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方法文章

联合条件性敲低与改良的成球实验用于研究患者来源的胃癌干细胞中与干性相关基因的功能

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DOI：

10.3791/60799

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2020年5月9日

 ,  ,  , 
1Guangdong Key Laboratory of Genome Stability and Human Disease Prevention, Department of Pharmacology and Shenzhen University International Cancer Center, Shenzhen University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们介绍了一种利用条件性敲低系统和改良的成球形成实验来研究簇集素（clusterin）对患者来源的胃癌干细胞（GCSCs）干性影响的研究设计。该方案可轻松调整，用于研究不同类型肿瘤干细胞（CSCs）中与干性相关基因的体外和体内功能。

摘要

癌症干细胞（CSCs）与肿瘤的发生、发展以及治疗后的复发密切相关，近几十年来已成为众多研究关注的焦点。因此，开发研究关键基因在癌细胞干性中作用的方法显得尤为重要。胃癌（GC）是最常见且致死率最高的癌症类型之一。胃癌干细胞（GCSCs）被认为是导致胃癌复发、转移和耐药性的根源。深入理解GCSCs 的生物学特性，对于推动靶向治疗的发展并最终降低患者死亡率具有重要意义。在本实验方案中，我们介绍了一种利用条件性基因敲低系统和改良的成球实验来研究clusterin对患者来源的GCSCs干性影响的研究设计。该方案可轻松调整，用于研究不同类型癌症干细胞中与干性相关基因的体外和体内功能。

引言

胃癌（GC）是最常见且致死率最高的癌症类型之一1。尽管在胃癌治疗中，联合手术、化疗和放疗已取得进展，但预后仍然较差，五年生存率依然很低2。复发和转移是导致治疗后死亡的主要原因。

肿瘤干细胞（CSCs）是一类具有自我更新能力并能产生重建肿瘤所需不同细胞谱系的癌细胞亚群3。由于肿瘤干细胞具有自我更新能力、可播散并形成新肿瘤，且对传统化疗和放疗具有抗性，因此被认为是导致癌症复发和转移的主要原因4。因此，靶向并清除肿瘤干细胞为改善癌症治疗、降低患者死亡率提供了极具前景的策略。

已从多种实体瘤中分离出肿瘤干细胞（CSCs）5。2009年，Takaishi 等人首次描述了从人胃癌细胞系中分离出的胃癌干细胞（GCSCs）6。Chen 及其同事首次从人胃腺癌（GAC）肿瘤组织中鉴定并纯化了GCSCs7。这些发现不仅为研究GCSCs 的生物学特性提供了机会，也具有重要的临床意义。

CSCs 的一个特定特征是其形成球体的能力8。单个细胞在非黏附条件下以低密度接种，只有具备自我更新能力的细胞才能生长为称为球体的实心球形细胞簇。因此，球体形成实验被视为评估干细胞体外自我更新潜能的金标准实验，并被广泛应用。

RNA干扰（RNAi）是一种强大的研究工具，可通过沉默特定基因来研究基因功能9。然而，长期稳定的基因沉默技术存在某些局限性，例如难以研究对细胞存活至关重要的基因功能。条件性RNAi系统可通过施加诱导剂，以时间特异性和/或空间特异性的方式下调目标基因，从而克服这些限制。四环素（Tet）诱导系统是目前应用最广泛的条件性RNAi系统之一10。该系统通过添加外源性诱导剂（优先选用多西环素，Dox），调控shRNA的表达，从而诱导目标基因的沉默。Tet诱导系统可分为两种类型：Tet-On系统和Tet-Off系统。在诱导剂存在的情况下，shRNA的表达可被开启（Tet-On）或关闭（Tet-Off）。在无诱导剂的Tet-On系统中，组成型表达的四环素阻遏蛋白（TetR）会结合到含有Tet响应元件（TRE）序列的Tet响应型Pol III依赖性启动子上，从而抑制shRNA的表达；而当加入Dox后，TetR从Tet响应型Pol III依赖性启动子上解离，从而促进shRNA的表达，实现基因沉默。

本方案采用功能性四环素诱导型shRNA系统及改良的成球形成实验，用于研究簇集素（clusterin）在患者来源的胃癌干细胞（GCSCs）中的功能。既往研究11已鉴定簇集素为维持胃癌干细胞干性和存活的关键新分子。我们利用本方案研究簇集素对胃癌干细胞 自我更新的影响。该方法同样适用于其他类型的肿瘤干细胞研究。

