在微图形化细胞上进行溶酶体胞吐的活体成像，可实现对该过程的空间定量分析。利用微图形进行形态学标准化，是揭示细胞过程空间分布普遍规律的有力工具。
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摘要
摘要
通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对pHluorin标记的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（v-SNARE）囊泡相关膜蛋白7（VAMP7）进行活体成像，是研究溶酶体区室分泌过程的一种简便方法。利用细胞在微图案化表面上培养以标准化细胞形态，结合多种统计学工具对分泌模式进行空间分析。通过Ripley’s K函数及基于最近邻距离（NND）的统计检验，我们证实溶酶体的分泌并非随机过程，而是表现出显著的簇状分布。值得注意的是，我们的分析揭示胞吐事件不仅在非黏附区域也呈簇状聚集，表明黏附分子并非唯一能在质膜上诱导分泌热点的结构。然而，我们发现细胞黏附可增强这种簇状分布。除了具有明确定义的黏附与非黏附区域外，这些微图案的环形几何结构还允许使用极坐标，从而简化分析过程。我们采用核密度估计（KDE）以及对胞吐事件极坐标数据的累积分布函数，识别出胞吐事件富集的区域。在环形微图案细胞中，簇状分布主要发生在黏附区与非黏附区的交界处。本研究展示了如何利用统计学工具来探究多种生物过程的空间分布特征。
引言
胞吐作用是一种普遍存在的细胞过程，其中囊泡与质膜融合并释放其内容物。囊泡可以完全与质膜融合（全融合），也可以形成一个在有限时间内保持开放的融合孔道（“亲吻即走”模式）1。例如，新合成的蛋白质通过来自高尔基体复合物的囊泡释放到细胞外环境中。这种生物合成的顺向运输途径至关重要，尤其在多细胞生物中，用于分泌信号肽（如激素、神经递质）和细胞外基质成分（如胶原蛋白），以及将跨膜蛋白转运至质膜。此外，分泌还可来自不同类型的内体：1）回收内体，用于再利用跨膜蛋白；2）多泡体（MVBs），用于释放外泌体；3）溶酶体，用于释放蛋白水解酶。已有研究表明，内体分泌在神经突生长、伪足形成、质膜修复以及ATP依赖性信号传导中具有重要作用2。
为了在单细胞水平上研究胞吐作用，已采用多种技术。膜片钳技术能够在多种活细胞中以高时间分辨率检测单个胞吐事件3。然而，该方法无法提供胞吐事件发生位置的信息，也无法确定其来源于哪个细胞区室。电子显微镜可直接以高空间分辨率观察胞吐事件，结合免疫标记技术还能提供有关参与该过程的区室及分子特异性的信息。但该方法的缺点在于缺乏对过程动态变化的信息，且难以进行高通量研究。诸如全内反射荧光显微镜（TIRFM）等光学显微技术利用渐逝波照射盖玻片附近（约100 nm范围内）的荧光分子，可实现对胞吐事件的良好时间和空间分辨率观察。然而，该方法仅适用于贴壁细胞，且只能用于观察细胞的腹侧/下部区域。
值得注意的是，细胞膜的异质性显著，这种异质性源于仅存在于特定区域的黏附复合物。例如，这种异质性会限制不同配体的摄取4。类似地，最近有研究报道，高尔基体复合物的分泌活动集中在细胞膜上的“热点”区域5。此外，已知某些运输货物通过与黏着斑相关的胞吐作用进行分泌6。因此，应特别关注胞吐事件在空间上是随机分布，还是集中在细胞膜的特定区域这一问题。已有若干基于Ripley's K函数的统计工具被提出，用于探讨这些问题7,8,9。我们的方法将这些统计工具与微图形化技术相结合，以控制细胞形态和细胞膜的异质性。该技术不仅能够区分黏附与非黏附区域，还可实现不同细胞和条件之间的比较，并提高统计分析的效力。
本研究采用多种统计学工具，通过TIRFM活细胞成像技术监测环形微图案化的hTert-RPE1细胞中VAMP7-pHluorin在溶酶体区室的分泌事件，分析其空间分布特征。结果证实，溶酶体来源的分泌并非随机过程8,9，且分泌事件呈现簇状分布。值得注意的是，我们发现分泌事件在非黏附区域同样存在聚集现象，表明细胞膜上的分泌热点并非仅由黏附分子诱导形成。然而，细胞黏附确实增强了分泌事件的簇状分布。与此一致，我们的分析鉴定出分泌事件富集区域主要位于黏附区与非黏附区的交界处。
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方案
1. 微图形化细胞的制备
- 细胞转染
- 转染前一天，将 2.5 × 106 个 hTERT-RPE1 细胞接种至 12 孔板（2 × 2 cm）的一个孔中，加入 1 mL 培养基。
- 转染当天，用 VAMP7-pHluorin 质粒制备转染混合物（100 µL 缓冲液、0.8 µg DNA、3 µL 转染试剂），室温孵育 10 分钟。
