使用流细胞测定测量红细胞补充受体1

Summary

该方法的目的是通过与已知红细胞CR1密度的三个受试者进行比较，确定任何受试者红细胞CR1密度的CR1密度。该方法使用抗CR1单克隆抗体在受试者红细胞免疫染色后使用流细胞学，并结合使用植物素（PE）的放大系统。

Abstract

CR1（CD35，C3b/C4b的补色受体1型）是一种高分子量膜糖蛋白，约200 kDa，控制补充活化，运输免疫复合物，并参与体液和细胞免疫反应。CR1 存在于许多细胞类型的表面上，包括红细胞，在长度、结构（Knops 或 KN、血群）和密度方面表现出多态性。每红细胞（CR1/E）CR1的平均密度为每红细胞500个分子。此密度因人而异（100~1，200 CR1/E），同一个体从一个红细胞到另一个红细胞。我们在这里提出了一种可靠的流细胞测量方法，用于测量CR1/E的密度，包括在表达低密度的受试者中，借助放大免疫染色系统。这种方法使我们能够显示CR1红细胞表达在疾病，如阿尔茨海默氏病（AD），全身红斑狼疮（SLE），艾滋病，或疟疾的降低。

Introduction

CR1（补充受体类型1，CD35）是一种200 kDa跨膜糖蛋白存在于许多细胞类型的表面，如红细胞^1、B淋巴细胞^2、单细胞细胞、一些T细胞、卵泡变性细胞^3、胎儿星斑细胞⁴和球状球状细胞^5。CR1干扰其配体C3b、C4b、C3bi^6,6、7、8、9，第一补分组C1q^7,8,910和MBL（曼南结合语^）11的子单元抑制补品的激活，并参与体液和细胞免疫反应。

在灵长类动物，包括人类，红细胞CR1参与将免疫复合物输送到肝脏和脾脏，以净化血液，防止它们在脆弱的组织中积累，如皮肤或肾脏12、13、14。^12,13,14免....

Protocol

《人类血液收集和处理议定书》经区域道德委员会（CPP Est II）审查和批准，协议编号为2011-A00594-37。由于以下议定书描述了人类血液的处理，因此应遵循生物有害物质处理的制度准则。实验室安全设备，如实验室外套和手套，应穿。

1. 红细胞洗涤

注:处理前一天，准备一个含有0.15%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）的PBS-BSA缓冲液，并将其放入冰箱4°C。此缓冲器将用作洗涤缓冲液和稀释缓冲液。

1. 移液器 20 mL PBS-BSA 成 50 mL 管。
2. 吸气250μL的乙酰亚胺四乙酸钠（EDTA）抗凝血管全血，并添加到含有20mL的PBS-BSA的管子中。拧开盖子，关闭管。通过反转管 2x 轻轻混合。
3. 在4°C下在4°C下将管离心10分钟，在430 x g。使用 10 mL 移液器取出并丢弃上清液。通过温和而仔细的移液，在上清液的剩余体积中重新悬浮颗粒。
4. 在含有颗粒的管中加入20 mL的冷PBS-BSA（4°C）。在4°C下在4°C下将管离心10分钟，在430 x g。使用 10 mL 移液器取出并丢弃上清液。
5. 在含有颗粒的管中加入20 mL的冷PBS-BSA（4°C）。在4°C下在4°C下将管离心10分钟，在430 x g。将管留在离心机中....

Results

已知CR1密度的三个受试者的红细胞（"低"受试者[180 CR1/E]，"中等"受试者[646 CR1/E]和"高"受试者[966 CR1/E]）和需要确定CR1密度的两个受试者的红细胞被抗CR1抗体与使用植物氟色素的扩增系统耦染免疫。一开始，低高范围受试者的CR1密度由Scatchard方法²⁹使用放射性标记抗体确定。确定的标准（低、中、高）用于校准曲线，并使得通过我们的细胞测定^方法30来量化新标准或低于标准成为可能。在流细胞仪中免疫染色红细胞通过后，观察并测量标记的强度，作为每个受试者的平均荧光强度（RBC MFI）（图3F，I;I图4B，D，F，I;图5B，D，F

