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利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体 关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

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DOI：

10.3791/60803

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2020年6月6日

 , 
1Cell Surface Signalling Laboratory, Wellcome Trust Sanger Institute, 2EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus

本文内容

摘要

本文描述了一种基于细胞的全基因组筛选方法，用于鉴定细胞外受体-配体相互作用。

摘要

膜结合型细胞表面受体之间的直接相互作用所介导的细胞间通讯，对于多细胞生物的正常发育和功能维持至关重要。然而，检测这些相互作用在技术上仍具有挑战性。本文描述了一种系统的全基因组规模CRISPR/Cas9基因敲除遗传筛选方法，可揭示特定细胞表面识别事件所必需的细胞通路。该检测方法利用在哺乳动物蛋白表达系统中产生的重组蛋白作为高亲和力结合探针，在基于细胞的遗传筛选中鉴定相互作用伙伴。该方法可用于鉴定由对应于膜结合受体胞外域的重组结合探针所检测到的细胞表面相互作用所必需的基因。重要的是，由于该方法具有全基因组规模的特性，其优势不仅在于能够鉴定直接的受体分子，还能发现受体在细胞表面正确表达所必需的其他细胞组分，从而为受体的生物学特性提供宝贵的见解。

引言

细胞表面受体蛋白介导的细胞外相互作用调控着组织构建、宿主-病原体识别以及免疫调节等重要的生物学过程。由于膜受体是单克隆抗体等系统性给药治疗手段的作用靶点，因此这类相互作用的研究受到生物医学领域的广泛关注。尽管膜受体具有重要意义，但对其相互作用的研究在技术上仍具挑战性。这主要是因为嵌入膜中的受体具有两亲性，难以从生物膜中分离出来进行生化操作，且其相互作用通常表现为较弱的结合亲和力（解离常数 KD 在 µM 至 mM 范围）1。因此，许多常用方法均不适用于检测此类蛋白质相互作用1,2。

已开发出多种方法，用于特异性研究细胞外受体-配体相互作用，这些方法充分考虑了其独特的生化特性3。其中一些方法涉及在哺乳动物或昆虫细胞表达系统中表达受体的完整胞外域，以可溶性重组蛋白的形式进行生产，从而确保这些蛋白含有结构上重要的翻译后修饰，例如糖链和二硫键。为克服低亲和力结合的问题，通常将胞外域进行寡聚化，以增强其结合的协同性（avidity）。已成功将具有协同结合能力的蛋白胞外域用作结合探针，在直接的重组蛋白-蛋白相互作用筛选中鉴定相互作用伙伴4,5,6,7。尽管这类方法总体上取得了广泛成功，但基于重组蛋白的技术要求膜受体的胞外域能够以可溶性蛋白形式表达。因此，该方法通常仅适用于含有连续胞外区域的蛋白（例如单次跨膜I型、II型或GPI锚定型蛋白），而不适用于多次跨膜的受体复合物或多跨膜结构的膜蛋白。

通过将互补DNA（cDNA）文库转染细胞并检测其是否获得结合表型的表达克隆技术，也已被用于鉴定细胞外蛋白质-蛋白质相互作用8。近年来，大量已克隆并测序的cDNA表达质粒的可获取性，促进了相关方法的发展，即通过筛选高表达编码细胞表面受体cDNA的细胞系，检测其与重组蛋白的结合，从而识别相互作用9,10。与基于重组蛋白的方法不同，基于cDNA过表达的方法能够在质膜环境中鉴定相互作用。然而，使用cDNA表达载体的成功与否，取决于细胞能否以正确折叠的形式过表达目标蛋白，而这一过程通常需要转运蛋白、分子伴侣以及正确的寡聚组装等细胞辅助因子。因此，仅转染单个cDNA可能不足以实现蛋白在细胞表面的有效表达。

使用cDNA构建体或重组蛋白探针的筛选技术资源消耗较大，且需要大量的cDNA或重组蛋白文库。近年来，已采用一些专门设计的基于质谱的方法来鉴定细胞外相互作用，这些方法无需构建大规模文库。然而，这些技术需要对细胞表面进行化学修饰，可能改变细胞表面分子的生化特性，且目前仅适用于由糖基化蛋白介导的相互作用11,12。目前大多数可用的方法主要集中于蛋白质之间的相互作用，而很大程度上忽略了膜微环境（包括聚糖、脂质和胆固醇等分子）的贡献。

近年来，基于CRISPR的高效双等位基因靶向技术的发展，使得能够在单一细胞池中构建基因组规模的细胞文库，这些细胞缺失特定的基因，从而可以系统性且无偏倚地筛选参与不同生物学过程的细胞组分，包括解析细胞信号通路、鉴定赋予药物、毒素和病原体抗性的扰动因素，以及确定抗体的特异性13,14,15,16。本文描述了一种基于CRISPR的基因组规模基因敲除细胞筛选实验方法，该方法为当前生化手段鉴定细胞外受体-配体相互作用提供了替代方案。这种通过遗传筛选鉴定由膜受体介导的相互作用的方法，特别适用于对特定配体有聚焦研究兴趣的研究人员，因为它避免了构建大规模cDNA文库或重组蛋白库的需要。

该实验包含三个主要步骤：1）制备由目的受体胞外区组成的高亲和力重组蛋白结合探针，并将其用于基于荧光的流式细胞术结合实验；2）通过结合实验鉴定出表达该重组蛋白探针相互作用伴侣的细胞系；3）构建可表达Cas9的、与目的蛋白发生相互作用的细胞系，并进行全基因组规模的CRISPR/Cas9介导的基因敲除筛选（图1）。在此遗传筛选中，重组蛋白与细胞系的结合能力作为可测量的表型指标，利用基于荧光的活化细胞分选技术（FACS）对失去与探针结合能力的敲除文库中的细胞进行分选，再通过测序鉴定导致结合表型丧失的相关基因。原则上，该方法可鉴定出编码高亲和力探针结合受体的基因，以及参与其在细胞表面表达所需的其他基因。

本方案的第一步是制备代表膜结合受体胞外域的高亲和力重组蛋白探针。已知这些受体在将其胞外域表达为可溶性重组蛋白时，通常仍能保持其细胞外结合功能。1对于目标蛋白，只要能够进行寡聚化以增强结合亲和力，并含有可用于基于荧光的流式细胞术结合实验的标签（例如 FLAG 标签、生物素标签），即可在任何合适的真核蛋白表达系统中以任意形式表达可溶性重组蛋白。此前已有文献详细描述了利用 HEK293 蛋白表达系统生产膜受体可溶性胞外域的方法，以及不同的多聚化技术，还包括用于生产五聚体蛋白和单体蛋白的蛋白表达载体。1,17本方案将介绍通过将单体生物素化蛋白与荧光染料偶联的链霉亲和素（如藻红蛋白，PE）结合，制备荧光亲和探针的步骤。该探针可直接用于基于细胞的结合实验，其优势在于无需使用二抗进行检测。全基因组规模筛选的一般性实验方案已有描述。20,21因此，该方案主要聚焦于利用人类V1文库的CRISPR/Cas9基因敲除筛选系统，开展基于流式细胞术的重组蛋白结合筛选的具体操作步骤。"Yusa"）文库18.

