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Summary

该方法的目的是通过与已知红细胞CR1密度的三个受试者进行比较，确定任何受试者红细胞CR1密度的CR1密度。该方法使用抗CR1单克隆抗体在受试者红细胞免疫染色后使用流细胞学，并结合使用植物素（PE）的放大系统。

Abstract

CR1（CD35，C3b/C4b的补色受体1型）是一种高分子量膜糖蛋白，约200 kDa，控制补充活化，运输免疫复合物，并参与体液和细胞免疫反应。CR1 存在于许多细胞类型的表面上，包括红细胞，在长度、结构（Knops 或 KN、血群）和密度方面表现出多态性。每红细胞（CR1/E）CR1的平均密度为每红细胞500个分子。此密度因人而异（100~1，200 CR1/E），同一个体从一个红细胞到另一个红细胞。我们在这里提出了一种可靠的流细胞测量方法，用于测量CR1/E的密度，包括在表达低密度的受试者中，借助放大免疫染色系统。这种方法使我们能够显示CR1红细胞表达在疾病，如阿尔茨海默氏病（AD），全身红斑狼疮（SLE），艾滋病，或疟疾的降低。

Introduction

CR1（补充受体类型1，CD35）是一种200 kDa跨膜糖蛋白存在于许多细胞类型的表面，如红细胞^1、B淋巴细胞^2、单细胞细胞、一些T细胞、卵泡变性细胞^3、胎儿星斑细胞⁴和球状球状细胞^5。CR1干扰其配体C3b、C4b、C3bi^6,6、7、8、9，第一补分组C1q^7,8,910和MBL（曼南结合语^）11的子单元抑制补品的激活，并参与体液和细胞免疫反应。

在灵长类动物，包括人类，红细胞CR1参与将免疫复合物输送到肝脏和脾脏，以净化血液，防止它们在脆弱的组织中积累，如皮肤或肾脏12、13、14。^12,13,14免疫复合物和红细胞之间的免疫粘附现象取决于CR1分子^{的数量15。}在人类中，CR1/E的平均密度只有500（即，每红细胞500个CR1分子）。此密度因人而异（100~1，200 CR1/E），同一个体从一个红细胞到另一个红细胞。一些”空”表型的个体表达少于20 CR1/E^16。

CR1/E的密度由两个共同主导体体等位基因调节，这些等位基因编码为CR1_1^17，18,18的intron 27中。这种突变为HindIII酶产生额外的限制位点。在这种情况下，使用 HindIII 消化后获得的限制片段为 7.4 kb，用于与 CR1（H: 高等位基因）的强表达相连的等位基因，与低 CR1 表达式（L:低等位基因）相连的等位机为 6.9 kb。这种联系在白种人和亚洲人中被发现，但在¹⁹岁的非洲人后裔中却找不到。

红细胞CR1的表达水平也与exon 13编码SCR 10（I643T）和exon 19编码SCR16（Q981H）中存在点核苷酸突变有关。其高在同型643I/981Q和低同源643T/981H个体^20。因此，”低”个人表达约150 CR1/E，”中等”个人表达约500CR1/E，”高”个人表达约1，000CR1/E。

除了这种红细胞密度多态性外，CR1 还具有与四种不同尺寸的异位对应的长度多态性:CR1+1 （190 kDa）、CR1+2 （220 kDa）、CR1+3 （160 kDa） 和 CR1+4 （250 kDa）²¹和对应于血型 KN²²的抗原多态性。

我们提出基于流细胞测定的方法，以确定CR1/E的密度。 使用已知CR1/E密度的三个受试者，表达低密度水平（180 CR1/E）、中等密度水平（646 CR1/E）和高密度水平（966 CR1/E），使用流式细胞仪进行抗CR1免疫后，很容易测量其红细胞或红血球（RBC）的平均荧光强度（MFI）。然后，可以将表示 MFI 的标准线绘制为 CR1/E 密度的函数。测量其CR1/E密度不为人知的受试者的MFI，并将其与该标准线进行比较，可以确定个体的CR1/E密度。这项技术已在实验室使用多年，并使我们能够发现红细胞CR1在许多疾病的表达减少，如系统性红斑狼疮^{（SLE）23，}后天免疫机能丧失综合症（艾滋病^）24，疟疾^25，最近阿尔茨海默病（AD）26，27。^26,27开发针对CR1的药物与红细胞耦合，如抗血栓药物²⁸需要评估CR1/E密度，以及提供量化CR1的可靠技术。