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方案

本文所述使用患者来源的胃癌干细胞的所有实验均获得当地伦理委员会的批准7。

1. 胃癌干细胞培养

  1. GCSCs 完全培养基的制备
    1. 通过向新鲜的 DME/F12 培养基中添加以下必需成分来制备 GCSCs 完全培养基：20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1% 胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠、0.2% 葡萄糖、0.5% B27、1% Glutamax、1% 非必需氨基酸、10 µM 2-巯基乙醇、0.75 mg/mL NaHCO3、10 µM 巯基甘油、100 IU/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。使用 0.22 µm 滤器过滤并灭菌。
      注意：建议将 GCSCs 完全培养基在 4 °C 下保存，最好不超过两周。
  2. GCSCs 的复苏与培养
    注意：GCSCs 的获取方法如下：肿瘤样本经过机械和酶解离解后，通过尼龙网过滤分散良好的细胞悬液获得单细胞悬液。将所得癌细胞在 GCSCs 完全培养基中培养，部分细胞生长形成球体。这些球体再经酶解离解，并通过 CD44/CD54 标记物染色后的流式细胞分选获得 GCSCs。GCSCs 的详细方案及其功能检测已有报道7。
    1. 将 GCSCs 完全培养基预热至 37 °C，时间不超过 30 分钟。
    2. 从液氮中取出 GCSCs 冻存管，在 37 °C 水浴中快速解冻，持续轻轻摇动冻存管直至内容物完全融化。
      注意：应在 37 °C 水浴中快速解冻冻存细胞（<1 分钟）。
    3. 将冻存管中的全部内容物转移至含有 10 mL GCSCs 完全培养基的 15 mL 离心管中，在室温下以 800 x g 离心 5 分钟。
    4. 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 新鲜的 GCSCs 完全培养基中，接种至 100 mm 培养皿中。将培养皿置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育，并在第三天加入 5 mL 新鲜完全培养基。
  3. GCSCs 肿瘤球的传代培养
    注意：肿瘤球中心的 GCSCs 仅在球体直径增长至 80–100 µm 之前能获得足够的营养。一旦出现颜色变深、折光性降低的球体（约培养 6 天后），即需对肿瘤球进行传代。
    1. 轻轻摇动培养皿，将 GCSCs 肿瘤球培养基（包括培养基和非贴壁的肿瘤球）转移至无菌的 15 mL 离心管中。若培养基体积较大，可能需要使用更大规格的离心管。
    2. 以 600 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液。离心后可见淡黄色沉淀。
    3. 加入 2 mL 细胞解离液，在 37 °C 下进行机械和酶解离解。消化过程中每 2–3 分钟轻柔吹打 10 次，使球体分散成单细胞悬液。整个解离过程建议不超过 15 分钟。
      注意：应在显微镜下进行目视检查，确认无大球体或细胞团块残留。
    4. 加入 10 mL 预热的新鲜 GCSCs 完全培养基（体积为细胞解离液体积的 5 倍）以终止消化，并在室温下以 800 x g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，用 1 mL 预热的新鲜 GCSCs 完全培养基重悬细胞，将适量细胞接种至含 10 mL 预热新鲜 GCSCs 完全培养基的新 100 mm 培养皿中，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
    6. 在培养第 3 天补充 5 mL 预热的新鲜完全培养基。第 6 天时，当肿瘤球直径达到 80–100 µm 时进行传代。
  4. GCSCs 的冻存
    注意：不可直接向肿瘤球中添加冻存液进行 GCSCs 细胞的冻存。GCSCs 肿瘤球应先消化为单细胞，以确保细胞保护剂能够进入每个细胞，从而实现细胞的长期稳定保存。操作前需确认细胞状态良好且无污染。
    1. 收集 GCSCs 肿瘤球，在 600 x g 条件下离心 5 分钟。
    2. 弃去上清液，加入 2 mL 细胞解离液，在 37 °C 下解离 GCSCs 肿瘤球。加入 10 mL GCSCs 完全培养基以终止消化。
    3. 以 800 x g 离心 5 分钟，收集单个 GCSCs 细胞。
    4. 用无血清冻存液轻柔重悬 GCSCs 细胞，推荐终浓度为 5 x 105 - 5 x 106 个细胞/mL。
    5. 将细胞悬液以每管 1 mL 分装至标记好的冻存管中。
    6. 立即将含有细胞的冻存管放入异丙醇冻存盒中，并置于 -80 °C 保存。次日转移至液氮中进行长期储存。

2. 诱导型基因敲低胃癌干细胞系的建立 lines

警告：根据美国国立卫生研究院和疾病控制中心的规定，重组慢病毒被列为二级生物安全等级的生物体。由于这些慢病毒系统产生的病毒上清液可能含有潜在危险的重组病毒，因此涉及慢病毒的操作必须在生物安全二级（Biosafety Level 2）实验室内进行。