方案

1. 生物素化His标签蛋白的制备与纯化

  1. 使用哺乳动物或昆虫细胞表达系统生产可溶性重组 His 标签生物素化蛋白（参见 表1 中的质粒构建体）。
    注意：Kerr 等人17已详细描述了利用 HEK293 细胞表达系统制备单体生物素化及 His 标签蛋白的方案。使用 HEK293 表达系统表达的蛋白胞外结构域会分泌至培养基中。
  2. 通过离心（3,000 × g，20 分钟）沉淀细胞，收集上清中的可溶性蛋白。
  3. 将上清液经 0.22 µm 滤膜过滤，按 1:1,000 的比例（即 50 µL 50% 琼脂糖悬液加入 50 mL 上清液）将 Ni2+-NTA 琼脂糖珠加入滤过的蛋白上清液中。在 4 °C 条件下于旋转平台上孵育过夜或至少 4–5 小时。
  4. 加入 5 mL His 纯化洗涤缓冲液清洗聚丙烯柱。所有缓冲液的组成参见 表2。
  5. 将全部珠-蛋白上清液混合物倒入柱中。珠子将积聚于柱底。
  6. 用 15 mL 洗涤缓冲液洗涤珠子 2 次。为避免蛋白稀释，使用 5 mL 注射器小心吸出柱中残留的洗涤液并弃去。
  7. 向珠子中直接小心加入 300–500 µL His 纯化洗脱缓冲液，孵育至少 1 小时。使用 1 mL 注射器小心吸取液体，收集洗脱的蛋白。通过脱盐柱将洗脱缓冲液置换为所需缓冲液（如通常使用的 PBS 或 HBS）。所有蛋白在 4 °C 下保存，直至后续使用。

2. 单体生物素标记蛋白的定量与寡聚化

注意：为了增强结合亲和力，在将生物素化单体蛋白用于结合实验前，应先将其在四聚体链霉亲和素-PE（streptavidin-PE）上进行寡聚化。通过测试一系列稀释浓度的生物素化单体与固定浓度的链霉亲和素反应，并通过实验确定无法检测到过量生物素化单体的最低稀释度，从而确定单体蛋白与四聚体链霉亲和素-PE之间的最佳偶联比例。

  1. 在96孔板中使用适当的稀释缓冲液（含1%牛血清白蛋白[BSA]的PBS或HBS）对生物素标记的蛋白样品进行至少八次连续稀释。确保每次稀释的终体积至少为200 µL。
  2. 从每孔中取出100 µL样品转移至新的96孔板，制备样品的复孔板。每次实验均需设置对照，本实验中的对照为仅带标签的蛋白（即生物素标记的His标签Cd4结构域3+4蛋白）。该对照将用于所有结合实验中的探针对照。
  3. 用稀释缓冲液将链霉亲和素-PE（streptavidin-PE）稀释至0.1 µg/mL。
  4. 仅在其中一个96孔板中加入100 µL稀释后的链霉亲和素-PE。另一复孔板作为对照板，需加入100 µL稀释缓冲液以平衡体积。
  5. 室温（RT）孵育20分钟。在此期间，用稀释缓冲液封闭链霉亲和素包被板的孔，封闭时间为15分钟。
  6. 将两个板中各样品的全部体积分别转移至链霉亲和素包被板的各个孔中，室温孵育1小时。
  7. 用洗涤缓冲液（含0.1% Tween-20和2% BSA的PBS或HBS）洗板3次，每次200 µL。每孔加入100 µL浓度为2 µg/mL的小鼠抗大鼠Cd4d3+4 IgG（OX68），室温孵育1小时。
  8. 用洗涤缓冲液洗板3次，每孔加入100 µL浓度为0.2 µg/mL的抗小鼠碱性磷酸酶偶联物，室温孵育1小时。
  9. 用洗涤缓冲液洗板3次，再用稀释缓冲液洗1次。
  10. 用二乙醇胺缓冲液配制1 mg/mL的对硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate）溶液，每孔加入100 µL，孵育15分钟。
  11. 在405 nm处测定吸光度。以无信号出现的最低稀释度作为合适的稀释倍数，用于制备四聚体（图2）。
  12. 将4 µg/mL链霉亲和素-PE与相应稀释倍数的生物素化蛋白在室温下孵育30分钟，制备所有样品及对照的10倍四聚体染色溶液。将偶联后的蛋白置于避光管中，4 °C保存，待后续使用。

3. 基于流式细胞术的细胞结合实验

  1. 对于贴壁细胞，移除培养基并用不含二价阳离子的 PBS 洗涤 1 次。然后加入细胞解离溶液（例如 EDTA），孵育 5–10 分钟使细胞脱落。轻轻敲击培养瓶以释放细胞。
    注意：避免使用基于胰蛋白酶的产品，因其可能切割细胞表面蛋白。
  2. 将解离的细胞收集至离心管中。对于悬浮生长的细胞（例如 HEK293 细胞），直接从培养瓶中将细胞收集至离心管中。
  3. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟以沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于洗涤缓冲液（即 PBS/1% BSA）中。
  4. 使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至 2.5 × 105–1 × 106 个细胞/mL。取 100 µL 细胞悬液分装至 96 孔 U 型或 V 型底板中。在 400 × g 条件下离心 5 分钟。使用多通道移液器移除上清液。
  5. 向先前准备好的含细胞的孔板中加入 100 µL 经标准化的荧光标记高亲和力蛋白探针及对照，于 4 °C 孵育 1 小时。结合反应 1 小时后，在 400 × g 条件下离心 5 分钟。
  6. 移除上清液，加入 200 µL 洗涤缓冲液（即 PBS/1% BSA）。通过上下吹打充分混匀。
  7. 在 400 × g 条件下离心 5 分钟以沉淀细胞。重复洗涤步骤 1 次。经过两次洗涤后，彻底移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 100 µL PBS 中。
  8. 通过流式细胞术分析细胞。使用黄绿色激光（即 561 nm）检测 PE 荧光。
    1. 首先分析经对照探针染色的细胞。根据 PE 荧光的分布情况，设定结合细胞群的门控，确保不超过 1% 的对照细胞落入该门内。
    2. 分析待测样本，确定落入结合门内的细胞比例。
      注意：用于遗传筛选的细胞系应具有较高的结合细胞群比例，因其信噪比较高。理想情况下，应有超过 80% 的细胞落入该门内。