呈现的协议以唱歌的方式运行。它适用于确定CR1/E的密度，许多个人使用特定的商业上可用的96孔板（见材料表）。为此，我们很容易将方法适应任何96井板。对于每个样本，红细胞细胞的细胞悬浮液（0.5 x 10⁶×10⁶红细胞）分布在每口井。对于每一口井，首先添加主要的抗CR1抗体，然后是链球菌PE，二级抗链球菌类抗体，再次使用与方法相同的稀释剂，但通过调整体积和尊重相称性。

应同时抽取来自受试者的血液样本和用于CR1的受试者的血液样本，在4°C下储存在冰箱中，并在4°C（冰上和/或冰箱）处理。

Protocol

《人类血液收集和处理议定书》经区域道德委员会（CPP Est II）审查和批准，协议编号为2011-A00594-37。由于以下议定书描述了人类血液的处理，因此应遵循生物有害物质处理的制度准则。实验室安全设备，如实验室外套和手套，应穿。

1. 红细胞洗涤

注:处理前一天，准备一个含有0.15%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）的PBS-BSA缓冲液，并将其放入冰箱4°C。此缓冲器将用作洗涤缓冲液和稀释缓冲液。

1. 移液器 20 mL PBS-BSA 成 50 mL 管。
2. 吸气250μL的乙酰亚胺四乙酸钠（EDTA）抗凝血管全血，并添加到含有20mL的PBS-BSA的管子中。拧开盖子，关闭管。通过反转管 2x 轻轻混合。
3. 在4°C下在4°C下将管离心10分钟，在430 x g。使用 10 mL 移液器取出并丢弃上清液。通过温和而仔细的移液，在上清液的剩余体积中重新悬浮颗粒。
4. 在含有颗粒的管中加入20 mL的冷PBS-BSA（4°C）。在4°C下在4°C下将管离心10分钟，在430 x g。使用 10 mL 移液器取出并丢弃上清液。
5. 在含有颗粒的管中加入20 mL的冷PBS-BSA（4°C）。在4°C下在4°C下将管离心10分钟，在430 x g。将管留在离心机中 4 °C，然后转到第 2 部分。

2. 红细胞稀释

1. 移液器 3 mL 的冷 PBS-BSA 放入 50 mL 管中，并将其储存在 4°C 的冰上架上。
2. 将装有红细胞的离心管（步骤 1.4）放在放置在冰中的机架上。
3. 移液器 8 μL 的颗粒红细胞使用移液器，并添加到含有 3 mL PBS-BSA 的 50 mL 管中，以获得红细胞稀释。用手轻轻混合管，获得红细胞的均匀细胞悬浮液。

3. 红细胞免疫染色

1. 移液器 100 μL 的红细胞稀释（在第 4 节中获得），并添加到 1.4 mL 管中。
2. 在4°C下在4°C下将管离心5分钟，在430 x g。在离心期间，在PBS-BSA缓冲液中制备0.05 μg/μL浓度的生物微化抗CR1 J3D3抗体稀释。
3. 一旦离心完成，取出并丢弃上清液。
4. 将20μL的生物微粒杀菌抗CR1 J3D3直接加入颗粒。要准备负控制，请改为添加 20 μL 的 PBS-BSA 缓冲液。轻轻混合管，在4°C下孵育45分钟。
5. 孵育45分钟后，在管中加入750μL的PBS-BSA。在4°C下在4°C下将管离心5分钟，在430 x g。取出并丢弃上清液。重复。
6. 同时，准备在PBS-BSA缓冲液中稀释链球菌素-植二体素的1:10稀释。移液器 20 μL 的链霉素-植二醇1:10稀释，并添加到管中。轻轻混合管，在4°C下孵育45分钟。
7. 将 750 μL 的 PBS-BSA 缓冲液添加到管中。在4°C下在4°C下在4°C下混合好，在4°C下将离心机搅拌5分钟。取出并丢弃上清液。重复。
8. 在离心期间，制备1:100稀释在PBS-BSA缓冲液中稀释的生物微化抗链球菌抗体。
9. 一旦离心完成，取出并丢弃上清液。
10. 移液器20μL的生物微化抗链霉菌丁的1:100稀释到管子中。轻轻混合管。在4°C下孵育管45分钟。
11. 孵育45分钟后，移液器750μL的PBS-BSA缓冲液并加入管中。在4°C下在4°C下将管离心5分钟，在430 x g。取出并丢弃上清液。重复。
12. 移液器 20 μL 的链霉素-植二醇1:10稀释，并添加到管中。轻轻混合管。在4°C下孵育管45分钟。
13. 移液器 750 μL 的 PBS-BSA 缓冲液并添加到管中。在4°C下，在4°C下，在4°C下混合好管，将管子离心5分钟。取出并丢弃上清液。重复此步骤 2 倍。

