蚀性，应按照材料安全数据表（MSDS）进行操作和处置。
2....
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结果
本文所展示的全胚胎免疫荧光染色方案可产生清晰且干净的结果，可用于咽弓血管内皮的三维重建，如图1A所示。每个抗体孵育步骤中，必须保证胚胎有足够的孵育时间，以确保抗体充分渗透至整个样本，同时在抗体孵育后需对胚胎进行彻底清洗。图1B中出现的大而明亮的点状信号，是由于抗体或封闭缓冲液中存在颗粒物所致。我们发现，在使用前对每种溶液进行离心处理，并在每次抗体孵育后延长PBST洗涤时间，可有效解决此问题。
图2展示了用于暴露咽弓及咽囊（PAA）以进行分析的操作流程，该流程在方案第7节中有详细描述。通过使用掩膜功能，Imaris软件可将已构建表面的区域在视觉上分离，并实现独立分析。
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讨论
以三维形式可视化小鼠胚胎中的内皮细胞，为研究其发育过程提供了新的见解3。本文介绍了一种可用于实现胚胎高分辨率三维成像、血管连接性可视化以及咽弓动脉（PAA）形成定量分析的实验方案。该方案可用于研究基因改变或环境损伤对PAA发育的影响。本方案中使用针对VEGFR2和ERG的抗体来观察PAA的形成并定量内皮细胞（EC）数量；然而，也可使用其他抗体来可视化和分析咽弓动脉发育的其他方面，例如神经嵴细胞的募集或平滑肌细胞的分化。如果将该方法应用于胚胎发生的较早阶段，需注意本方案中检测的一些抗原（如ERG）可能尚未表达。此时可使用其他细胞核染料（如DAPI或DRAQ5）或带有核标记的谱系示踪剂进行标记，以实现对EC数量的定量。
该方案中有几个关键步骤：必须确保 1）在更换溶液过程中胚胎不会干燥；2）抗体孵育后胚胎被充分洗涤；以及 3）在使用 BABB 进行组织透明化之前，胚胎已用甲醇（MeOH）完全脱水。
组织透明化前的甲醇洗涤具有两个目的：消除胚胎中因荧光蛋白（例如用于谱系示踪的EGFP或.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Brianna Alexander、Caolan O'Donnell和Michael Warkala对本文稿的仔细审阅与编辑。本研究工作得到了美国国立卫生研究院心肺血液研究所（National Heart, Lung and Blood Institute of the NIH）的资助，项目编号为R01 HL103920、R01 HL134935、R21 OD025323-01，资助对象为SA；AJR受到NHLBI HL103920-08S1以及国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所培训基金T32052283-11的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x 浸水物镜 | Nikon | MRD77200 | |
| 琼脂糖 | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 抗山羊抗体 | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 抗小鼠抗体 | Invitrogen | A-31570 | |
| 分析软件 | Imaris 9.2.0 | ||
| 苯甲醇 | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| 苯甲酸苄酯 | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| 盖玻片 | VWR | 16004-312 | |
| DAPI（5 mg/mL 储存液） | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf 管（2.0 mL） | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| 乙醇 | VWR | 89370-084 | |
| Falcon 管（50 mL） | Corning | 352098 | |
| 快速培养小室 | Grace Bio Labs | 664113 | |
| 镊子 | Roboz | RS-5015 | |
| 山羊抗 VEGFR2 抗体 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| 甲醇 | VWR | BDH1135-4LP | |
| 显微镜 | Nikon | A1HD25 | |
| 小鼠抗 ERG 抗体 | Abcam | ab214341 | |
| 正常驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| 培养皿（35 mm） | Genesee Scientific | 32-103 | |
| 培养皿（60 mm） | Genesee Scientific | 32-105 | |
| 塑料模具 | VWR | 18000-128 | |
| 解剖刀片 | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
参考文献
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart....
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重印与许可
