使用流式细胞术测定红细胞补体受体1

摘要

本方法旨在通过与三位已知红细胞CR1密度的受试者进行比较，测定任意受试者红细胞中的CR1密度。该方法采用流式细胞术，通过与藻红蛋白（PE）偶联的抗CR1单克隆抗体对受试者的红细胞进行免疫染色后检测。

摘要

CR1（CD35，C3b/C4b 补体受体 1 型）是一种分子量约为 200 kDa 的高分子膜糖蛋白，可调控补体激活、转运免疫复合物，并参与体液和细胞免疫应答。CR1 存在于多种细胞表面，包括红细胞，其长度、结构（Knops 或 KN 血型系统）和表达密度具有多态性。每个红细胞表面的平均 CR1 密度（CR1/E）约为 500 个分子，但在不同个体之间（100–1,200 CR1/E）以及同一人体内不同红细胞之间均存在差异。本文介绍一种可靠的流式细胞术方法，结合信号放大免疫染色系统，用于测定红细胞表面 CR1 密度，尤其适用于低密度表达个体。该方法已帮助我们证实，在阿尔茨海默病（AD）、系统性红斑狼疮（SLE）、艾滋病（AIDS）或疟疾等疾病中，红细胞表面 CR1 的表达水平降低。

引言

CR1（补体受体1型，CD35）是一种200 kDa的跨膜糖蛋白，存在于多种细胞表面，如红细胞¹、B淋巴细胞²、单核细胞、部分T细胞、滤泡树突状细胞³、胎儿星形胶质细胞⁴以及肾小球足细胞⁵。CR1通过与其配体C3b、C4b、C3bi^6,7,8,9、第一补体成分的亚单位C1q¹⁰以及甘露糖结合凝集素（MBL, mannan-binding lectin）¹¹相互作用，抑制补体系统的活化，并参与体液免疫和细胞免疫应答。

在包括人类在内的灵长类动物中，红细胞上的CR1参与将免疫复合物转运至肝脏和脾脏，以清除血液中的免疫复合物，防止其在皮肤或肾脏等易损组织中积聚^12,13,14。免疫复合物与红细胞之间的这种免疫黏附现象依赖于CR1分子的数量¹⁵。在人类中，CR1/红细胞的平均密度仅为500（即每个红细胞含有500个CR1分子）。该密度在不同个体之间（100–1,200 CR1/红细胞）以及同一个体的不同红细胞之间均存在差异。某些表现为“"null"”表型的个体，其CR1/红细胞表达量少于20¹⁶。

CR1/E 的密度由两个共显性的常染色体等位基因调控，这两个等位基因与编码 CR1*1 的基因第 27 内含子中的一个点突变相关^17,18。该突变产生了一个额外的 HindIII 酶切位点。在此情况下，经 HindIII 消化后得到的限制性片段分别为：与 CR1 高表达相关的等位基因（H：高表达等位基因）为 7.4 kb，与 CR1 低表达相关的等位基因（L：低表达等位基因）为 6.9 kb。这种关联存在于高加索人和亚洲人中，但在非洲裔人群中未发现¹⁹。

红细胞CR1的表达水平也与第13外显子编码SCR10（I643T）和第19外显子编码SCR16（Q981H）中的单核苷酸突变有关。在643I/981Q纯合个体中表达较高，而在643T/981H纯合个体中表达较低²⁰。因此，"低表达"个体每个红细胞约表达150个CR1分子，"中等"个体约表达500个CR1/红细胞，而"高表达"个体约表达1,000个CR1/红细胞。

除了这种红细胞密度多态性外，CR1还具有长度多态性，对应于四种不同大小的异型体：CR1*1（190 kDa）、CR1*2（220 kDa）、CR1*3（160 kDa）和CR1*4（250 kDa）²¹，以及与KN血型系统相对应的抗原多态性²²。

我们介绍一种基于流式细胞术测定CR1/E密度的方法。利用已知CR1/E密度的三位受试者，其红细胞（RBC）CR1表达水平分别为低密度（180 CR1/E）、中等密度（646 CR1/E）和高密度（966 CR1/E），在使用抗CR1抗体对红细胞进行免疫染色后，可通过流式细胞仪轻松测定其红细胞的平均荧光强度（MFI），即RBC MFI。随后可绘制一条标准曲线，表示MFI与CR1/E密度之间的函数关系。通过测定未知CR1/E密度个体的MFI，并将其与该标准曲线进行比较，即可确定其CR1/E密度。该技术已在实验室中应用多年，使我们能够检测到多种疾病状态下红细胞CR1表达的下调，例如系统性红斑狼疮（SLE）²³、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）²⁴、疟疾²⁵，以及近期发现的阿尔茨海默病（AD）^26,27。针对CR1开发药物并使其与红细胞偶联（如抗血栓药物）²⁸的研究，需要对CR1/E密度进行评估，因此亟需一种可靠的技术来定量检测CR1。