4. 免疫染色红细胞固定

1. 在最后一次离心期间，准备固定缓冲液，使用洗涤缓冲液PBS-BSA稀释37%甲醛1:100。
2. 移液器 450 μL 固定缓冲液，并加入免疫染色红细胞管（从步骤 3.13 起），同时涡旋 5 s。
3. 移液器将所有固定细胞放入5 mL圆形底管中，并储存在冰箱中。
   注: 协议可以在这里暂停长达 48 小时。

5. 染色红细胞的流动细胞学分析

注:建议参考细胞仪的操作员手册（参见材料表），了解如何执行测程读数。以下建议参数适用于所使用的仪器，必须针对每个细胞计进行优化。

1. 打开流量测速仪，然后打开计算机。让光学系统温度稳定，使其打开 30 分钟。检查软件中的细胞仪窗口，以确保细胞计已连接到工作站（显示消息细胞计已连接）。
2. 检查缓冲容器是否已满，以及废物容器是否为空。使用净化系统清除缓冲器和缓冲管管管管中的气泡。按下细胞仪控制台上的“原数“按钮，为流体系统提供压榨。等待指示灯从红色变为绿色。
3. 要清洁液体，请在样品喷射口上安装一个含有 3 mL 清洁溶液的管子，并允许清洁溶液以高样品流速运行 5 分钟。使用蒸馏水冲洗溶液重复此操作。将装有水的管子留在样品喷射口上。
4. 要准备校准珠，移液器 400 μL PBS 进入圆底管的底部。通过旋涡30s将珠子股强烈混合。在含有PBS的圆形底管中加一滴。通过旋涡搅拌 30 s 仔细混合。
5. 运行性能检查。打开软件中的细胞仪设置和跟踪模块（图 1A）。验证细胞仪配置是否正确，适用于使用 PE 免疫染色的实验。验证校准珠批是否正确配置。
6. 将珠管安装在样品喷射端口上，使其以较低的采样流速运行。运行性能检查，大约需要 5 分钟才能完成）。性能检查完成后，验证测程仪的性能是否令人满意（图 1B）。关闭软件中的细胞仪设置和跟踪模块。
7. 要设置实验并创建应用程序设置，请单击浏览器工具栏上的“新建实验”按钮并打开新实验。通过选择适当的细胞计设置来指定参数:从实验的下拉菜单中选择正向散射（FSC）、侧散射（SSC） 和PE（图 1C）。为 FSC 参数选择线性模式，为 SSC 和 PE 参数选择对数模式。
8. 在打开的实验中，选择细胞仪设置（图 1D），然后选择“应用程序设置“，然后创建全局工作表（图 1E）。使用灰色框和十字线来指导优化。
9. 将未染色的控制管加载到细胞仪上并运行采集。通过优化 FSC 和 SSC 电压，确保感兴趣的人群（即 RBC）具有规模。优化 FSC 阈值，在不干扰感兴趣的杂物的情况下消除碎屑。
10. 在 FSC 与 SSC 图上围绕 RBC 绘制一个门。在 PE 荧光的点图中显示 RBC 填充。如果需要，增加光倍增管 （PMT） 电压的荧光，将负量放在灰色盒中。从细胞仪卸载未染色的控制管。
11. 验证正量是否在规模上。将染色控制管加载到细胞仪上并运行采集。如果正总体处于非刻度水平，则降低 PMT 电压，直到完全以刻度看到正量。然后卸载染色样品。
12. 要记录和分析样品，请在新的全局工作表上创建以下数据预览图:1） FSC vs. SSC，2） PE 荧光直方图。将第一个样品加载到细胞仪上并运行采集。
13. 在 FSC 与 SSC 图上围绕红细胞绘制 RBC 门。在 PE 荧光直方图中显示 RBC 总体。在统计视图中，选择 GR 人口上的 PE 荧光参数平均值（图1F）。
14. 在“获取“仪表板中，选择要记录的停止门中的所有事件和 10，000 个事件（图 1G）。单击“记录数据“。事件记录完成后，从细胞仪中取出第一个管。全局工作表图应如图2所示。
15. 加载以下示例并记录它们。

