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方法文章

工程化心脏组织中后负荷的磁力调节

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DOI：

10.3791/60811

⸱

2020年5月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Experimental Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了基于磁力的工程化心肌组织后负荷调节平台的构建与实施的详细方法。

摘要

后负荷已知可驱动生理性与病理性心脏状态的发展。因此，研究后负荷改变状态下的结果，可能为控制这些关键过程的机制提供重要见解。然而，目前尚缺乏一种能够在时间进程中对心脏组织后负荷进行精确微调的实验技术。本文介绍了一种新开发的基于磁力的技术，用于在工程化心脏组织（EHTs）中实现这种控制。为了制备具有磁响应性的EHTs（MR-EHTs），将组织安装在中空硅胶支柱上，其中部分支柱内含有小型永磁体。另一组永磁体被压入丙烯酸板中，使其具有相同极性，并与支柱上的磁体轴向对齐。为了调节后负荷，使用配备编码器的压电平台将该磁体板向支柱磁体方向移动（增加后负荷）或远离（降低后负荷）。用于调节平台位置的运动控制软件可实现用户自定义的后负荷方案，而编码器则确保平台能校正其位置中的任何不一致性。本研究描述了该系统的制造、校准与实施方法，以促进全球其他实验室开发类似平台。文中还包含了两个独立实验的代表性结果，用以示例该系统可支持的多种不同类型研究的范围。

引言

后负荷是指心室开始射血后所承受的收缩期负荷1。在心脏发育过程中，适当的后负荷对心肌细胞的成熟至关重要2。在成年期，心室后负荷过低（例如，高位脊髓损伤导致长期卧床的患者3，或在航天飞行等特殊情况下4）可导致心脏萎缩。相反，后负荷过高则可引起心脏肥厚5。尽管耐力运动员或孕妇出现的心脏肥厚被认为是良性且具有生理适应性的，但与长期动脉高血压或严重主动脉瓣狭窄相关的心脏肥厚则有害，因其易导致心律失常和心力衰竭6。尽管心力衰竭患者的5年死亡率已从20世纪80年代的约70%6下降至目前的40–50%7，但对于这种高发疾病（目前西方国家人群患病率为2.2%）8，仍迫切需要新的治疗手段。

为了研究病理性心脏肥厚的分子机制，并测试预防或治疗该疾病的策略，已开发出用于模拟后负荷的体内模型9,10,11,12。尽管这些模型为后负荷对心室功能的影响提供了有益的见解，但它们无法精确控制后负荷的大小。相比之下，在离体心脏和肌肉组织上进行的体外后负荷研究能够更精确地控制组织负荷，但这些模型不适用于长期的纵向研究13,14,15。

为克服这些问题，我们开发了一种在工程化心肌组织（EHTs）中模拟后负荷升高的体外模型16,17。该模型采用三维培养体系，将大鼠心肌细胞包埋于纤维蛋白基质中，并将其悬置于两个柔性的中空硅胶支柱之间。这些组织可自发搏动（对抗硅胶支柱的阻力），并完成辅助张力性做功。在前期实验中，我们通过在中空硅胶支柱内插入刚性金属支架一周，使施加于EHTs的后负荷增加至原来的12倍。这引发了一系列变化，具有病理性心肌肥厚的典型特征18,19,20：心肌细胞肥大、部分坏死性凋亡、收缩力下降、组织舒张功能受损、胎儿基因程序重新激活、代谢由脂肪酸氧化转向无氧糖酵解，以及纤维化程度增加。尽管该方法已在多项研究中成功应用17,21,22，但仍存在一些缺点：仅有低后负荷和极高后负荷（12倍）两种状态，且操作过程需要人工处理EHTs，限制了时间上的灵活性，并增加了污染风险。

最近，Leonard 等人采用了一种类似的技术，通过在硅胶柱上培养工程化心脏组织（EHT）来调节后负荷23。他们在柱子外侧安装了不同长度的支架，以限制柱子的弯曲运动。该研究的作者报告称，轻度至中度的单一后负荷增加可增强人诱导多能干细胞来源的 EHT 的力量生成和成熟，而过高的负荷则导致病理状态。然而，与我们自己的系统类似，该技术仅允许进行一次性的后负荷增加，且增加幅度由支架的长度决定。因此，这些技术无法实现对后负荷的精细调节、随时间变化的后负荷调整以及精确的负荷方案控制。

本文提供了一种可用于通过磁场调节工程化心肌组织（EHT）后负荷（即收缩后负荷）的系统操作方案24。该平台可实现对后负荷的精细调控，支持用户自定义后负荷程序，并确保EHT的无菌性。