  1. 慢病毒颗粒的制备
    1. 根据表1的设计，从GeneChem公司合成两种携带可诱导shRNA靶向人clusterin的慢病毒载体，以及一种非靶向对照慢病毒载体（GV307）（GV307载体包含：TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-嘌呤霉素）。
    2. 将4 × 106个293T慢病毒包装细胞接种至直径100 mm的培养皿中，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。
    3. 将293T细胞在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。确保转染当天细胞密度达到约50–80%融合度。
    4. 将低血清培养基恢复至室温，并按照表2所述配制A管和B管。
    5. 将A管内容物转移至B管，充分混匀，在室温下孵育20分钟，以形成脂质-DNA复合物。
    6. 在加入脂质-DNA复合物前，移除5 mL培养基，保留总体积5 mL。
    7. 将5 mL脂质-DNA复合物逐滴加入培养皿中，轻轻摇晃培养皿以均匀分布复合物。
      注意：加液时应沿皿壁缓慢加入，避免扰动293T细胞。
    8. 将培养皿在37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。
    9. 转染后约24小时，小心移除转染培养基，轻柔更换为10 mL预热的含10% FBS的DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。
      注意：所有上清液及移液枪头在丢弃前均需用10%次氯酸钠处理。
    10. 转染后约48小时，收集10 mL含慢病毒的上清液。
      注意：所有细胞培养器皿及枪头在丢弃前均需用10%次氯酸钠处理。
    11. 使用0.45 µm孔径滤膜过滤慢病毒上清液，以去除细胞碎片。
      注意：所有滤膜和注射器在丢弃前均需用10%次氯酸钠处理。
    12. 将澄清后的上清液转移至无菌容器中，加入Lenti-X浓缩剂（体积为澄清上清液的1/3），通过轻柔颠倒混匀。
    13. 4 °C条件下孵育过夜。
    14. 在4 °C条件下以1,500 × g离心45分钟。离心后可见灰白色沉淀。小心移除上清液，注意不要扰动沉淀。
      注意：所有上清液及枪头在丢弃前均需用10%次氯酸钠处理。
    15. 将沉淀轻柔重悬于1 mL含10% FBS的DMEM培养基中作为病毒原液，储存于-80 °C。
  2. 稳定转染细胞系的建立
    1. 将6 × 106个GCSCs 接种至直径100 mm的培养皿中，加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养24小时（感染前细胞融合度达70–80%）。
    2. 吸除培养皿中的培养基，加入用4 mL含polybrene试剂（5 µg/mL）的完全DMEM培养基稀释后的浓缩慢病毒颗粒，于37 °C、5% CO2条件下孵育18小时。
      注意：polybrene的最佳浓度因细胞类型而异，可能需要通过不同浓度测试确定有效浓度；通常经验浓度范围为2–10 µg/mL。所有离心管和枪头在丢弃前均需用10%次氯酸钠处理。
    3. 更换培养基，加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。
      注意：所有培养基和枪头在丢弃前均需用10%次氯酸钠处理。
    4. 吸除含细胞碎片的上清液，更换为含嘌呤霉素（2.5 µg/mL）的新鲜DMEM培养基（含10% FBS），在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时；随后更换为含嘌呤霉素（5 µg/mL）的新鲜DMEM培养基（含10% FBS），继续在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
    5. 用5 mL不含钙镁离子的DPBS缓冲液清洗贴壁GCSCs 两次。
    6. 加入1 mL预热的细胞解离液解离GCSCs，在37 °C条件下孵育2–3分钟。
    7. 向细胞悬液中加入5 mL预热的新鲜GCSCs完全培养基。
    8. 将3 mL细胞悬液分装至15 mL离心管（A管）用于细胞冻存，另3 mL分装至另一15 mL离心管（B管）用于多西环素诱导。
    9. 将A管和B管在800 × g条件下离心5分钟。
    10. 用1 mL无血清冻存液重悬A管中的细胞沉淀，将冻存管置于-80 °C过夜，随后转移至液氮中长期保存。
    11. 吸除B管上清液，将细胞重悬于1 mL预热的新鲜GCSCs 完全培养基中。将适量细胞接种至新的100 mm培养皿中，加入10 mL含多西环素（Dox，2.5 µg/mL）的预热GCSCs 完全培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
      注意：不同细胞系对Dox的最适浓度可能不同，应通过不同浓度梯度测试确定其在基因敲低效率和细胞毒性之间的最佳浓度。
    12. 通过Western blotting验证GCSCs 中clusterin表达的稳定抑制效果。

