结合条件敲击和适应球形成测定研究患者衍生胃癌干细胞的干细胞相关基因

摘要

在该协议中，我们提出了一个实验设计，使用条件敲制系统和适应球形分析，以研究聚类对患者衍生GCSC的茎的影响。该协议可以很容易地适应研究在不同类型的CSC的茎相关基因的体外和体内功能。

摘要

癌症干细胞（CSCs）与肿瘤的启动、发育和治疗后复发有关，近几十年来已成为许多研究关注的焦点。因此，开发研究癌症细胞干细胞中关键基因作用的方法非常重要。胃癌 （GC） 是最常见的和最致命的癌症类型之一。胃癌干细胞（GCSCs）被认为是胃癌复发、转移和耐药性的根源。了解GCSC生物学是需要推动靶向疗法的发展，并最终降低患者的死亡率。在该协议中，我们提出了一个实验设计，使用条件敲制系统和适应球形分析，以研究聚类对患者衍生GCSC的茎的影响。该协议可以很容易地适应研究在不同类型的CSC的茎相关基因的体外和体内功能。

引言

胃癌（GC）是最常见的和最致命的癌症类型之^一1。尽管在GC治疗中联合手术、化疗和放疗方面取得了进步，但预后仍然很差，五年生存率仍然^很低。复发和转移是导致治疗后死亡的主要原因。

癌症干细胞（CSCs）是癌细胞的子集，具有自我更新和生成重建肿瘤3的不同细胞系^系的能力。CSC被认为是癌症复发和转移的原因，因为它们具有自我更新和播种新肿瘤的能力，以及他们对传统化疗和放射性治疗^{的抵抗力。}因此，针对CCS和消除CSC提供了改善癌症患者治疗和降低死亡率的令人兴奋的潜力。

CSC已被从多种类型的实体肿瘤^{中分离出5。}2009年，从人类胃癌细胞系分离出的胃癌干细胞（GCSC）最初由Takaishi等人^描述。陈和同事首先从人类胃腺癌（GAC）肿瘤组织⁷中鉴定并纯化了GCSC。这些发现不仅为研究GCSC生物学提供了机会，而且提供了重要的临床意义。

CSC的一个特别特点是它们形成球体^8的能力。单细胞在低密度的非固性条件下被镀，只有具有自更新的细胞才能成长为一个称为球体的固体球形聚类。因此，球体形成测定被认为是金本位测定，并广泛用于评估干细胞体外自我更新潜力。

RNA干扰（RNAi）是研究基因功能的一种强有力的研究工具，通过敲击一个特定的基因^9。然而，长期稳定的基因敲解技术有一定的局限性，如探索对细胞生存至关重要的基因的功能的挑战。有条件的RNAi系统可用于通过诱导剂的管理，以时间和/或特殊控制的方式降低所需基因的调节。四环素（Tet）可应用系统是使用最广泛的条件RNAi系统^10之一。Tet诱导系统可以通过在添加外源诱导剂（优待多氧环素，Dox）时控制shRNA的表达来诱导目标基因沉默。Tet-致失系统可分为两种类型:Tet-On 或 Tet-Off 系统。shRNA的表达可以在诱导器存在的情况下打开（Tet-On）或关闭（Tet-Off）。在没有诱导剂的 Tet-ON 系统中，构成表达的 Tet 抑制器 （TetR） 绑定到包含 Tet 响应 Pol III 依赖启动子的 Tet 响应元素 （TRE） 序列，从而抑制 shRNA 的表达。而加入 Dox 后，TetR 与 Tet 响应 Pol III 依赖的启动器隔离开来。这有利于 shRNA 的表达，并导致基因敲击。

这里描述的协议采用功能性四环素-可吸收的shRNA系统和一个适应球形形成测定来研究星团在患者衍生的GCSC中^的功能。我们使用所述协议来研究在GCSC自续订中聚类的影响。这种方法也适用于其他类型的癌症干细胞。