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方案

1. 后负荷调节平台的制备

注意：本方案中此部分所涉及的步骤无时间敏感性。

  1. 制造磁响应硅胶支架
    注意：    这些支架用作工程化心脏组织（EHT）的培养平台。每个EHT悬挂在两个硅胶柱之间，这些柱为组织提供后负荷。后负荷的大小与柱的刚度直接相关。为了实现磁控后负荷调节，部分柱需具备磁响应性。
    1. 获取适用于24孔板的硅胶柱支架（尺寸见补充图1）。本研究中使用的支架由商业硅胶制品供应商根据上述尺寸，采用邵氏硬度为40的硅胶材料制成。
    2. 通过将小磁体（例如，直径 d = 0.5 mm，高度 h = 2.0 mm；参见材料表）放置在较大的永磁体上，确定其极性。
    3. 保持固定极性，用水润滑磁体，并逐个将其插入硅胶支架最外侧的柱中。
      注意：若尝试同时插入多个磁体，额外的阻力将使磁体更难推至柱底。
    4. 使用钝头不锈钢牙科丝（直径 ≈ 0.4 mm，参见材料表）小心地将磁体推至中空柱腔底部。每个柱中最多可堆叠五个磁体。
    5. 使用（尖嘴）钳子将不锈钢牙科丝（直径 ≈ 0.4 mm，参见材料表）弯成宽11.25 mm、长15 mm的夹具。使用线剪切断夹具，并用锉刀打磨切口表面。为确保尺寸准确，可使用自制夹具辅助弯丝。
      注意：只要材料无磁性且刚性足够，也可使用其他材料制作夹具以实现柱的固定。
    6. 用水润滑夹具，并将其插入硅胶支架中，从而固定最外侧第二根和第三根柱（完整硅胶支架结构见图1）。
      注意：可选步骤：为使对照柱的基线刚度与磁响应柱相匹配，可将苯乙烯圆棒碎片（参见材料表）插入空柱中（即无夹具或磁体的柱）。
    7. 让支架静置1–2天，使残留水分自然风干。
    8. 待柱体干燥后，用一滴硅胶粘合剂密封含磁体的中空硅胶柱顶部的孔洞。
  2. 后负荷调节装置
    注意：    当后负荷调节装置中的磁体向硅胶柱内的磁体靠近或远离时，磁吸引力相应增强或减弱，从而改变硅胶柱的刚度。该运动通过压电平台实现。由于该后负荷调节装置为原型设备，此处不提供详细的逐歩复制说明，而是提供构建类似装置的一般性指导。
    1. 获取高精度压电直线电机，以实现磁体板相对于EHT的垂直移动（参见材料表）。
      注意：建议为该电机配备线性编码器，以校正平台定位。
    2. 将一组永磁体置于非磁性支架内，使其在位于EHT正下方时与硅胶柱中的磁体轴向对齐。本研究中，将大尺寸圆柱形磁体（直径 d = 13 mm，高度 h = 14 mm；参见材料表）压入丙烯酸塑料板（“磁体板”）中。
    3. 使用非磁性材料将磁体支架固定在压电平台上。可通过铝制L形连接件实现（见图2）。
    4. 构建一个可容纳后负荷调节装置各组件的框架。该结构至少应包含用于垂直安装压电平台的位置，以及用于放置24孔板的刚性框架。
      注意：建议该安装位置可在水平面内调节，以便调整两组磁体之间的轴向对齐。本系统采用机械驱动系统实现此可调性（图3）。此处描述的后负荷调节装置设计为与EHT收缩力分析系统兼容（参见材料表），因此其尺寸限制为宽29 cm、深29 cm、高16 cm，以适配该系统。
    5. 为便于对组织进行可视化分析，在后负荷调节装置内安装光源。本研究中采用LED阵列（图4）从下方照亮EHT（图5）。
  3. 后负荷调节系统的校准
    注意：    为精确将EHT的后负荷调节至目标值，需确定磁体间距与柱刚度之间的关系。
    1. 测量实验装置中磁体可实现的最近（dmin）和最远（dmax）间距。这些距离将决定可实现的最大和最小后负荷。
      注意：培养板底部会阻止磁体板与磁响应硅胶柱直接接触。
    2. 制备一系列非磁性砝码，并用细线悬挂，作为测试负载。
    3. 使用精密天平测定测试负载的质量，并据此标记。本研究中使用了六种不同质量的有机玻璃砝码，质量范围为30 mg至200 mg。
      注意：所选砝码应足够重以使柱发生弯曲，但又不能过重导致弯曲超过几毫米。使用更多数量的测试负载可提高校准精度，但也会增加耗时。
    4. 使用非磁性材料将一个硅胶支架垂直固定，使磁响应硅胶柱呈水平方向。
    5. 将一个板上磁体（“校准磁体”）安装在水平移动的直线平台上，使其与磁响应硅胶柱轴向对齐。
    6. 通过水平平台将校准磁体置于距磁响应硅胶柱的特定距离处（建议从后负荷调节装置可实现的最大磁体间距开始）。
    7. 在装置侧面放置一台相机（示例见材料表），以便光学记录测试负载作用下柱的偏转情况。
      注意：建议使用分辨率至少为200万像素的相机，以确保准确测定柱的偏转量。
    8. 在无任何负载的情况下拍摄柱的照片，作为柱“中性”位置的参考。
    9. 保持相机视角不变，将其中一个负载连接至硅胶柱末端，并拍摄柱在重力作用下弯曲的照片。
    10. 对所有砝码重复上述测量。
    11. 通过光学方法测定每个测试砝码重力引起的硅胶柱偏转量。
    12. 绘制硅胶柱偏转量（x，横轴）与各测试砝码重力（mg，纵轴）的关系图。应得到力与偏转之间的线性关系。
      注意：若数据呈非线性，可能表明柱已超出其线性偏转范围，即所用砝码过重。
    13. 绘制一条通过原点（0,0）和实测数据点的线性回归函数（示例见图6A）。该函数的斜率（mg = kx）即为在测试磁体间距下磁响应硅胶柱的刚度k。
    14. 在dmax与dmin之间的多个间距下重复上述步骤。本研究中分析了约31 mm至约5 mm范围内九个不同磁体位置的偏转情况。
    15. 使用相同技术测定无校准磁体时磁响应硅胶柱的基础刚度。
    16. 同样使用该技术测定可移动的非磁性对照柱的刚度。
    17. 将所得k值对相应的磁体距离作图，应呈现负指数关系。
    18. 对这些数据点拟合回归函数。例如，在分析软件中使用非线性拟合 | 单相衰减函数（参见材料表）。该回归函数描述了磁体间距与后负荷之间的关系（示例见图6B）。