注：VAMP7 是一种溶酶体 v-SNARE 蛋白，与腔内 pHluorin 标签融合。pHluorin 探针在低 pH 条件下荧光被淬灭，但在胞吐过程中质子释放，pH 升高，pHluorin 开始发出荧光信号10,11。 - 将转染混合物直接加入细胞培养基中。
- 转染混合物加入细胞后 4 小时更换培养基。
- 在转染后的 24–48 小时内进行实验。
- 微图案制备（光刻法）
- 用乙醇清洗盖玻片（直径 25 mm），室温干燥 5 分钟。
- 用深紫外光照射盖玻片 5 分钟以活化其表面。
- 通过将纸巾充分润湿并放置石蜡膜来构建一个湿润室。在纸巾上滴加 Poly-L-Lysine-graft-Polyethylene Glycol（PLL-g-PEG）溶液（0.1 mg/mL，10 mM HEPES，pH = 7.4），每片 22 mm 盖玻片加 30 μL。将活化后的盖玻片表面朝下置于液滴上，盖上湿润室盖子，孵育 1 小时。
- 用 PBS 洗涤盖玻片两次，再用去离子水洗涤一次，然后使其干燥。
- 用去离子水清洗石英光掩模，随后用乙醇或丙醇清洗，再用过滤后的气流吹干。
注：石英光掩模单面镀有抗反射铬层，其上具有微图案形状的孔洞。本实验方案使用直径为 37 µm 的环形微图案光掩模。当深紫外光照射时，光线仅能通过这些孔洞12。 - 将光掩模（镀铬面）暴露于深紫外光下 5 分钟，以清洁表面。
- 在光掩模的镀铬面滴加少量水滴（20 mm 盖玻片加 10 µL），将已处理 PLL-g-PEG 的盖玻片表面朝下贴附于水滴上，并吸除多余水分。确保光掩模与盖玻片之间无气泡产生。
注：水的毛细作用力可使盖玻片固定。 - 将带有盖玻片的光掩模翻转，使非镀铬面朝上（盖玻片附着于下方表面），再进行 5 分钟深紫外光照射。
注：光线仅能通过孔洞，从而修饰位于光掩模下方的盖玻片上 PLL-g-PEG 处理区域的表面。 - 通过加入过量水将盖玻片从光掩模上分离。
注：盖玻片应迅速浮起脱离。 - 将盖玻片置于湿润室中的石蜡膜上，加入细胞外基质蛋白溶液（50 μg/mL 纤连蛋白，5 μg/mL 荧光标记纤维蛋白原，溶于去离子水），在层流罩中孵育 1 小时，防止污染。
注：此时可暂停实验，将盖玻片保存于 4 °C 的 PBS 中。
- 在微图案化表面上接种细胞
- 使用与微图案化盖玻片尺寸匹配的磁性盖玻片支架固定盖玻片。在成像当天，将支架预热至 37 °C，以避免后续步骤中细胞受到热冲击。
- 通过在 DMEM/F12 培养基中添加 20 mM HEPES 和 2% 青霉素/链霉素，制备图案化培养基。
- 将盖玻片微图案面朝上放入支架中，一旦盖玻片置于支架底座上，立即加入图案化培养基。盖上密封圈，并用磁性装置固定。向支架中充满图案化培养基，最后盖上玻璃盖板。
注：操作应迅速，防止盖玻片干燥。实验之间切勿用乙醇清洗支架，因为密封圈可能残留乙醇，与 PLL-g-PEG 发生反应，导致细胞应激。支架仅可用肥皂水清洗。此外，可将连接处于 37 °C 的图案化培养基中孵育 1 小时，以稀释残留物质。 - 通过胰酶消化收集转染后的 hTERT-RPE1 细胞（每孔 12 孔板使用 0.5 mL 胰酶），加入 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基终止消化。
- 向盖玻片支架中加入 0.5 × 106 个转染后的 hTERT-RPE1 细胞，重新封闭支架，在培养箱中孵育 10 分钟。
- 用图案化培养基冲洗支架 5 次，以去除未贴壁细胞和残留的 FBS。使用一支移液器加入培养基，另一支移液器吸出液体，形成冲洗流。始终在支架中保留少量培养基，防止微图案化盖玻片上的细胞干燥，否则会导致细胞死亡。
- 在培养箱中继续孵育 3 小时，使细胞充分铺展。
2. 胞吐数据的采集
- 胞吐事件的成像
- 将盖玻片支架置于全内反射显微镜（TIRM）下。信号需由配备最佳可用成像格式的高灵敏度相机检测。
注意： 在本实验中，使用了100倍物镜和EMCCD相机，检测区域为512 × 512像素，对应像素大小为160 nm。 - 寻找表达VAMP7-pHluorin且完全铺展的细胞（图1A）。
注意：表达VAMP7的细胞可被清晰识别，因其呈现绿色信号。 - 调整激光角度，直至达到可观察VAMP7-pHluorin胞吐事件的全内反射荧光（TIRF）角度。使用显微镜软件以与胞吐速率和时间尺度相匹配的频率（通常为3 Hz，图1D）进行5分钟的图像采集。