方案

所有使用患者衍生的胃癌干细胞的实验均得到当地伦理委员会^{7日的批准}。

1. 胃癌干细胞培养

1. 编写GCSC完整的培养媒介
   1. 通过添加具有以下基本成分的新鲜 DME/F12 培养基来准备 GCSC 完整的培养基:20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1% 胰岛素/转移素/钠精矿、0.2% 葡萄糖、 0.5% B27， 1% 谷氨酰胺， 1% 非必需氨基酸， 10 μM 2-甲醇， 0.75 毫克/mL NaHCO_3，10 μM 硫胺醇， 100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素.使用 0.22 μm 过滤器进行过滤和消毒。
      注:建议在4°C下储存GCSC完整培养基，最好储存不超过两周。
2. GCSC和文化的恢复
   注:GCSC获得如下:肿瘤样品受到机械和酶分离。单细胞悬浮液是通过用尼龙网从分散的悬浮液中过滤获得的。由此产生的癌细胞在GCSC完全培养中培养，一些细胞生长形成球体。然后，这些球体受到酶分离，通过细胞荧光学对沾满CD44/CD54标记的细胞组进行细胞荧光分类，可以获得GCSC。GCSC的详细协议和功能分析已经报告^7。
   1. 预热GCSC在37°C下完成培养基，不超过30分钟。
   2. 从液氮储存中解冻GCSC，并在37°C水浴中快速解冻冷冻液。继续旋转小瓶，直到整个内容完全融化。
      注:在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞（<1分钟）。
   3. 将冷冻器的全部内容转移到含有 10 mL GCSC 完整培养介质的 15 mL 离心管中。在 RT 时以 800 x g 的离心机 5 分钟。
   4. 小心吸上心，将细胞颗粒悬浮在10 mL的新鲜GCSC完整介质中。将电池悬浮液板在 100 mm 培养皿中。在 5% CO₂ 培养箱中以 37 °C 孵育板，并在第三天加入 5 mL 的新鲜完整介质。
3. GCSC肿瘤球的亚栽培
   注:肿瘤球中心的GCSC只有足够的营养，在球体大小增长至80-100μm直径之前。一旦黑暗和低折射球出现（约6天的培养），有必要亚培养肿瘤球。
   1. 轻轻摇动盘，将GCSC肿瘤球培养培养介质（培养和非粘附肿瘤球）转移到无菌的15 mL离心管中。对于较大的中等体积，可能需要更大的离心管。
   2. 在 600 x g 下 离心 5 分钟，并小心处理上一液。离心后，将可见白色颗粒。
   3. 加入2 mL的细胞分离溶液，在37°C下重新灌制颗粒，用于机械和酶分离。 在消化过程中，每2-3分钟轻轻上下移液10次，将球体分开，直到肿瘤球分散到单细胞悬浮液中。建议此完全分离过程小于 15 分钟。
      注:在显微镜下执行目视检查，确认没有大球体或细胞聚合。
   4. 加入 10 mL 的新鲜预热 GCSC 完整培养介质（细胞分离溶液体积的 5 倍），以在 RT 下以 800 x g 的 800 x g 离心 5 分钟。
   5. 丢弃上一级，用1 mL的新鲜预热GCSC完全培养的培养培养中重新暂停细胞。将适当数量的细胞播种到新的100毫米培养皿中，用10 mL的新鲜预热GCSC完成培养基，并在37°C下孵育，5%CO_2。
   6. 通过添加 5 mL 的新鲜预热完整介质，在 3 天后重新喂养肿瘤球培养。6天后，当肿瘤球生长到直径80-100μm时，通过细胞。
4. GCSC 的冷冻保存
   注:不要通过直接向肿瘤球添加介质来冷冻保留GCSC细胞。GCSC肿瘤球应消化成单细胞，使细胞保护剂可以进入每个细胞，以确保细胞的长期稳定储存。确保细胞健康，无污染。
   1. 收获GCSC肿瘤球。在 600 x g 下 离心 5 分钟。
   2. 丢弃上经剂，加入2 mL的细胞分离溶液，在37°C下分离GCSC肿瘤球。 通过添加10 mL的GCSC完整培养介质来终止消化过程。
   3. 以 800 x g 的离心机 5 分钟，收集单个 GCSC。
   4. 使用无血清低温保存介质轻轻悬浮GCSC。推荐的最终浓度为 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ 细胞/mL。
   5. 将细胞悬浮液在 1 mL 等分中分配到标记的低温小瓶中。
   6. 立即将含有细胞的冷冻细胞放在异丙醇腔室中，并将其储存在-80°C。 第二天将小瓶转移到液氮中，进行长期储存。

2. 生成可引诱击倒 GCSC 线

注意:重组性扁家病毒已被国家卫生研究所和疾病控制中心指定为二级生物。考虑到这些扁病毒系统产生的病毒超生剂可能含有潜在的危险重组病毒，涉及扁病毒的工作需要维护生物安全2级设施。