6. 确定红细胞CR1的密度

1. 取与”低”主题（图3、表一、RBC MFI）、”中等”主题（图4、表D、RBCMFI）、”高”主题（图4、表一、RBC MFI）和负控制样本（图3、表一、RBC MFI）对应的样本的平均荧光强度值。
2. 在表示平均荧光强度作为 CR1 密度函数的图形上，放置与负控制、”低”主题、”中等”主题和”高”主题对应的四个点（蓝点，图 6）。
3. 绘制回归线以获取校准线及其方程。
4. 取与要确定密度的受试者对应的样本的平均荧光强度的值。（图5，表D和I，RBCMFI）。
5. 使用平均荧光强度的值替换”Y”来获取方程，并计算 CR1/E 的密度（图 6）。
6. 检查图形上的平均荧光强度值和确定的 CR1/E 密度是否与校准线上的点相对应（图 6）。

Representative Results

Discussion

有多种技术可用于确定红细胞CR1（CR1/E）的密度。使用的第一种技术是抗CR1抗体³¹凝固红血球，以及红细胞在红细胞中涂有C3b³²时形成红血球。这些基本技术很快被使用放射性标记的抗CR1抗体^11，3333的免疫染色方法所取代。也可以通过酶相关免疫吸附剂测定^{（ELISA）34}来测量膜提取物中CR1的浓度。虽然精度，这些技术仅提供 CR1/E 密度的平均值。CR1/E密度在整个红细胞群中的分布只能通过免疫染色后的流细胞测量分析获得。由于CR1/E的低密度，这种技术是困难的。然而，扩增方法现在使得可以轻松测量CR1/E³⁰的密度。

在这里，我们提出了一种基于免疫染色细胞荧光信号的放大，通过流动细胞测定来量化CR1/E的方法。放大系统使用生物微化抗CR1单克隆抗体J3D3连续四层染色;植物素-链球菌;生物微化山羊抗链球菌抗体;再次植物-链球菌。J3D3识别CR1³⁵上的三个抗原位点，尽管同时不超过一个。生物微化山羊抗链球菌抗体是一种多克隆抗体，可识别链球菌身上的多个表皮，在两个链球菌层之间比仅生物素-链球菌素更上一座桥梁。这个过程还受益于植物素³⁶的高荧光率和链霉素³⁷的非特异性结合水平低。有了如此强烈的放大信号，细胞仪光倍增管的低设置可实现完美的线性度。该方法具有优异的灵敏度和可重复性，能够检测不到100个CR1/细胞。

然而，这种方法需要来自三个已知红细胞CR1密度的受试者的样本:一个受试者表达低水平的红细胞CR1（180 CR1/E），一个受试者表示中等水平的红细胞CR1（646 CR1/E），一个受试者表示高水平的红细胞CR1（966 CR1/E）。可以进行对几个个体的红细胞CR1密度的首次测量，最初使用我们研究中使用的三个受试者的红细胞，我们可以提供。应同时抽取来自CR1的受试者的血液样本和受试者的血液样本，储存在4°C的冰箱中，并在^4°C38下处理。EDTA 管中抽取的血液易于循环，可在 4°C 下储存 5 天，从而有时间定量红细胞 CR1。在此之后，红细胞CR1的密度开始下降，标准CR1曲线崩溃，特别是在与表达高水平红细胞CR1的受试者对应的点上。由于生成的回归线失真，CR1 密度的测量不再准确。需要注意的是，体外储存、处理条件和多层染色会导致CR1的聚类，并略微高估CR1分子的数量。然而，使用抗CR1抗体，针对三个表位，如J3D3与放大系统，使聚类完全执行，从而能够正确测量CR1密度^39。