4. 确定热不稳定表位和硫酸乙酰肝素侧链的结合贡献

注意：许多蛋白质的活性对热敏感，因此热处理后结合活性的降低是正常现象。建议确定带负电荷的糖胺聚糖（主要为硫酸乙酰肝素，HS）在介导重组蛋白结合中的作用。这是因为本实验中所述的细胞结合实验中，HS 的结合可能与其他受体的结合呈叠加效应，而非相互依赖19。这意味着所观察到的结合可能完全由细胞表面蛋白聚糖的 HS 侧链介导，而非由特异性受体介导。蛋白质与细胞表面 HS 的结合并不一定是非特异性的，而可能是该蛋白质本身的一种特性，在进行完整的遗传筛选之前了解这一点非常必要。

  1. 准备经热处理的蛋白质样品，用于结合实验。
    1. 将已标准化但未偶联的单体蛋白质在 80 °C 下加热 10 分钟。
    2. 将热处理后的蛋白质偶联至链霉亲和素-PE，偶联比例假设与其未经处理的对应物相同，该比例由 ELISA 测定（参见第 2 节）。
  2. 准备肝素封闭的蛋白质样品。
    1. 用 PBS 配制 8 个 1:3 稀释度的可溶性肝素溶液，起始浓度为 2 mg/mL，终体积为 100 µL。
    2. 将 100 µL 已制备的结合探针与肝素稀释液孵育至少 30 分钟。
  3. 在第 3 节所述的结合实验中，使用热处理的蛋白质以及全部 200 µL 肝素/蛋白质混合物。代表性结果见图 3A,B。

5. 筛选稳定表达 Cas9 的细胞系

注意：在将结合目标探针的细胞系用于CRISPR筛选之前，必须首先对其进行改造以表达Cas9核酸酶，并筛选出具有高活性的克隆19。

  1. 使用以下通用慢病毒生产方案，结合用于 Cas9 表达的慢病毒载体来生产慢病毒（参见表 1）。
    1. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下，将 HEK293-FT 细胞培养于 DMEM/10% FBS 培养基中。转染前 1 天接种 HEK293-FT 细胞，使其在转染当天融合度约为 80%。
      注：HEK293FT 细胞贴壁较松散；因此，在用于慢病毒生产时，建议将其接种于涂有 0.1%（w/v）明胶的培养瓶中，以增强贴壁性。
    2. 在早晨进行转染。将转移载体、包装混合物和转染试剂加入预热的适用于转染的培养基中（例如 Opti-MEM）。通过反复倒置试管 10–15 次混匀。室温孵育 5 分钟。具体体积参见表 3。
    3. 按照生产商建议加入转染试剂。快速涡旋混匀。室温孵育 30 分钟。
    4. 小心吸除弃去的培养基。向培养板中加入适用于转染的培养基。
    5. 将转染试剂/DNA 复合物逐滴加至培养板侧壁，并通过极轻柔地晃动培养板使其缓慢均匀分布。
    6. 在 37 °C 孵育 3–5 小时，然后更换为 D10 培养基。继续孵育过夜。
    7. 次日早晨，更换为新鲜 D10 培养基。继续孵育过夜。
    8. 次日下午晚些时候，收集病毒上清液。使用蛋白结合率低的 0.45 µm 滤器过滤。可选步骤：加入新鲜 D10 培养基，孵育过夜，并于次日再次收集上清液。
    9. 病毒上清液在 4 °C 下仅可稳定保存数天。长期保存应置于 -80 °C。
      注：为制备高浓度慢病毒制剂（在转导较难感染的细胞时可能需要），可将上清液在 4 °C 下以 6,000 x g 离心过夜进行浓缩。用耐乙醇笔标记透明的病毒沉淀，弃去上清液。将沉淀重悬于原体积 1/100 的溶液中，即可实现 100 倍浓度提升。
  2. 用慢病毒感染细胞。
    1. 在 6 孔板中，每孔接种 1 × 106 个细胞，加入 3 mL 合适的培养基。不同细胞的转导效率存在差异。对于易于转导的细胞（例如 HEK 细胞），可直接将慢病毒加入细胞中；对于难以转导的细胞，则可能需要按照以下描述进行离心增强转导（spinoculation）操作。
      1. 取 2 mL 浓度为 2–5 × 106 个细胞/mL 的细胞悬液，分装至 15 mL 圆锥形离心管中。
      2. 加入慢病毒及 8 µg/mL 的六亚甲基溴化铵（hexadimethrine bromide），室温孵育 30 分钟。
      3. 在 32 °C 下以 800 x g 离心 100 分钟。随后将细胞重悬于原有培养基中，并将细胞悬液转移至含有合适培养基的适当培养瓶中。
    2. 让转导过程持续至少 24 小时。之后移除含病毒的培养基，并更换为新鲜培养基。
    3. 再过 24 小时后，更换为添加了适当抗生素的培养基。Cas9 载体中含有杀稻瘟菌素抗性表达盒，可用于筛选。
      注：杀稻瘟菌素的最佳浓度需通过剂量-反应杀灭曲线实验针对每种细胞系进行优化。在大多数未转导细胞系中，使用 2.5–50 µg/mL 的杀稻瘟菌素浓度，通常可在转导后 10 天内将其完全清除。
  3. 持续进行筛选，直至对照组培养板中的所有细胞（即接受相同浓度筛选抗生素处理但未转导的细胞）均被杀死为止。

6. 筛选高 Cas9 活性克隆

注意：多克隆 Cas9 可用于成功进行基因筛选；然而，选择具有高 Cas9 活性的克隆可改善筛选结果18。

  1. 采用有限稀释法或单细胞分选，将抗杀稻瘟菌素（blasticidin）的单个细胞分选至三个96孔板的培养孔中，每孔培养基均添加杀稻瘟菌素。克隆将在2–4周内开始出现。挑选10–20个克隆，并在6孔板中扩大培养。
  2. 利用快速检测的GFP-BFP（绿色荧光蛋白-蓝色荧光蛋白）系统检测各克隆的Cas9活性，该系统采用一种外源基因敲除系统，其中细胞被转导表达GFP并携带靶向GFP的gRNA的载体，或转导空gRNA载体作为对照18。
    1. 订购报告基因质粒：GFP-BFP质粒、Control-BFP质粒（表1）。
    2. 根据第5.1节所述慢病毒生产方案，分别为GFP-BFP质粒和Control-BFP质粒制备慢病毒。
    3. 分别用编码GFP-BFP系统和Control-BFP的慢病毒转导每个表达Cas9的细胞系克隆。操作步骤参照第5.2节。
    4. 转导3天后，使用流式细胞术检测每个克隆的GFP-BFP荧光信号。分别使用488 nm激光和405 nm激光检测GFP和BFP。
    5. 通过分析仅表达BFP的细胞与同时表达GFP和BFP的双阳性细胞的比例，定量各克隆中的Cas9活性。高活性Cas9细胞的理想GFP敲除效率应达到>95%（图4）。