1. 扁病毒颗粒的生成
   1. 根据表1（GV307载体包含:TetIP-TurboRFP-MCS（MIR30）-Ubi-TetR-IRES-Puromycin）的设计，合成Table 12个含有针对人类聚类的可滴性 shRNA和非靶向控制性扁家病媒（GV307）。
   2. 种子 4 x 10⁶ 293T 扁豆病毒包装细胞成 100 毫米培养皿与 10 mL 的 DMEM 辅以 10% 胎儿牛血清。
   3. 在37°C下孵育293T细胞，5%CO_2.确保 293T 细胞密度在转染当天约 50-80% 汇合。
   4. 将降低的血清介质带到室温，并准备表2中描述的管A和管B。
   5. 将管 A 转移到管 B 中，混合好，并在室温下孵育复合物 20 分钟，以准备脂质 DNA 复合物。
   6. 在添加脂质-DNA 复合物之前，去除 5 mL 的介质，总共留下 5 mL。
   7. 将 5 mL 的脂质 DNA 复合物滴入培养皿中，轻轻旋转培养皿以分配复合物。
      注:小心地将液体放在菜壁上，以避免干扰 293T 细胞。
   8. 孵育培养皿在37°C下24小时，5%CO₂。
   9. 转染后24小时，小心地取出转染介质，轻轻更换10 mL预热DMEM，辅以10%FBS。在37°C下孵育24小时，5%CO_2.
      注:所有上一液和尖端应在处理前用10%漂白剂处理。
   10. 大约在转染后48小时，收获10 mL的含有扁病毒的超级纳。
       注:所有细胞培养容器和尖端应在处置前用10%漂白剂处理。
   11. 使用 0.45 μm 孔隙过滤器过滤扁病毒上清液，以清除细胞碎片。
       注:所有过滤器和注射器应在处置前用 10% 漂白剂处理。
   12. 将澄清的上清液转移到无菌容器中，加入Lenti-X浓缩器（1/3体积澄清的上清液）通过温和的反转混合。
   13. 在4°C下孵育混合物过夜。
   14. 在 4 °C 下以 1，500 x g 的离心机样品 45 分钟。 离心后，白色颗粒将可见。小心去除上一液，注意不要打扰颗粒。
       注:所有上一液和尖端应在处理前用10%漂白剂处理。
   15. 轻轻重新暂停在1 mL的DMEM颗粒，并辅以10%FBS作为病毒库存，储存在-80°C。
2. 稳定转染细胞系的生成
   1. 种子 6 x 10⁶ GCSC 放入 100 mm Petri 盘中，10 mL DMEM 辅以 10% FBS，在 37 °C 下 24 小时，5% CO_2（ 感染前 70-80% 汇合）。
   2. 吸气在培养皿中的介质，加入浓缩的扁病毒颗粒稀释与4 mL完整的DMEM介质含有多纤维素试剂（5μg/mL）到菜中。在37°C下孵育18小时，5%CO₂.
      注:多纤维素的最佳浓度取决于细胞类型，可能需要在不同的浓度中进行测试，以决定有效浓度。否则，它可能通过经验确定，通常在2-10μg/mL的范围内。所有管和尖端应在处理前用10%的漂白剂处理。
   3. 改变介质，用 10% FBS 介质代替 10 mL，在 37 °C 下孵育 24 小时，用 5% CO₂。
      注:所有介质和尖端应在处理前用 10% 漂白剂处理。
   4. 用细胞碎屑吸制上清液，用含有紫霉素的10%FBS介质补充，在37°C、5%CO2下孵育24小时。₂然后用含有紫霉素的10%FBS介质（5μg/mL）代替新鲜的DMEM，在37°C下孵育，5%的_CO2，额外24小时。
   5. 用 5 mL 的 DPBS 冲洗粘附 GCSC 两次，不带钙和镁。
   6. 用1 mL预热细胞分离溶液分离GCSC，在37°C下孵育2-3分钟。
   7. 向细胞悬浮液中加入5 mL的新鲜预热GCSC完整培养介质。
   8. 将 3 mL 分配到 15 mL 离心管（管 A）中，用于冷冻保存细胞，将其他 3 mL 分配到 15 mL 离心管（管 B）中，用于多氧环素诱导。
   9. 800 x g 的离心管 A 和管 B 5 分钟。
   10. 将管A的颗粒与1 mL的无血清低温保存介质重新吸收，将小瓶在一夜之间转移到-80°C，并将其取出至液氮储存中。
   11. 吸升液，在1mL新鲜预热GCSC完整的培养基中重新产生B管细胞。将适当数量的细胞播种到10 mL新鲜预热GCSCS的新的100毫米培养皿中，用多氧环素（Dox）（2.5μg/mL）完成培养基，并在37°C下孵育48小时，5%CO2。₂
       注:Dox 的最佳浓度可能因细胞系而异。每个细胞系应以不同的 Dox 浓度进行测试，以决定 KD 的有效浓度和细胞的毒性。
   12. 确认西方印迹对GCSC中聚类素的稳定抑制。