Discussion

有多种技术可用于确定红细胞CR1（CR1/E）的密度。使用的第一种技术是抗CR1抗体³¹凝固红血球，以及红细胞在红细胞中涂有C3b³²时形成红血球。这些基本技术很快被使用放射性标记的抗CR1抗体^11，3333的免疫染色方法所取代。也可以通过酶相关免疫吸附剂测定^{（ELISA）34}来测量膜提取物中CR1的浓度。虽然精度，这些技术仅提供 CR1/E 密度的平均值。CR1/E密度在整个红细胞群中的分布只能通过免疫染色后的流细胞测量分析获得。由于CR1/E的低密度，这种技术是困难的。然而，扩增方法现在使得可以轻松测量CR1/E³⁰的密度。

在这里，我们提出了一种基于免疫染色细胞荧光信号的放大，通过流动细胞测定来量化CR1/E的方法。放大系统使用生物微化抗CR1单克隆抗体J3D3连续四层染.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000E 屏障吸头	Thermo Fischer Scientific，F-67403 Illkirch，法国	2079E	样品移液
1-100 &微量;L 斜面，滤嘴	Starlab GmbH， D-22926 Ahrenburg， Germany	S1120-1840	样品移液
生物素化抗 CR1 单克隆抗体 （J3D3）	非商业单克隆抗体的家庭生产，由 J. Cook		免疫染色
衬衫			保护
Bovin 血清白蛋白 （7,5%）	Thermo Fischer Scientific ， F-67403 Illkirch， France	15260037	细胞术
离心机	Thermo Fischer Scientific，F-67403 Illkirch，法国	11176917	离心
清洁溶液	BD，F-38801 Le Pont de Claix，法国	340345	细胞术
Comorack-96	Dominique DUTSCHER SAS，F-67172 Brumath	944060P	机架
细胞仪设置 &追踪珠套件	BD，F-38801 Le Pont de Claix，法国	655051	细胞术
醛溶液 36.5 %	Sigma Aldrich，F-38070 Saint Quentin Fallavier，法国	F8775-25ML	固定
10 &微量;L 刻度，滤嘴	Starlab GmbH，D-22926 Ahrenburg，德国	S1121-3810	样品移液
LSRFORTESSA 流式细胞仪	BD，F-38801 Le Pont de Claix，法国	647788	细胞仪
Microman 毛细管活塞	Dominique DUTSCHER SAS，F-67172 Brumath	067494	样品移液
Micronic 1.40 mL 圆底管	Dominique DUTSCHER SAS，F-67172 Brumath	MP32051	混合
微量移液器 Microman - M25型 -	Dominique DUTSCHER SAS， F-67172 Brumath	066379	样品移液
盐缓冲盐水 （PBS）	Thermo Fischer Scientific ， F-67403 Illkirch， France	10010031	流式移液器
PS 325 mm， 10 mL	Dominique DUTSCHER SAS， F-67172 Brumath	391952	样品移液
无粉丁腈橡胶检查手套	Medline Industries， Inc， Mundelein， IL 60060， USA	486802	样品保护
参考 2 移液器，0,5-10 µL	Eppendorf France SAS， F-78360 Montesson， France	4920000024	样品移液
2 移液器，20-100 &微量;L	Eppendorf France SAS， F-78360 Montesson， France	4920000059	样品移液
参考 2 移液器，100-1000 &微量;L	Eppendorf France SAS，F-78360 Montesson，法国	4920000083	样品移液
液	BD，F-38801 Le Pont de Claix，法国	340346	细胞术
圆底管	Sarstedt，F-70150 Marnay，法国	55.1579	细胞术
Safe-Lock 管，1.5 mL	Eppendorf France SAS，F-78360 Montesson，法国	0030120086
混合物链霉亲和素 R-PE	Tebu Bio，F-78612 Le Perray-en-Yvelines，法国	AS-60669	免疫染色
锥形离心管 50 mL	Thermo Fischer Scientific，F-67403 Illkirch，法国	10203001	混合物
载体抗链霉亲和素生物素	Eurobio Ingen，F-91953 Les Ulis，法国	BA-0500	免疫染色
Vortex-Genie 2	Scientific Industries， Inc，波希米亚，纽约111716，美国	SI-0236	混合物