7. 全基因组CRISPR-Cas9筛选敲除文库的构建

  1. 使用人类V1文库进行全基因组筛选时18，订购全基因组文库（参见表1），并根据制造商手册中“"文库扩增方案"”提供的步骤，从细菌保种中制备质粒文库。
  2. 利用上述全基因组文库质粒制备物，按照第5.1节所述的慢病毒生产方案，生成编码gRNA的慢病毒文库，用于靶向破坏人类基因。
    注意：建议制备一批经过优化的慢病毒制剂，以提高转导效率，从而增强实验的一致性。
  3. 采用第5.2节中的转导方案进行小规模测试转导，以确定每种细胞系达到30%转导效率所需的病毒量。通过流式细胞术检测BFP荧光信号，作为评估转导效率的指标。
  4. 转导HEK293细胞时，只需将预确定量的慢病毒制剂加入培养于常规生长培养基中的30–50 × 106细胞中，孵育约4小时，随后移除含慢病毒的培养基，并更换为新鲜生长培养基。
  5. 对于其他细胞系，采用第5.2.1节中的离心转导（spinoculation）方案，但需扩大规模，使总共转导30–50 × 106个细胞。具体操作为：将浓度为5 × 106细胞/mL的细胞悬液每份2 mL分装至15 mL锥形管中，按说明进行后续操作。
  6. 对于贴壁细胞系，在转导后24小时加入嘌呤霉素以筛选转导细胞。
    注意：应通过剂量-反应杀灭曲线优化嘌呤霉素浓度。通常1–10 µg/mL的浓度可在3–5天内杀死未转导细胞。避免使用过高浓度的嘌呤霉素，因其可能增加筛选到被多个单导向RNA（sgRNA）转导细胞的风险。
  7. 对于悬浮细胞，在转导后第3天使用细胞分选仪收集转导成功（即BFP阳性）的细胞，并构建包含至少10 × 106个细胞的文库。在基于BFP完成筛选后，将细胞培养于补充适量嘌呤霉素的培养基中。
    注意：避免仅使用嘌呤霉素对悬浮细胞系进行筛选，因为在悬浮培养体系中难以清除死亡细胞和碎片，可能干扰后续的细胞分选过程。
  8. 转导后，将突变文库细胞连续培养9–16天，每隔2–3天常规传代一次。

8. 细胞表面结合的遗传筛选

  1. 在200 × g 条件下离心5分钟，沉淀突变细胞文库，并用PBS重悬细胞。
  2. 将细胞分装至两个15 mL圆锥形试管中，每管至少含有50 × 106个细胞。
  3. 将其中一管在200 × g 条件下离心5分钟，弃上清，并将细胞沉淀在-20 °C下冷冻保存。此为对照群体，后续再进行处理。
  4. 将另一管中的细胞沉淀用10 mL PBS/1% BSA重悬。取100 µL细胞作为阴性对照，加入96孔板中备用。
  5. 向圆锥形试管中的细胞悬液中加入适当的预偶联重组蛋白，同时向96孔板中的阴性对照孔加入相应的阴性对照蛋白。
  6. 在室温下，将细胞置于旋转仪（6 rpm）上，于4 °C避光孵育至少1小时，进行染色。
  7. 在200 × g 条件下离心5分钟沉淀细胞，弃上清。进行两次洗涤步骤后，将细胞重悬于5 mL PBS中。
  8. 通过30 µm细胞滤网过滤细胞，以去除细胞团块。使用流式分选仪进行分析。
  9. 利用阴性对照样本设门，筛选BFP+/PE-细胞。
  10. 对样本进行分选，收集BFP+/PE-细胞。分选门的设定取决于细胞与蛋白的结合情况，通常收集PE阴性样本中1–5%的细胞。分选门示例见补充图1。
  11. 从选定的门中收集500,000–1,000,000个细胞。鉴于细胞数量较少，建议将样本收集至1.5 mL离心管中，以减少损失。
  12. 将分选后的细胞在500 × g 条件下离心5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清并弃去。细胞沉淀可在-20 °C下保存长达6个月。

9. 基因组DNA提取及用于gRNA富集的首轮PCR

  1. 从高复杂度的对照群体中提取基因组DNA。
    1. 如果对照群体在-20 °C下冷冻保存，取出锥形管并加入PBS，置于冰上以融化沉淀物。
    2. 使用商业试剂盒（参见材料表），按照制造商的说明从50 × 106个细胞中提取基因组DNA。将DNA浓度调整至1 mg/mL。
    3. 针对每个样本，配制对应于72 µg DNA的PCR主混合液。将50 µL分装至96孔PCR板的36个孔中。所需引物序列列于表4。请参考表5和表6中的指南。
    4. 取6–12个代表性样本的5 µL PCR产物，在2%（w/v）琼脂糖凝胶上进行电泳分析。应观察到一条约250 bp的清晰单一条带。若条带较弱，可额外增加2–3个PCR循环后重复扩增。
    5. 使用多通道移液器从每孔收集5 µL PCR产物（共180 µL），合并至一个储液槽中，并加入900 µL商业试剂盒提供的结合缓冲液（参见材料表）。
    6. 使用商业PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。将DNA洗脱至50 µL洗脱缓冲液中（来自商业试剂盒，参见材料表），并测定DNA浓度。
  2. 对于已分选为失去结合表型的样本，其组成不太可能包含大量独立克隆。因此，无需使用72 µg DNA进行PCR。使用合适的商业试剂盒（参见材料表）提取DNA。按照前述方案（第9.1.3节）设置3–4个PCR反应，使用浓度为100 ng/µL的DNA。若分选后的细胞数量少于100,000个，则使用细胞裂解液代替基因组DNA制备物。
    1. 将约10,000个细胞/孔分装至96孔PCR板中。
    2. 在板中离心沉淀细胞，并小心移除大部分上清液。沉淀物可能不可见。
    3. 向每孔加入25 µL水，并在95 °C下加热10分钟。
    4. 向每孔加入5 µL新鲜稀释的2 mg/mL蛋白酶K，56 °C孵育1小时。随后在95 °C加热10分钟以灭活蛋白酶K。
    5. 每个PCR反应使用10 µL细胞裂解液混合物。裂解液应在24小时内使用完毕。