3. 球体形成测定

1. 解冻冻结的可抑制的敲击GCSC线（见步骤1.2）。
2. 使用自动细胞计数器确定 10 μL 样品的可行细胞密度。
3. 使用预热的GCSC完整培养介质调节体积，以获得2 x 10^4个 可行细胞/mL的浓度。
4. 每组分配 3 口新的 96 孔超低附着培养板井（0.1 mL/孔）。
5. 在37°C的培养箱中用5%的_{CO2孵育细胞}。球体形成应在3-10天内发生。每2天监测和记录肿瘤球形成的可视化。
   注:在肿瘤球形成受到任何干扰时，不建议更换介质。这些肿瘤球应该很容易区分与单个和聚合细胞。
6. 使用成像软件评估成形肿瘤球的大小，确定肿瘤球的形成结果。

结果

原发性人类胃腺癌的胃癌干细胞在无血清培养基中培养。6天后，细胞从单细胞样表型（图1A）扩展Figure 1形成大球体（图1B）。

为了评估GCSC中聚类的功能，按照上述协议，将针对聚类和炒波的srna序列克隆到Tet-GV307-RFP-Puro载体中。GCSC稳定地与四环素调节的 shRNA-聚类表达载体进行转染，然后用多氧环素处理 48 小时（图 2） （shRNA 炒为对照）。聚类的表达水平由西方印迹验证，随后通过密度测定进行量化（图3）。

讨论

GC 是全球癌症相关死亡的第三大原因。GCSC对胃癌复发、转移和耐药性至关重要。使用胃癌患者的GCSC将使我们能够探索他们的弱点，并开发治疗GC患者的靶向药物。

球体形成测定是研究癌症干细胞体外自我更新潜力的有用方法。结果可以呈现为形成的球体百分比除以种子的单个细胞的原始数量。我们采用原始方法计算多个时间点的所有细胞/球体的均值大小，以改善这种测定的结果，并促进其可重复性，为其他类型的癌症干细胞。我们证明，此测定的结果高度依赖于初始种子细胞的数量。这是这种测定的关键点，以维持初始细胞隔离，并准确测量球状菌落的数量（不包括细胞聚集）。此外，优化计数时间以明确区分球体和细胞聚合和单细胞也很重要。

Tet-可识别系统有助于研究对细胞在体外存活至关重要的基因的功能，就像本协议中的聚类一样。它们对于体内基因的功能探索也很有用;这可以通过在动物的饮用水中加入多氧环素来完成。然而，在未引出状态的泄漏是经常被报告的特-不致系统^12的问题。在所介绍的实验中，也观察到与shClu2一起低泄漏，如图 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 过滤器	Millipore	SLGP033RB
1-硫代甘油	Sigma-Aldrich	M6145
2-巯基乙醇	Gibco	2068586
无动物源重组人 EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 添加剂 （50X），无血清	Gibco	17504044
Corning Costar 超低附着度多孔板	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess 细胞计数室载玻片	Invitrogen	C10228
Countess II 自动细胞计数仪	Invitrogen	AMQAX1000
D-（+）-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12、HEPES	Gibco	11330032
DMEM、高葡萄糖、GlutaMAX、丙酮酸	Gibco
盐酸多西环素	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS，无钙、无镁	Gibco	14190250
胎牛血清，合格，澳大利亚	Gibco	10099141
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050061
、转铁蛋白、硒溶液 （ITS -G），100X	Gibco
慢病毒载体	GeneChem	GV307
Lenti-X 浓缩液	Takara	631232
Lipofectamine 3000 转染试剂	Invitrogen	L3000015
MEM 非必需氨基酸溶液，100X	Gibco	11140050
Millex-HV 针头过滤器装置，0.45 µm，PVDF，33 mm，γ 灭菌	Millipore	SLHV033RB
Nalgene 通用长期储存 低温管	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc 细胞培养/培养皿	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I 减血清培养基	Gibco	31985070
青霉素-链霉素、液体	Gibco	15140122
pHelper 1.0（gag/pol 组分）	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0（VSVG 组分）	GeneChem	pHelper 2.0
聚凝胺	Sigma-Aldrich	H9268
重组人 FGF-碱性	Peprotech	100-18B
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER 冻存培养基	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase 细胞解离溶液	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI 缓冲液，pH 7.5	Invitrogen	15567027
蔡司倒置显微镜	ZEISS	Axio Vert.A1