注意：在微图案上，hTERT-RPE1细胞的溶酶体分泌速率约为0.3 Hz。溶酶体胞吐的典型持续时间为1秒，其特征为强度峰值后接指数衰减。此时探针的扩散应清晰可见（图1B、C）。 - 对每个细胞，还需使用显微镜软件采集微图案的图像（图1A）。
- 将盖玻片支架置于全内反射显微镜（TIRM）下。信号需由配备最佳可用成像格式的高灵敏度相机检测。
- 胞吐事件坐标的获取
- 使用ImageJ/FIJI打开采集的视频。选择文件 | 导入 | 图像序列。通过肉眼识别胞吐事件。胞吐事件的特征是出现向外扩散的明亮信号（图1）。
- 使用点工具标记胞吐事件的中心。选择分析 | 测量，测量X和Y坐标以及时间坐标（帧编号）。对视频中所有胞吐事件执行上述测量。
- 保存结果（结果 | 文件 | 另存为）。为每个分析的细胞准备一个名为“Results(细胞名称).txt”的文本文件，按顺序包含所有胞吐事件的帧编号、X坐标和Y坐标。
文本文件应如下所示：
ID X Y Feret's diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
注意：请务必用小数点替换所有逗号。 - 使用“椭圆工具”测量每个细胞的中心和直径。拟合一个完美的圆（不要使用椭圆），并使用“测量”功能获取X和Y坐标以及Feret直径。将每个细胞的标识（ID）、X和Y坐标、Feret直径和半径（直径/2）保存在一个名为“Spherical parameter.txt”的文本文件中。
文本文件应如下所示：
ID X Y Feret's diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
注意：请务必用小数点替换所有逗号。 - 使用直线工具测量微图案环的厚度（黏附长度），并将细胞ID、细胞半径（来自文件“Spherical parameter.txt”）和黏附长度保存在一个名为“Pattern parameter.txt”的文本文件中。通过将黏附长度除以细胞半径计算归一化的黏附长度。
注意：请务必用小数点替换所有逗号。
文件应如下所示：
ID Cell radius adhesion length Normalized adhesion length
RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826
3. 单细胞空间分析
- R 包及其安装
注意：本分析所用的 R 包利用 Spatstat 包13 来计算二维（2D）密度和 Ripley’s K 函数。该代码为开源，使用先前已描述的文本文件。- 从 https://www.r-project.org/ 下载并安装 R（本分析使用版本 3.5.2）。
- 从以下地址下载该软件包（及示例数据集）：https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- 在 R Studio 中使用“工具”菜单下的“安装包”功能进行安装。在“安装自：”类别中选择“包存档文件 (.zip; .tar.gz)”，然后选择软件包文件，点击“安装”。
- 在 R Studio 中输入命令“library("ExocytosisSpatialAnalysis")”并按“回车”以加载该软件包。
- 在 R Studio 中输入命令“ESA()”并按“回车”以运行该软件包。
注意：将打开一个用户界面。 - 选择数据集目录（.txt 文件）以及输出图像的目录。
注意：分析参数（见下文）可通过用户界面进行修改。 - 该脚本将自动启动并执行分析，生成对应图表的 .pdf 文件以及包含数值结果的 .txt 文件。
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结果
通过在hTert-RPE1细胞中利用VAMP7-pHluorin标记的溶酶体，分析了胞吐事件的时空特征10,11。hTert-RPE1细胞是一种非转化细胞，易于进行微图形化处理，并已在先前基于微图形的研究中被广泛使用4,14。VAMP7是一种溶酶体v-SNARE蛋白15，在其N端融合了超增强型pHluorin荧光蛋白，位于溶酶体腔内。在细胞内，由于溶酶体的低pH环境，pHluorin探针的荧光被淬灭；而在胞吐过程中，随着质子释放导致pH升高，pHluorin开始发出荧光信号。通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对环形微图形上的活细胞进行成像，监测VAMP7-pHluorin的动态变化（图1A–B）。pHluorin信号在胞吐过程中出现一个峰值，代表溶酶体质子的快速释...