10. 用于索引加标签和测序的第二轮 PCR

  1. 将第一轮 PCR 的产物稀释至 40 pg/µL。
  2. 每个样本设置一个 PCR 反应（参考 表 7 和 表 8 中提供的指南）。使用高保真聚合酶至关重要，以尽量减少聚合酶在 sgRNA 扩增过程中引入的错误。
  3. 取 5 µL PCR 产物在 2%（w/v）琼脂糖凝胶上进行电泳。应观察到一条清晰的约 330 bp 的条带。
  4. 使用磁性磁珠纯化 PCR 产物：向 PCR 产物中加入 31.5 µL（总体积的 0.7 倍）重悬的磁珠，充分混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
  5. 将离心管置于磁力架上静置 3 分钟。磁珠应吸附在管壁一侧，溶液应变得澄清。小心移除并弃去上清液。
  6. 向管中加入 150 µL 新鲜配制的 80% 乙醇。孵育 30 秒后，小心移除并弃去上清液。
  7. 重复步骤 13.6，此次使用 180 µL 乙醇。然后将磁珠在空气中干燥 5 分钟。
  8. 将离心管从磁力架上取下。用 35 µL 无菌 EB 缓冲液洗脱 DNA 目标片段，混匀后孵育 3 分钟，再将离心管放回磁力架上静置 3 分钟。
  9. 将含有洗脱 PCR 产物的上清液约 30 µL 转移至新的洁净离心管中。
  10. 在下一代测序平台上对样本进行测序。对于 HumanV1 gRNA 文库，使用 表 4 中列出的定制引物对 19 bp 进行测序。

11. 生物信息学分析以鉴定受体及相关通路

  1. 使用 MAGeCK 的 count 功能将分选后和未分选群体的序列比对至参考文库。该功能将生成一个原始计数文件（补充表 1）。
    注意：MAGeCK 的安装方法及其各项功能的使用说明详见 Wang 等人先前发表的实验方案20。
  2. 检查筛选实验中所用对照文库的技术标准。
    1. 对原始计数进行中位数归一化，并使用 R 中的 ggplot2 软件包21 或等效软件绘制质粒文库和对照未分选样本中计数的累积分布函数图（图 5A）。
    2. 使用 MAGeCK 的 -test 功能，以质粒文库群体的计数作为 "control"，未分选对照样本的计数作为 "test" 样本进行分析。该功能将生成一个基因汇总文件（补充表 1）。
    3. 打开基因汇总文件，绘制先前分类为必需基因和非必需基因的 log-fold-changes 分布图（neg|lfc 列）22（图 5B）。
    4. 选择显著耗竭的基因（neg|fdr < 0.05），并使用 R 中的 enrichr23 软件包或任何等效的通路富集分析软件包进行通路富集分析（图 5C）。
  3. 使用默认参数运行 MAGeCK 的 -test 功能。在分析时，将未分选对照样本的原始计数作为 "control"，分选样本的计数作为 "treatment"。
  4. 打开 MAGeCK 生成的基因汇总文件，按 pos|rank 列升序排列。以 FDR（pos|fdr 列）< 0.05 作为筛选阳性结果的阈值。受体基因通常排名靠前，常位于第一位。
  5. 在 R 或等效软件中绘制正向选择的稳健排序算法（Robust-Ranking-Algorithm, RRA）得分（pos|score）（图 5D）。
  6. 选择阳性基因，并使用 enrichr 软件包或 R 中任何等效的通路富集分析软件包进行通路富集分析，以鉴定富集的生物学通路。

结果

提供了分别在 NCI-SNU-1 和 HEK293 细胞中进行的两个代表性全基因组规模敲除筛选实验的测序数据，用于鉴定人源 TNFSF9 和P. falciparum RH5 的结合伴侣（补充表 1）。RH5 的结合行为受到硫酸乙酰肝素和其已知受体 BSG24 的影响（图 3C），而 TNFRSF9 仅特异性结合其已知受体 TNFSF9，在与可溶性肝素预孵育后结合能力未下降。图 3B 中的蛋白 3 代表 TNFRSF9。

对于两种细胞系，转导后第3天（以及转导后第9、14和16天）对照突变文库中gRNA的分布情况也已提供（补充表1）。gRNA分布结果显示，文库复杂性在实验全程中均得以维持（图5A）。针对TNFSF9配体的遗传筛选在转导后第14天进行，而针对RH5的筛选则在转导后第9天进行。通过比较靶向非必需基因参考集的gRNA所观察到的倍数变化分布与靶向必需基因参考集的分布，评估了筛选实验的技术质量22（图5B）。此外，在将对照样本与原始质粒文库进行比较时，通路水平的富集分析也显示，预期的必需通路在“剔除”群体中被识别并显著富集。图中以NCI-SNU-1样本在转导后第14天的结果为例进行了展示（图5C）。

使用 MAGeCK 的 -test 函数分析对照组与分选后群体中 gRNA 的分布情况（参见 补充表 1 中 MAGeCK 输出的基因汇总结果），以从表型筛选中鉴定受体。在基因水平分析中，MAGeCK 报告的修正 RRA 评分根据 p 值对基因进行排序后绘制。MAGeCK 中的 RRA 评分用于衡量 gRNA 的排名是否一致地高于预期。在 TNFRSF9 的筛选中，排名最高的基因为 TNFSF9，其为 TNFRSF9 的已知结合配体（图 5D）。此外，还鉴定出多个与 TP53 通路相关的基因。在 RH5 的筛选中，除已知受体（BSG）以及参与硫酸化 GAGs 合成的基因（SLC35B2）外，还鉴定出另一个基因（SLC16A1）（图 5E）。SLC16A1 是一种分子伴侣，对将 BSG 转运至细胞表面至关重要25。综上，这些结果表明该筛选方法能够有效鉴定直接相互作用的受体，以及使该受体以功能性形式表达于细胞表面所必需的细胞组分。

重组蛋白合成、结合实验、CRISPR-Cas9 基因筛选示意图，用于生化研究。
图 1：通过基因筛选方法鉴定细胞表面受体的总体流程。 该实验包含三个主要步骤：首先，在能够添加结构关键性翻译后修饰的细胞系（如 HEK293 细胞）中表达代表细胞表面受体胞外域的重组蛋白。通过将单体蛋白胞外域与链霉亲和素-PE（streptavidin-PE）偶联，使其发生寡聚化，以增强其结合亲和力。其次，将这些高亲和力探针用于细胞结合实验；当待测细胞系上出现明显的 PE 荧光信号（绿色）偏移，而阴性对照蛋白（黑色）无此偏移时，表明存在可与探针结合的细胞表面结合分子。第三，选择对受体呈阳性的 Cas9 表达细胞系，并开展全基因组范围的筛选，使用靶向绝大多数蛋白编码基因的 gRNA 进行筛选。在构建突变文库时，通常采用 30% 的转导效率，该数值基于泊松分布概率，确保每个细胞仅携带一个 gRNA，从而使观察到的表型可归因于特定基因的敲除。转导细胞所表达的 BFP 标记用于通过 FACS 筛选出携带 gRNA 的细胞。表型筛选在转导后 9–16 天内进行。在筛选当天，将整个突变细胞群体分为两部分：其中一半作为对照群体，另一半用于重组蛋白结合筛选。利用 FACS 分选无法再与重组蛋白结合的突变细胞，并通过比较分选群体与对照群体中 gRNA 的富集程度，鉴定出对标记探针在细胞表面结合所必需的基因。图中已标出本方案中耗时较长的步骤。本图改编自 Sharma 等人19。 请点击此处查看本图的放大版本。