3. 球体形成实验

  1. 解冻冻存的可诱导性基因敲低胃癌干细胞（GCSCs） 细胞系（参见步骤1.2）。
  2. 使用自动细胞计数仪测定10 µL样本中的活细胞密度。
  3. 用预热的GCSCs 完全培养基调整体积，使细胞浓度达到2 × 104 个活细胞/mL。
  4. 每组分别将细胞悬液分配至3个新的96孔超低吸附培养板中，每孔0.1 mL。
  5. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。肿瘤球通常在3–10天内形成，每隔2天观察并记录肿瘤球的形成情况。
    注意：不建议更换培养基，以免干扰肿瘤球的形成。所形成的肿瘤球应易于与单个细胞或细胞聚集体相区分。
  6. 通过图像分析软件评估所形成肿瘤球的大小，以确定肿瘤球形成结果。

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结果

从原发性人胃腺癌中分离的胃癌干细胞在无血清培养基中进行培养。培养6天后，细胞从单个细胞样表型（图1A）扩增形成较大的细胞球（图1B）。

为了评估簇集素（clusterin）在胃癌干细胞（GCSCs）中的功能，根据上述方案，将靶向簇集素的shRNA序列及乱序对照序列（scrambled）克隆至Tet-GV307-RFP-Puro载体中。构建稳定转染四环素调控的shRNA-簇集素表达载体的胃癌干细胞，并用多西环素处理48小时（图2）（以shRNA乱序序列作为对照）。通过蛋白质印迹法检测簇集素的表达水平，并随后采用密度测定法进行定量分析（图3）。

...

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讨论

胃癌是全球癌症相关死亡的第三大原因。胃癌干细胞（GCSCs）是 在胃癌复发、转移和耐药性中起关键作用。利用胃癌患者来源的胃癌干细胞（GCSCs）将有助于我们探索其薄弱环节，并开发靶向药物用于胃癌患者的治疗。

成球实验是一种用于体外检测肿瘤干细胞自我更新潜能的有效方法。结果可以表示为形成的球体数量占最初接种的单细胞数量的百分比。我们对原始方法进行了改进，通过计算在多个时间点所有细胞/球体的平均大小，以优化该实验的结果，并提高其在其他类型肿瘤干细胞中的可重复性。我们证实，该实验的结果高度依赖于初始接种的细胞数量。这是该实验的关键点，需保持初始细胞的分离状态，并准确计数球形克隆的数量（排除细胞聚集体）。此外，优化计数时间点也十分重要，以便清晰区分球体、细胞聚集体和单个细胞。

Tet诱导系统有助于研究那些对体外细胞存活至关重要的基因功能，例如本实验方案中的clusterin基因。该系统也可用于体内基因功能的探索，方法是将多西环素加入动物的饮水中。然而，Tet诱导系统在未诱导状态下常出现渗漏表达（leakiness）的问题

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到广东省自然科学基金（2018A030310586，2020A1515010989）、广东省医学科研基金（A2019405）、国家自然科学基金（81772957）、中国广东省科技计划项目（2017B030301016）以及深圳市工业和信息化基金（20180309100135860）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 滤膜MilliporeSLGP033RB
1-硫代甘油Sigma-AldrichM6145
2-巯基乙醇Gibco2068586
无动物成分重组人 EGFPeprotechAF-100-15
B-27 添加剂（50X），无血清Gibco17504044
Corning Costar 超低吸附多孔培养板Sigma-AldrichCLS3474
Countess 细胞计数板InvitrogenC10228
Countess II 全自动细胞计数仪InvitrogenAMQAX1000
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG6152
DMEM/F-12 培养基，含 HEPESGibco11330032
DMEM 培养基，高糖，含 GlutaMAX 和丙酮酸钠Gibco10569044
盐酸多西环素Sigma-AldrichD9891
不含钙、镁的 DPBSGibco14190250
胎牛血清，经鉴定，澳大利亚来源Gibco10099141
GlutaMAX 添加剂Gibco35050061
胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（ITS-G），100XGibco41400045
慢病毒载体GeneChemGV307
Lenti-X 浓缩试剂Takara631232
Lipofectamine 3000 转染试剂InvitrogenL3000015
MEM 非必需氨基酸溶液，100XGibco11140050
Millex-HV 注射器滤器，0.45 µm，PVDF 材质，33 mm，经伽马射线灭菌MilliporeSLHV033RB
Nalgene 通用长期储存冻存管Thermo Scientific5000-1020
Nunc 细胞培养皿/平皿Thermo Scientific171099
Opti-MEM I 低血清培养基Gibco31985070
青霉素-链霉素溶液，液体Gibco15140122
pHelper 1.0（gag/pol 组分）GeneChempHelper 1.0
pHelper 2.0（VSVG 组分）GeneChempHelper 2.0
聚凝胺Sigma-AldrichH9268
重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）Peprotech100-18B
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
STEM-CELLBANKER 冷冻保存培养基ZENOAQ11890
StemPro Accutase 细胞解离溶液GibcoA1110501
UltraPure 1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5Invitrogen15567027
ZEISS 倒置显微镜ZEISSAxio Vert.A1

参考文献

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