2. EHT 的生成与培养

注意： EHT 的生成与培养已在另一篇文章中进行了详细描述25。因此，本实验方案中仅对这些方面进行简要说明。请在无菌条件下操作，并遵循良好的细胞培养规范。

  1. EHT 的制备
    1. 将先前制备好的硅胶支架浸入装有 70% 乙醇的容器中，至少浸泡 20 分钟。
      注意：请勿通过高压灭菌对可调节后负荷的硅胶柱进行灭菌，高温可能损坏其中的永久磁铁。
    2. 将该容器移入生物安全柜中，用无菌水冲洗支架 2 次，并使其自然晾干。
      注意：为降低污染风险，此操作应在后续用于浇铸 EHT 的同一生物安全柜中进行。
    3. 获取新生大鼠心室细胞或人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心肌细胞（可选市售产品，必要时进行解冻），并根据表 1配制 EHT 重悬混合液。
    4. 用移液器将 1.5 mL 温热的 2% 琼脂糖溶液加入 24 孔培养板最左侧的 4 个孔中，并立即将聚四氟乙烯（PTFE）间隔物（见材料表）插入液态琼脂糖溶液中。
    5. 对培养板中剩余的 20 个孔重复上一步操作。
    6. 待琼脂糖凝固约 10 分钟后，小心移除 PTFE 间隔物。
      注意：琼脂糖凝固后会变得浑浊。
    7. 将磁敏感硅胶支架的支柱插入由 PTFE 间隔物在琼脂糖中形成的空腔内。
    8. 将 100 μL 重悬混合液加入含 3 μL 100 mU/L 凝血酶溶液的离心管中。上下吹打混匀 2 次，迅速将混合液转移至培养板中第一个琼脂糖模具的空腔内。
    9. 对剩余的 23 个模具重复上一步操作，每个 EHT 使用新的移液器吸头。
      注意：每制备 6–8 个 EHT 后，应轻轻混匀重悬混合液，以防止细胞沉降。
    10. 将 24 孔板置于培养箱中（37 °C，7% CO2，40% O2）孵育 90 分钟。在此期间，通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 马血清、1% 青霉素/链霉素、10 μg/mL 胰岛素和 33 µg/mL 抑肽酶，配制 EHT 培养基。
    11. 向每孔中加入 500 μL 温热的 EHT 培养基。
    12. 将 24 孔板置于培养箱中（37 °C，7% CO2，40% O2）孵育 30 分钟。在此期间，准备另一块 24 孔板，每孔加入 1.5 mL EHT 培养基，并将其放入培养箱中预热。
    13. 小心地将带有新浇铸 EHT 的磁敏感硅胶支架从琼脂糖模具中取出，转移至第二块 24 孔板中。
  2. EHT 培养
    注意：    组织浇铸完成后，每周更换培养基三次：分别在周一、周三和周五进行。
    1. 更换培养基时，向新的 24 孔培养板中每孔加入 1.5 mL 新鲜 EHT 培养基，并将该板置于 37 °C、7% CO2、40% O2 的培养箱中至少 30 分钟。
    2. 在细胞培养操作台中，将硅胶支架从旧的 24 孔板转移至新板中。
    3. 将封闭的 EHT 培养板置于 37 °C、7% CO2、40% O2 的培养箱中培养。