吸光度与稀释度关系图，显示链霉亲和素-PE的影响；405 nm处的吸光度，缓冲液比较。
图2：使用基于ELISA的方法确定生物素化蛋白与链霉亲和素-PE的配比。 该策略示例展示了如何利用生物素化的单体蛋白与链霉亲和素结合，生成高亲和力探针。将一系列稀释梯度的生物素化单体与固定浓度的链霉亲和素共同孵育，通过ELISA确定无法检测到过量生物素化单体的最低稀释度。ELISA实验在有或无预孵育的情况下进行，即在加入10 ng链霉亲和素-PE的前提下，对一系列蛋白稀释液进行检测。在存在链霉亲和素-PE的情况下，确定未检测到信号的最低稀释度（以黑色圆圈标出），并计算达到饱和所需的蛋白量，从而制备含有4 µg/mL链霉亲和素-PE的10倍浓缩储备液。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质结合流式细胞术直方图，包含对照和预孵育条件，三种蛋白质。
图3：蛋白质与细胞系结合的代表性结果。（A）与对照样本相比，蛋白质与细胞系的结合导致细胞相关荧光信号显著增强。重组蛋白经热处理（80 °C，10 min）后，其结合能力完全消失，恢复至阴性对照水平，表明该结合行为依赖于正确折叠的蛋白质构象。（B）蛋白质与细胞表面结合行为的不同类型；对糖胺聚糖（GAGs）的依赖性。从左至右，这些蛋白质可分为三类：第1类蛋白质仅吸附于肝素硫酸蛋白聚糖（HS）；当预孵育时加入浓度超过0.2 mg/mL的肝素，其结合能力完全丧失。第2类蛋白质除结合HS外，还结合特异性受体；在预阻断实验中，其结合能力部分减弱。第3类蛋白质不结合HS；与亲本细胞系相比，其结合能力未受影响。（C）一种以加和方式同时结合HS和特异性受体的蛋白质示例（如RH5）。靶向受体（如BSG）或HS合成所需酶（如SLC35B2、EXTL3）仅能部分降低RH5与细胞的结合，相较于对照组。此类实验可利用转导的多克隆细胞系来确定蛋白质的结合特性。本图经修改自Sharma等19。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术图谱；通过gRNA靶向GFP；BFP与GFP荧光比较；基因编辑分析。
图4：筛选具有高Cas9活性的单克隆细胞系。 使用GFP-BFP报告系统评估NCI-SNU-1细胞系的多克隆及单克隆细胞系的基因组编辑效率，其中细胞系被转导携带编码GFP的gRNA靶向质粒病毒或不携带该质粒（即“空载”）的病毒。图中展示了示意图。转导后，通过流式细胞术检测BFP和GFP的表达，并与未感染的对照组进行比较。GFP的表达被用作Cas9活性的替代指标，而BFP的表达用于标记已转导的细胞。所有克隆中，未感染和空载病毒感染细胞的表达谱相似。左侧图版展示了代表性表达谱。NCI-SNU-1细胞系的全部五个克隆均显示出比多克隆细胞系更高的GFP丢失率（右图），其中克隆4表现出最高的编辑效率且难治性细胞群最少。本图经Sharma等19修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

基因编辑分析；图表与示意图；标准化计数、基因表达、生物合成通路。
图5：用于鉴定细胞表面结合伴侣的遗传筛选的代表性结果。（A）累积分布函数图，比较转导后第9、14和16天HEK-293-E和NCI-SNU-1细胞的质粒文库与突变文库中gRNA的丰度。对于任意给定数值，累积分布函数表示低于该阈值的数据点所占的百分比。与原始质粒文库相比，突变细胞群的微小偏移代表了部分gRNA的耗竭。（B）在HEK293和NCI-SNU-1细胞系中先前被归类为必需（红色）或非必需（黑色）基因的log倍数变化分布。非必需基因的倍数变化分布中心位于约0，而必需基因的分布则向左偏移，趋向负倍数变化。（C）转导后14天NCI-SNU-1突变对照群体中基因耗竭显著富集的通路。检测到已知的细胞必需通路。（D）在失去结合TNFRSF9探针能力的分选细胞中富集基因的稳健秩算法（RRA）得分。基因按RRA得分排序。已知的相互作用伴侣TNFSF9以及与TP53通路相关的基因（以红色标注）在筛选中被识别。（E）通过gRNA富集分析鉴定出的在HEK293细胞中RH5结合所必需基因的RRA得分排序图（左图）。在5%错误发现率（FDR）阈值下鉴定出SLC35B2和SLC16A1。在25% FDR下还鉴定出HS生物合成通路中的另外两个基因（即EXTL3和NDST1）。示意图展示了通用GAG生物合成通路，并将相关基因映射到相应步骤（中图）。参与软骨素硫酸盐生物合成决定步骤的基因（即CSGALNACT1/2）未在筛选中被发现。本图经Sharma等19修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

质粒名称质粒编号用途
蛋白表达载体：CD200RCD4d3+4-bio-linker-hisAddgene: 36153用于表达含CD4d3+4、生物素和6-his标签的重组蛋白。
pMD2.GAddgene: 12259VSV-G包膜表达质粒；用于慢病毒的制备。
psPAX2Addgene: 12260慢病毒包装质粒；用于慢病毒的制备。
Cas9表达载体：pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-WAddgene: 68343用于构建稳定表达Cas9的细胞系。
gRNA表达载体：pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-WAddgene: 67974CRISPR gRNA表达载体，含优化的骨架结构及puro/BFP标记。
人源全基因组优化敲除CRISPR文库Addgene: 67989针对18,010个人类基因设计的gRNA文库，适用于慢病毒系统。
GFP-BFP报告载体：pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-WAddgene: 67980含BFP和GFP的Cas9活性报告载体。
空载体：pKLV2-U6gRNA5(empty)-PGKBFP2AGFP-WAddgene: 67979含BFP和GFP的Cas9活性报告对照载体。