本方案以单次重复进行。该方法可适用于使用特定的商品化96孔板（参见材料表）测定多个个体红细胞表面CR1/E的密度。为此，可轻松将我们的方法适配至任何96孔板。每个样本每孔加入红细胞悬液（0.5 × 10⁶–1 × 10⁶ 个红细胞）。每孔依次加入一抗抗CR1抗体、链霉亲和素-PE、抗链霉亲和素二抗，再重复加入链霉亲和素-PE，所用稀释比例与本方法一致，但需调整体积并保持比例关系。

应同时采集用于设定范围的受试者以及待测定CR1水平的受试者的血液样本，并在4 °C下冷藏保存，所有操作均需在4 °C条件下进行（置于冰上和/或冰箱中）。

方案

人类血液采集和处理的方案已通过地区伦理委员会（CPP Est II）的审查和批准，方案编号为2011-A00594-37。由于以下方案涉及人类血液的处理，应遵循机构关于生物危害材料处置的指导原则。实验人员应穿戴实验室安全装备，如实验服和手套。

1. 红细胞洗涤

注意：操作前一天，用含0.15%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）配制PBS-BSA缓冲液，并将其置于4 °C冰箱中冷藏。该缓冲液将用作洗涤缓冲液和稀释缓冲液。

1. 用移液器将 20 mL PBS-BSA 加入 50 mL 离心管中。
2. 从血液储存管中吸取 250 µL 乙二胺四乙酸钠（EDTA）抗凝全血，加入含有 20 mL PBS-BSA 的离心管中。拧紧管盖，轻轻倒置混匀 2 次。
3. 在 4 °C 条件下，以 430 ×g 离心 10 分钟。使用 10 mL 移液器吸除并弃去上清液。通过轻柔、小心地移液，将沉淀物重悬于残留的上清液体积中。
4. 向含有沉淀物的离心管中加入 20 mL 冷的 PBS-BSA（4 °C）。在 4 °C 条件下，以 430 ×g 离心 10 分钟。使用 10 mL 移液器吸除并弃去上清液。
5. 向含有沉淀物的离心管中加入 20 mL 冷的 PBS-BSA（4 °C）。在 4 °C 条件下，以 430 ×g 离心 10 分钟。将离心管保留在 4 °C 离心机中，进入第 2 节操作。

2. 红细胞稀释

1. 用移液器将 3 mL 冷的 PBS-BSA 加入 50 mL 离心管中，并将其置于冰架上，4 °C 保存。
2. 将含有红细胞的离心管（步骤 1.4）放置于冰架上。
3. 使用移液器吸取 8 µL 红细胞沉淀，加入含有 3 mL PBS-BSA 的 50 mL 离心管中，制备红细胞稀释液。用手轻轻混匀管内液体，获得均匀的红细胞悬液。

3. 红细胞免疫染色

1. 用移液器吸取100 µL红细胞稀释液（来自第4节），加入1.4 mL离心管中。
2. 将离心管在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。在离心过程中，用PBS-BSA缓冲液配制生物素化抗CR1 J3D3抗体的稀释液，使其浓度为0.05 μg/μL。
3. 离心结束后，移除并弃去上清液。
4. 直接向沉淀中加入20 µL生物素化抗CR1 J3D3抗体。对于阴性对照组，加入20 µL PBS-BSA缓冲液。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。
5. 孵育45分钟后，向各管中加入750 µL PBS-BSA缓冲液。将离心管在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤一次。
6. 在此期间，用PBS-BSA缓冲液配制链霉亲和素-藻红蛋白（streptavidin-phycoerythrin）的1:10稀释液。用移液器吸取20 µL该1:10稀释液加入各管中。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。
7. 向各管中加入750 µL PBS-BSA缓冲液。充分混匀后，在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤一次。
8. 在离心过程中，用PBS-BSA缓冲液配制生物素化抗链霉亲和素抗体的1:100稀释液。
9. 离心结束后，移除并弃去上清液。
10. 用移液器吸取20 µL该1:100稀释的生物素化抗链霉亲和素抗体加入各管中。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。
11. 孵育45分钟后，用移液器吸取750 µL PBS-BSA缓冲液加入各管中。将离心管在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤一次。
12. 用移液器吸取20 µL前述1:10稀释的链霉亲和素-藻红蛋白溶液加入各管中。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。
13. 用移液器吸取750 µL PBS-BSA缓冲液加入各管中。充分混匀后，在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤两次。