事实上，CR1/E的密度在红细胞⁴⁰的生命周期中降低。这将解释同一个体中CR1/E密度的异质性。一些作者认为，CR1的催化强度与CR1/E41的初始密度无关，而对于其他作者来说，⁴¹初始密度越高，催化强度^越大42。CR1在红细胞表面的半衰程是11-32天⁴²天。

此处介绍的方法有几个优点。第一种是能够选择，由于流动细胞测量，细胞亚群被研究在同一血液样本中。通过使用门函数选择红细胞群，仅保证红细胞密度的测量。避免了由白细胞等其他细胞亚群的存在引起的红细胞CR1测量偏差。这种方法的第二个优点是，它适用于密度低的其他细胞受体的定量，只需用专门针对要研究的受体表皮的抗体替换主要抗CR1抗体即可。它也适应使用96孔板，而不是管架，这需要较低的血液和试剂体积^{25，38。25,}该方法的第三个优点是灵活。例如，在CR1密度非常高的细胞的研究中，人类淋巴细胞（10，000 CR1/细胞），或CR1密度比人类密度高10-100倍的非人类灵长类红细胞（10，000~100，000CR1/细胞^{）43，44，,44}有可能减少扩增系统层的数量， 仅使用生物微化抗CR1单克隆抗体、植物素-链球菌或生物微化抗CR1单克隆抗体、生物化抗小鼠抗体和植物素-链球菌素，从而使荧光水平适应CR1的较高密度。该方法的第四个优点是可用于固定或冷冻红细胞，使血液样本能够在缺乏流细胞测定设施的地区采集，并储存起来，以便以后准确定量CR1^38。

更一般地说，随着新的较亮的氟铬，它似乎不再强制性使用间接放大系统。此外，还有其他使用流细胞测定的方法，使评估细胞受体的密度并量化其度量单位（即ABC或抗体结合能力）成为可能。每个细胞的ABC也可以使用抗体饱和浓度和校准的珠子来确定。提供多个商业系统。有些试剂盒是预校准的标准珠子，含有已知水平的氟铬分子，如每个珠子的PE结合。同日在流动细胞仪上采集的珠子与单个患者标本相同的仪器设置，可以绘制一个标准曲线，将荧光的几何平均值与珠子的已知PE含量进行比较。确定回归分析、斜率、截距和相关性系数，并使用标准曲线^45、46,46的测量几何平均荧光计算ABC值。

另一种类型的珠子测试是基于抗体结合到具有特定抗体结合能力水平的珠子通过片段的结晶部分（Fc）的结合。珠子的标签与用于标记抗原密度的细胞的相同抗体。因此，在单个实验中，任何偶联抗体都可以使用，只要同一批次的氟磷/蛋白质比（F/P比）用于染色珠子和细胞^47。一些试剂盒更善于利用间接免疫荧光测定^48，49,49的流细胞测定对细胞表面抗原进行定量测定。

总之，该方法具有提供非常敏感的检测和易于实现普通流细胞测量材料的优点。

Materials

1000E Barrier Tip	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	2079E	sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany	S1120-1840	sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)	Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook		immunostaining
Blouse			protection
Bovin serum albumin (7,5%)	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	15260037	cytometry
Centrifuge	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	11176917	centrifugation
Clean Solution	BD, F-38801 Le Pont de Claix, France	340345	cytometry
Comorack-96	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	944060P	rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit	BD, F-38801 Le Pont de Claix, France	655051	cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %	Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France	F8775-25ML	Fixation
10 µL Graduated, filter tip	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany	S1121-3810	sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer	BD, F-38801 Le Pont de Claix, France	647788	cytometry
Microman Capillary Pistons	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	067494	sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	MP32051	mix
Micropipette Microman – type M25 –	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	066379	sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	10010031	cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	391952	sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA	486802	sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000024	sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000059	sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000083	sample pipetting
Rinse Solution	BD, F-38801 Le Pont de Claix, France	340346	cytometry
Round bottom tube	Sarstedt, F-70150 Marnay, France	55.1579	cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	0030120086	mix
streptavidin R-PE	Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France	AS-60669	immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	10203001	mix
Vector anti streptavidin biotin	Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France	BA-0500	immunostaining
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA	SI-0236	mix