表1：本研究中使用的质粒。

缓冲液名称组分
HBS（10倍浓缩）1.5 M NaCl 和 200 mM HEPES 溶于 MiliQ 水，调节 pH 至 7.4
PBS（10×）80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na2HPO4 和 2.4 g KH2PO4 在MiliQ水中，调节pH至7.4
磷酸钠缓冲液（80 mM 储存液）7.1 g Na2HPO4.2H2O，5.55 g NaH2PO4，调节pH至7.4
His-纯化结合缓冲液20 mM 磷酸钠缓冲液，0.5 M NaCl 和 20 mM 咪唑，调节 pH 至 7.4
His-纯化洗脱缓冲液20 mM 磷酸钠缓冲液，0.5 M NaCl 和 400 mM 咪唑，调节 pH 至 7.4
二乙醇胺缓冲液10% 二乙醇胺和 0.5 mM MgCl₂ 溶于 MiliQ 水中，调节 pH 至 9.2：
D10DMEM，1% 青霉素-链霉素（100 单位/毫升）和 10% 热灭活胎牛血清

表2：本研究所需的缓冲液。

组分10-cm 培养皿6-孔板
293FT 细胞70–80% 汇合度70–80% 汇合度
适用于转染的培养基（Opti-MEM）（步骤 5.1.2）3 mL500 µL
适用于转染的培养基（Opti-MEM）（步骤 5.1.4）5 mL2 mL
慢病毒转移载体3 µg0.5 µg
psPax2（见表 1）7.4 µg1.2 µg
pMD2.G（见表 1）1.6 µg0.25 µg
PLUS 试剂12 µL2 µL
Lipofectamine LTX36 µL6 µL
D10（步骤 7.1.7）5 mL1.5 mL
D10（步骤 7.1.8 和 7.1.10）8 mL2 mL

表3：慢病毒包装混合物中试剂的用量和体积。

表4：用于扩增gRNA和NGS的引物序列。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

试剂每反应体积总混合液（×38）
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x25 μL950 μL
引物（L1/U1）混合液（各10 μM）1 μL38 μL
基因组DNA（1 mg/mL）2 μL72 μL
H2O22 μL1100 μL
总计50 μL1900 μL

表5：从高复杂度样本中扩增gRNA的PCR反应。

循环次数变性退火延伸
198 °C, 30s
2-2498 °C, 10s61 °C, 15s72 °C, 20s
2572 °C, 2 min

表6：第一次PCR的反应条件。

试剂每反应体积
KAPA HiFi HotStart ReadyMix25 μL
引物（PE1.0/索引引物）混合液（各5 μM）2μL
第一轮PCR产物（40 pg/μL）5 μL
H2O18 μL
总计50 μL

表7：从遗传筛选中对sgRNA进行索引标记的PCR。

循环次数变性退火延伸
198 °C, 30s
2-1598 °C, 10s66 °C, 15s72 °C, 20s
1672 °C, 5 min

表8：第二次PCR的反应条件。

蛋白质结合与荧光的流式细胞术分析；直方图和散点图比较靶向细胞与对照细胞中 SLC35B2 的表达，突出显示已分选的细胞群。
补充图 S1：绘制门控以分选非结合细胞群的示意图。（A）理想的筛选蛋白候选物应相对于对照组细胞显示出明显的结合细胞群偏移，且该结合应在缺乏硫酸乙酰肝素（HS）生物合成机制的细胞中仍得以保留。可使用肝素阻断实验替代在 SLC35B2 靶向细胞系上的检测。（B）收集缺乏蛋白胞外域表面染色但通过慢病毒转导表达蓝色荧光蛋白（BFP）荧光的细胞。图中所示细胞来自针对鉴定 GABBR222 受体的筛选实验。本图经 Sharma 等人19 修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

主成分分析（PCA）图表，用于比较细胞系，聚类可视化数据分析。
补充图 S2：基于细胞表面糖蛋白转录组的 PCA 图，使用来自 1,000 多个癌细胞系的 RNA-seq 数据绘制。 来自 Cell Model Passport27 的细胞系根据约 1,500 种细胞表面糖蛋白的 FPKM 值，采用 K 均值聚类法进行聚类。每个聚类中的代表性细胞系已标注。聚类 5 完全由造血来源的细胞系组成（另见 补充表 2）。请点击此处查看该图的高清版本。

显示基因表达差异的层次聚类热图；BF评分数据分析。
补充图 S3：基于项目评分的 KEGG 注释蛋白分泌和 N-连接糖基化基因的必需性评分。 对约 330 种细胞系（列，未标注）中蛋白分泌和 N-连接糖基化通路基因（X 轴）的校正后贝叶斯必需性评分进行了绘图。评分高于 0 表示与原始质粒文库相比，突变体群体中存在显著耗竭。这些基因可分为三个不同的簇，代表其在细胞系中不同水平的必需性。该聚类结果可用于确定分选时间。若筛选在较晚时间点（第 16 天）进行，则可能无法鉴定出已知对细胞必需的基因（簇 1 和簇 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：代表性遗传筛选相关的原始计数文件及由MAGeCK软件生成的gene_summary文件。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

补充表2：根据细胞表面受体表达对细胞系进行聚类。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

讨论

本文描述了一种基于CRISPR的筛选策略，用于鉴定编码参与细胞识别过程的细胞组分的基因。类似地，使用CRISPR激活的方法也提供了一种遗传学手段，可直接鉴定重组蛋白的相互作用受体，而无需构建大规模的蛋白文库26。然而，该方法的一个主要优势在于，其适用于由细胞表面天然表达的分子介导的相互作用，而不依赖于受体的过表达——后者可能影响受体的结合亲和力。因此，与其他方法不同，该技术不对受体的生物化学特性或细胞生物学性质做任何预设，能够研究那些通常难以通过生化方法分析的蛋白介导的相互作用，例如分子量极大的蛋白、多次跨膜蛋白、与其他蛋白形成复合物的蛋白，以及非蛋白类分子（如聚糖、糖脂和磷脂）介导的相互作用。鉴于该方法具有全基因组尺度的覆盖能力，其另一优势在于不仅能鉴定出受体，还能识别结合事件所必需的其他细胞组分，从而为理解受体的细胞生物学特性提供深入见解。