3. 后负荷调节实验

注意：以下实验方案步骤仅适用于材料表中所列的压电马达和光学收缩力分析平台。

  1. 准备用于实验的后负荷调节装置
    1. 为测量后负荷调节对EHT收缩力的影响，需从光学收缩力分析平台最内层隔间中断开并移除照明系统，然后插入包含光源的后负荷调节装置。
    2. 安装载物台运动控制软件（参见 材料表) 在将用于运行后负荷调节装置的计算机上。
    3. 将压电平台电机连接至运动控制器（参见 材料清单），并将运动控制器连接到计算机。确保运动控制器也已连接至电源。
      注意： 运动控制器面板上有两个指示灯。接通电源后，两个灯会同时闪烁红光数秒。在正常运行期间，上方的指示灯保持绿色，下方的指示灯仅在发生错误时变为红色。
    4. 将一个空的24孔培养板放置在后负荷调节装置顶部的板架上。
    5. 使用安装在支架上的XY机械驱动系统，将空的培养板与下方的磁板进行光学对齐。
  2. 操作后负荷调节装置
    1. 启动运动控制器平台软件。
    2. 将软件连接到压电平台电机，方法是在运动控制软件安装过程中选择指定为平台端口的端口，然后单击 开放端口 按钮
      注意： 完成此步骤后，端口应显示为“开启”状态，并以绿色方框标示。
    3. 前往 系统 面板。选择 开环 在 环 下拉菜单
    4. 手动将磁板移至最高位置，即磁铁间距最小的位置 d分钟磁板应与培养板支架接触。
    5. 前往 运动 面板。单击 零 将压电平台当前位置重置为 0 mm 的按钮。
    6. 手动将磁板移至其可能的最低位置。记录编码器位置（在显示屏中指示的） 运动 面板由 封以确定压电平台电机的运动范围。
    7. 设定 行程限制 在 系统 将挡板调整至前一步骤确定的运动范围内的数值，以防止磁力板碰撞到培养板或后负荷调节装置的底部。
    8. 再次将磁力板移至最高位置并点击 零 按钮
    9. 前往系统面板并将反馈回路模式更改为 闭环这样做可确保载物台能够校正其定位过程中的任何误差。
    10. 点击 保存 按钮在 保存参数 用于在系统中存储这些设置的盒子。
    11. 将含有EHTs的24孔培养板放置于培养板支架上的磁性响应硅胶架中。
    12. 为计算实现特定后负荷所需的磁铁间距，需对步骤1.3.19中的非线性回归函数求解磁铁间距参数。 d例如，如果方程为： 数据转换公式：d = -4.95 ln((k-2.90)/24.34)，数学分析。, d 实现所需后负荷所需的磁铁间距（单位：mm） k 以 mN/mm 为单位，要达到 5 mN/mm 的后负荷，需要 12.12 mm 的磁铁间距。
    13. 减去 d分钟 由计算得出的磁体间距 d. 结果是磁板需要移动的距离 零 调整至所需的后负荷水平。
    14. 将该值输入到 目标位置 1 输入字段中的 运动 面板并单击 开始 以调节EHTs的后负荷至计算值。
  3. 可选：为间歇性后负荷方案编程载物台
    注意：     上一节介绍了如何对载物台进行编程，使其移动到并保持在单一位置。然而，还可以将不同的指令串联成一个程序，以实现自动执行的一系列运动，该程序可被设置为连续循环重复运行。有关运动控制器平台软件的更详细说明，请参阅载物台制造商提供的操作手册。
    1. 在按照前一节所述设置好后负荷调节装置后，打开 指令 面板。输入命令 1PGM1 并按压 输入 开始录制程序。
    2. 创建一个程序，例如，使压电载物台从当前位置向下移动 30 mm 零 位置（远离EHTs）并在40秒后返回，输入以下命令序列： 1MVA30 → 1WST → 1WTM40000 → 1MVA0 → 1WST
    3. 使用命令 1END 结束录制程序并保存。
    4. 使用命令 1EXC1 执行已记录的程序。
    5. 为使程序持续循环运行，请输入 1PGL1，随后是 1EXC1 命令
    6. 要终止一个循环程序，请输入命令 1EST.
      注：表2 包含一些用于后负荷调节实验的有用指令。有关该系统的全部可用指令列表，可参见模块化运动控制系统参考手册。