4. 免疫染色红细胞的固定

1. 在最后一次离心过程中，使用洗涤缓冲液 PBS-BSA 配制固定缓冲液，即按 1:100 比例稀释 37% 的甲醛溶液。
2. 用移液器吸取 450 μL 固定缓冲液，在涡旋振荡 5 秒的同时加入已免疫染色的红细胞管（来自步骤 3.13）中。
3. 将所有固定的细胞转移至 5 mL 圆底管中，并置于冰箱中保存。
   注意：本实验方案可在此处暂停，最长可暂停 48 小时。

5. 染色红细胞的流式细胞术分析

注意：建议参考流式细胞仪的操作手册（见材料表），以了解如何进行流式细胞检测。以下建议的参数适用于所使用的仪器，但必须针对每台流式细胞仪进行优化。

1. 打开流式细胞仪，然后开启计算机。让光学系统预热30分钟以使温度稳定。检查软件中的细胞仪窗口，确保细胞仪已连接到工作站（显示消息 细胞仪已连接）。
2. 检查缓冲液容器是否已装满，废液容器是否为空。使用排空系统清除缓冲液滤器和缓冲液管路中的气泡。按下细胞仪控制面板上的 启动流路 按钮，对流体系统进行预启动。等待指示灯由红色变为绿色。
3. 为清洗流路系统，将含有3 mL清洗液的试管安装在样品进样口，以高样品流速运行清洗液5分钟。随后用蒸馏水作为冲洗液重复此步骤。最后将装有水的试管保留在样品进样口。
4. 准备校准微珠时，用移液器将400 µL PBS加入圆底试管底部。将微珠储备液剧烈涡旋混匀30秒，取一滴加入含PBS的圆底试管中，再轻轻涡旋混匀30秒。
5. 运行性能检测。在软件中打开细胞仪的 设置与追踪 模块（图1A）。确认细胞仪配置适用于PE免疫染色实验，并核对校准微珠批次与配置一致。
6. 将微珠试管安装在样品进样口，以低样品流速运行。启动性能检测（约需5分钟完成）。检测完成后，确认细胞仪性能符合要求（图1B）。关闭软件中的细胞仪 设置与追踪 模块。
7. 设置实验并创建应用参数：点击浏览器工具栏上的 新建实验 按钮并打开新实验。通过下拉菜单选择合适的细胞仪参数：前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）和 PE（图1C）。FSC参数选择 线性模式，SSC和PE参数选择 对数模式。
8. 在打开的实验中，选择 细胞仪设置（图1D），然后选择 应用设置，并创建一个全局工作表（图1E）。使用灰色方框和十字线辅助优化设置。
9. 将未染色对照管加载至细胞仪并运行 采集。通过优化FSC和SSC电压，确保目标细胞群（即红细胞）位于量程范围内。优化FSC阈值，以去除碎片信号，同时不干扰目标细胞群。
10. 在FSC与SSC散点图上围绕红细胞绘制门控。在PE荧光点图中显示红细胞群。如有需要，提高光电倍增管（PMT）电压，使阴性群体落在灰色方框内。完成后从细胞仪卸下未染色对照管。
11. 确认阳性群体处于量程范围内。将染色对照管加载至细胞仪并运行 采集。若阳性群体超出量程，降低PMT电压，直至阳性群体完全显示在量程内。然后卸下染色样本。
12. 为记录和分析样本，在新的全局工作表中创建以下用于预览数据的图表：1）FSC vs. SSC散点图，2）PE荧光直方图。将第一个样本加载至细胞仪并运行 采集。
13. 在FSC与SSC散点图上围绕红细胞绘制门控。在PE荧光直方图中显示红细胞群。在 统计 视图中，选择GR细胞群PE荧光参数的均值（图1F）。
14. 在 采集 仪表板中，选择停止门控中的所有事件，并设定记录10,000个事件（图1G）。点击 记录数据。事件记录完成后，从细胞仪中移除第一根试管。全局工作表中的图表应与 图2 所示一致。
15. 加载后续样本并依次记录。

6. 红细胞CR1密度的测定

1. 取对应样本的平均荧光强度值 "低" 受试者（图3, 表 I，红细胞MFI）， "培养基" 受试者（图4, 表 D，红细胞MFI）， "高" 受试者（图4, 表 I，红细胞MFI）以及阴性对照样本（图3, 表 I，红细胞MFI）。
2. 在以平均荧光强度为纵坐标、CR1 密度为横坐标的图上，标出对应于阴性对照的四个数据点， "低" 受试者， "培养基" 受试者，以及 "高" 受试者（蓝色点， 图6).
3. 绘制回归线以获得校准线及其方程。
4. 取对应于待测定密度的受试者样本的平均荧光强度值。图5, 表 D 和表 I，红细胞MFI）。
5. 通过替换得到方程 "Y" 利用平均荧光强度值，计算CR1/E的密度图6).
6. 检查图表，确认平均荧光强度值和测定的CR1/E密度对应于校准线上的一个点（图6).