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讨论
我们通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对环形微图案化细胞中VAMP7-pHluorin进行活细胞成像，监测了溶酶体区室的胞吐事件，并对胞吐事件的空间参数进行了严格的统计分析。利用转换后的Ripley’s K函数以及基于最近邻距离的统计检验，我们证实溶酶体分泌并非随机过程8,9。两种统计分析均有力地表明，胞吐事件呈现簇状分布（图2D和2G）。将类似分析工具应用于非黏附区域，我们发现胞吐事件在非黏附区域同样呈簇状聚集（图2E和2I）。因此，先前报道可介导簇状分布的黏附分子6并非唯一能在质膜上诱导分泌热点的结构。然而，细胞黏附增强了簇状聚集：在非黏附区域，胞吐事件之间的平均最近邻距离显著更大（图2H）。与此一致，我们基于核密度估计和累积分布函数的分析发现，在环形微图案化细胞中，胞吐富集...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们非常感谢 Thierry Galli（精神病学与神经科学中心，法国国家健康与医学研究院）提供 VAMP7-pHluorin 质粒。感谢 Tarn Duong 在统计分析方面的建议，以及 GOUD 实验室成员富有成效的讨论。作者衷心感谢细胞与组织成像平台（PICT-IBiSA @Burg、PICT-EM @Burg 和 PICT-IBiSA @Pasteur）以及居里研究所（巴黎）尼康影像中心，该中心是法国国家研究基础设施法国生物成像（ANR10-INBS-04）的成员。H.L. 的研究得到了法国癌症研究协会（ARC）的支持，P.M. 获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议编号 666003 的资助。本研究还获得了 INFECT-ERA（ANR-14-IFEC-0002-04）、Labex CelTisPhyBio（ANR-10-LBX-0038）和巴黎科学与文学大学 Idex（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）的资助，以及法国国家科学研究中心和居里研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Chamlide 磁力腔室 | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| 纤维蛋白原 | Molecular Probes，Invitrogen | F35200 | |
| 牛血浆纤维连接蛋白 | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1细胞系 | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | 作者：W. Rasband，美国国立卫生研究院/国家精神卫生研究所 |
| JetPRIME 转染试剂 | Polyplus | 114-07 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 光掩模 | Delta掩膜 | ||
| PLL-g-PEG 溶液 | 表面解决方案 | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R 软件 | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| 胰蛋白酶（TrypLE Express 1X） | Gibco | 12605-010 | |
| 紫外臭氧炉 | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin 质粒 | n/a | n/a | 论文参考文献：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008年12月5日;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. HRB 在网格蛋白依赖性内吞作用中的功能 Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T |
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