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结果

磁性微柱刚度的定量分析
将一个水平取向的磁响应性硅胶微柱固定在特定位置，并将一个轴向对齐的校准磁体置于该微柱若干已知距离（“磁体间距”）处。在硅胶微柱末端悬挂已知重量的测试负载，使其发生弯曲。该弯曲程度通过光学方法进行量化。在所有磁体间距下，测试负载的重力与微柱弯曲程度之间均呈现线性关系（图6A）。由这些线性关系得出的刚度值随磁体间距的增加呈负指数趋势变化（图6B）。

逐步增加后负荷
源自大鼠心脏的对照组和磁响应性工程化心脏组织（MR-EHTs）在无磁性后负荷条件下培养（对照组组织为 0.6 mN/mm，MR-EHTs 为 0.91 mN/mm），直至收缩力达到平台期。在此时间点（EHT 成型后第 24 天），MR-EHTs 与对照组 EHTs 的平均收缩力相近（分别为 0.29 mN 与 0.22 mN）。在随后的一周内，对 MR-EHTs 施加的后负荷从 0.91 逐步增加至 ...

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讨论

本文所述方案介绍了一种利用磁场改变工程化心肌组织后负荷的新技术。该技术依赖压电平台，将强磁铁板朝向或远离具有磁响应性的硅胶微柱支架进行移动。两组磁铁之间的距离越近，培养于其上的工程化心肌组织所承受的后负荷就越强。

该系统的成功制备和使用涉及多个关键步骤。在制备磁响应型硅胶支架时，至关重要的是确保所有柱体内的磁体均以相同的极性方向排列。若某一磁体被反向放置，则会削弱而非增强磁场强度。同样，该极性必须与磁板内所有磁体的极性一致，否则两组磁体会相互排斥而非相互吸引。此外，应尽可能避免在后负荷调节装置的构建中使用磁性材料，因其可能干扰磁场。出于这一原因，建议主要采用铝作为构建材料。类似地，如果使用的压电平台不同于材料表中列出的型号，则需确保其具有抗磁性，并能耐受标准细胞培养条件（例如 37 °C、100% 湿度以及高浓度 CO2 和 O2）。最后需注意，大多数压电线性平台设计为水平安装，因其通常承载能力较低。因此，若磁板重量超过该承载能力，应使用配重来减轻电机负荷。

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披露

TE 和 MNH 是 EHT Technologies GmbH 的联合创始人。其余所有作者均无任何利益冲突披露。

致谢

作者感谢 Jutta Starbatty 在组织培养工作中的支持，Axel Kirchhof 提供的摄影帮助，Alice Casagrande Cesconetto 的编辑工作，以及特别感谢 Bülent Aksehirlioglu 在本装置开发过程中提供的技术支持。B.B. 获得了德国心血管研究中心（DZHK）学者基金的资助，M.L.R. 获得了惠特克国际博士后学者基金的资助，M.N.H. 的研究资金来自 DZHK。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
圆柱形板状磁铁HKCM9962-55184h = 14 mm, d = 13 mm
圆柱形柱状磁铁HKCM9962-63571h = 2 mm, d = 0.5 mm
牙科金属丝Ormco266-1316d = 0.016 英寸 (0.406 mm)
GraphPadGraphPad Software, La Jolla, California, USAWindows 版本 6.00
压电电机运动控制软件Micronix USA可在制造商官网免费下载
压电电机运动控制器Micronix USAMMC-100-01000
光学收缩性分析平台EHT technologiesA0001
压电直线电机Micronix USAPPS-20-15206配备线性光学编码器，适用于培养箱环境
聚苯乙烯棒PlastructMR-15d = 0.015 英寸 (0.381 mm)
USB 摄像头Reichelt ElektronikREFLECTA 66142

参考文献

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