结果

已知CR1密度的三位受试者（“低”密度受试者[180 CR1/E]、“中”密度受试者[646 CR1/E]和“高”密度受试者[966 CR1/E]）以及另两位需测定CR1密度的受试者的红细胞，采用与藻红蛋白荧光染料偶联的抗CR1抗体进行免疫染色。最初，通过Scatchard方法²⁹使用放射性标记抗体测定低至高范围受试者的CR1密度。由此确定的标准品（低、中、高）用于绘制标准曲线，使我们可通过流式细胞术方法³⁰对新的标准品或次级标准品进行定量。将免疫染色后的红细胞通过流式细胞仪检测后，观察并测量每位受试者的平均荧光强度（RBC MFI）（图3F、I；图4B、D、F、I；图5B、D、F<...

讨论

目前有多种技术可用于测定红细胞CR1的密度（CR1/E）。最早采用的技术包括抗CR1抗体介导的红细胞凝集³¹以及在C3b包被的红细胞存在下形成花环结构³²。这些原始技术很快被使用放射性标记抗CR1抗体的免疫染色方法所取代^1,33。此外，也可通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测膜提取物中CR1的浓度³⁴。尽管这些方法准确，但仅能提供CR1/E密度的平均值。只有通过免疫染色后进行流式细胞术分析，才能获得整个红细胞群体中CR1/E密度的分布情况。由于CR1/E密度较低，该技术实施较为困难。然而，目前已有扩增方法可简便地测定CR1/E密度³⁰。

本文介绍一种基于免疫染色细胞荧光信号放大技术，通过流式细胞术定量CR1/E的方法。该信号放大系统采用连续四层染色步骤：首先使用生物素化的抗C...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000E 防污染吸头	赛默飞世尔科技，法国伊尔基什-格拉芬什塔登，邮编：F-67403	2079E	样品移液
1-100 µL 型斜面滤芯吸头	Starlab GmbH，德国阿伦斯堡，D-22926	S1120-1840	样品移液
生物素标记的抗CR1单克隆抗体（J3D3）	非商业性单克隆抗体的实验室制备，由 J. Cook 博士提供		免疫染色
上衣			保护
牛血清白蛋白（7.5%）	Thermo Fischer Scientific ，F-67403 伊尔基什，法国	15260037	流式细胞术
离心	赛默飞世尔科技公司，法国伊尔基什-格拉芬什塔登，邮编：F-67403	11176917	离心
清洁溶液	法国勒庞德克莱克斯，BD，邮编 38801	340345	流式细胞术
Comorack-96	Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172	944060P	架子
细胞仪设置 & 追踪微球试剂盒	法国，勒蓬德克莱，BD，邮编：F-38801	655051	流式细胞术
36.5% 甲醛溶液	Sigma Aldrich，法国圣康坦法拉维耶，F-38070	F8775-25ML	固定
10 µL刻度，带滤芯吸头	Starlab GmbH，德国阿伦斯堡，D-22926	S1121-3810	样品移液
LSRFORTESSA 流式细胞仪	法国，勒蓬德克莱，BD，邮编：F-38801	647788	流式细胞术
微控毛细管活塞	Dominique DUTSCHER SAS，法国弗鲁马 67172	067494	样品移液
Micronic 1.40 mL 圆底管	Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172	MP32051	混合
微量移液器 Microman - 型号 M25 -	Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172	066379	样品移液
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技，法国伊尔基什-格拉芬什塔登，邮编：F-67403	10010031	流式细胞术
移液管 PS 325 mm，10 mL	Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172	391952	样品移液
无粉丁腈检查手套	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, 美国	486802	样本保护
参考2号移液器，0.5-10 µL	Eppendorf France SAS，法国蒙特松，78360	4920000024	样品移液
参考2号移液器，20-100 µL	Eppendorf France SAS，法国蒙特松，78360	4920000059	样品移液
参考2号移液器，100-1000 µL	Eppendorf France SAS，法国蒙特松，F-78360	4920000083	样品移液
冲洗液	法国，勒庞德克莱，BD，邮编：F-38801	340346	流式细胞术
圆底试管	Sarstedt，F-70150 Marnay，法国	55.1579	流式细胞术
安全锁扣管，1.5 mL	Eppendorf France SAS，法国蒙特松，78360	0030120086	混合
链霉亲和素-R-藻红蛋白	Tebu Bio，法国勒佩赖-昂伊夫林，78612	AS-60669	免疫染色
锥形离心管 50 mL	赛默飞世尔科技公司，法国伊尔基什-格拉芬斯塔登，邮编 F-67403	10203001	混合
抗链霉亲和素生物素化载体	Eurobio Ingen，法国莱于利斯，91953	BA-0500	免疫染色
Vortex-Genie 2	美国纽约州博伊米亚，科学工业公司，邮编 111716	SI-0236	混合