使用该方法鉴定孤儿蛋白受体时，一个主要局限在于首先需要鉴定出能够与该蛋白结合的细胞系。这并不总是容易实现，而找到既表现出结合表型又适用于遗传筛选的细胞系，往往是实施该检测时耗时最长的步骤。某些细胞系比其他细胞系更容易非特异性地结合更多蛋白。这一点对于能够结合肝素硫酸蛋白多糖（HS）的蛋白尤为重要，因为这类蛋白倾向于结合任何表达HS侧链的细胞系，而不论其天然结合环境如何。此外，我们观察到，在细胞系中上调syndecans（即含有HS的蛋白聚糖）的表达会增强HS结合蛋白的结合能力26。在选择用于筛选的细胞系时，这一点值得考虑。然而，同样重要的是，HS的结合效应是叠加性的，而非与特异性受体结合相互依赖，因此不会干扰蛋白与特异性受体的结合。这意味着，如果检测到结合信号，该结合可能完全由HS介导，因为在本实验中HS介导的结合是叠加性的而非共依赖性的19。在此类情况下，文中所述的肝素阻断方法即可识别出此类结合行为，而无需进行完整的遗传筛选。

用于选择细胞系的一个有用资源是 Cell Model Passport，其中包含约 1,000 种癌症细胞系的基因组学、转录组学和培养条件信息27。根据具体的生物学背景，可依据细胞的表达谱来选择细胞系。为了辅助细胞系的选择，我们根据约 1,500 种预先注释的人类细胞表面糖蛋白的表达情况，对 Cell Model Passport 中的约 1,000 个细胞系进行了聚类分析28（补充图 2；各细胞系的聚类信息及其培养条件详见 补充表 2）。在检测功能未知蛋白的结合能力时，建议从每个聚类中选择一组代表性细胞系，以提高覆盖多种受体的可能性。在条件允许的情况下，应优先选择易于培养且易于转导的细胞系。由于这些细胞系将用于全基因组规模的筛选，因此最好能够方便地大量扩增，并对慢病毒转导具有较高的敏感性，因为慢病毒转导是后续步骤中基于 CRISPR 的遗传筛选递送 sgRNA 最常用的方法。

通常，表型筛选通过单次分选完成。然而，具体操作取决于染色细胞群体与对照相比的荧光强度。当目标表型的信噪比较低，或筛选目的是鉴定具有显著表型的突变体时，可采用多轮迭代式筛选。在基于流式细胞术（FACS）的筛选中使用迭代分选策略时，需注意分选过程可能导致细胞死亡，主要原因是分选仪产生的剪切力。因此，并非所有收集到的细胞都能在下一轮分选中被代表。

文库复杂度是进行成功遗传筛选的一个非常重要的因素，尤其是在负筛选中，因为此类筛选的耗竭程度只能通过与起始文库中存在的成分进行比较来确定。对于负筛选，通常需要维持500-1,000倍复杂度的文库。然而，正筛选对文库大小的依赖性较低，因为在这些筛选中，预期仅有少数突变体会被选择出特定表型。因此，在本研究所描述的正筛选中，文库复杂度可降低至50-100倍而不影响筛选质量。此外，在这些筛选中，还可以在同一天针对特定细胞系使用一个对照文库作为该细胞系当天所有分选样本的"通用对照"，从而减少需要构建和测序的对照文库数量。

采用该方法时另一个重要的考虑因素是，功能缺失筛选在鉴定对体外细胞生长至关重要的基因方面存在局限性。在此方面，筛选的时间点非常关键：突变细胞在培养中维持的时间越长，携带必需基因突变的细胞越可能失去活力，从而不再存在于突变文库中。作为Project Score计划的一部分，近期在超过300种细胞系中开展的遗传筛选显示，KEGG注释的蛋白质分泌和N-糖基化通路中的多个基因常被鉴定为多种细胞系生长所必需的基因（补充图3）29。在设计筛选实验时，若需研究增殖和存活相关基因在细胞识别过程中的作用，则应考虑这一因素。在此情况下，通常宜在较早时间点进行筛选（例如转导后第9天）。然而，若该方法旨在鉴定少数具有显著效应大小的靶点，而非普遍的细胞通路，则可在较晚时间点进行筛选（例如转导后第15–16天）。

筛选结果非常可靠；在过去进行的八次重组蛋白结合筛选实验中，细胞表面受体在每次实验中均为排名第一的候选分子19。因此，在使用该方法鉴定相互作用伙伴时，预期能够以高度统计学置信度鉴定出该受体及其在细胞表面呈现过程中起作用的相关因子。一旦完成筛选，并通过单个gRNA敲除实验验证了候选分子，可进一步采用现有的生化方法进行后续研究，例如AVEXIS4，以及利用表面等离子共振技术对纯化蛋白进行直接的可饱和结合分析。本文所述方法适用于所有能够制备可溶性重组结合探针的蛋白质。

综上所述，这是一种基于全基因组规模的CRISPR基因敲除方法，用于鉴定由细胞表面蛋白介导的相互作用。该方法具有广泛的适用性，可用于鉴定多种不同生物学背景下细胞表面识别所必需的细胞通路，包括生物体自身细胞之间的识别（例如神经和免疫识别），以及宿主细胞与病原体蛋白之间的相互作用。该方法为受体鉴定提供了遗传学替代方案，相较于传统的生化方法，它无需对受体的生化特性或细胞生物学性质进行任何先验假设，因而具有发现全新未知机制的巨大潜力。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由惠康信托基金（Wellcome Trust）资助，资助编号206194，授予GJW。我们感谢细胞计量核心设施的Bee Ling Ng、Jennifer Graham、Sam Thompson和Christopher Hall在FACS方面的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗小鼠碱性磷酸酶SigmaA4656
杀稻瘟菌素Chem-CruzSC-204655
血液 & 细胞培养 DNA 大量提取试剂盒Qiagen13362
BSASigmaA9647-100G
二乙醇胺Sigma398179
DMEMGibco31966-021
DNeasy 血液与组织试剂盒Qiagen69504
DynaMag-96 侧向磁铁Invitrogen12331D
HEK293T 包装细胞ATCCCRL-3216
肝素SigmaH4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMixKapaKK2602
Lipofectamine LTX 转染试剂（含 PLUS 试剂）Invitrogen15338100
MoFlo XDP 细胞分选仪BD
Ni2+-NTA 琼脂糖凝胶珠Jena BioscienceAC-501-25
OPTI-MEMLife Technologies31985-070
OX-68 抗体AbD SerotecMCA1022R
对硝基苯基磷酸盐Sigma1040-506
PD-10 脱盐柱GE 医疗17085101
PolybreneMilliporeTR-1003-G
5 mL 床体积的聚丙烯管Qiagen34964
蛋白酶K，重组，PCR级罗氏3115879001
嘌呤霉素GibcoA11138-03
Q5热启动高保真2× 预混液NEBM0494L
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104
短链脂肪酸滤器Nalgene190-2545
索尼细胞分选仪索尼
SPRI 磁珠（Agencourt AMPure XP 磁珠）贝克曼A63881
链霉亲和素包被的微量滴定板Nalgene734-1284
链霉亲和素-PEBiolegend405204

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