人工泪液配方对干燥暴露后人角膜上皮细胞代谢活性的影响

摘要

本实验方案的目的是利用体外模型评估不同人工泪液配方是否能够保护人角膜上皮细胞免受干燥损伤。在暴露于人工泪液配方并经历干燥处理后，检测人角膜上皮细胞的代谢活性。

摘要

人工含脂质的泪液制剂旨在通过修复受损的泪膜脂质层来减少泪液蒸发。能够防止细胞脱水的人工泪液制剂可保护眼表并维持细胞的代谢活性。在脱水过程中，细胞会经历代谢活性丧失，进而导致细胞死亡。本研究描述了一种评估人工泪液制剂有效性的方法。代谢染料（即alamarBlue）在活细胞中由低荧光的刃天青（resazurin）转化为高荧光的羟基刃天青（resorufin）。人工泪液制剂的生物学性能通过其（a）维持细胞活力和（b）保护细胞免受脱水的能力来衡量。实验中以培养基和生理盐水作为细胞活力/脱水测试的对照。细胞与待测溶液孵育30分钟，随后在37 °C、相对湿度45%的条件下脱水0或5分钟。之后测定细胞在初始暴露后以及脱水后的代谢活性。结果展示了不同滴眼液制剂对细胞代谢活性及脱水保护作用的比较效果。该方法可用于测试针对蒸发过强型干眼症患者设计的干眼治疗制剂。

引言

多剂量滴眼液中含有多种成分，用于维持其稳定性、pH值、渗透压和疗效。然而，某些化学物质（如滴眼液中的防腐剂或表面活性剂）可能对角膜上皮造成损伤^1,2。可通过使用人角膜上皮细胞（HCEC）进行细胞活力检测，评估这些不同成分在眼科制剂中可能造成的损害。其中一种特别适用于评估细胞损伤的体外检测方法是alamarBlue检测法³。该检测法所用的代谢染料（即alamarBlue）含有刃天青（resazurin），可作为细胞活力的指示剂。在细胞呼吸过程中，刃天青通过接受电子被还原为羟基荧光素（resorufin）⁴。羟基荧光素的还原过程使其从非荧光分子转变为荧光分子，可通过荧光分光光度计检测到该变化⁵。

本研究采用两种不同的处理方法作用于角膜上皮细胞，以评估干眼症产品在体外模型中的表现。在首次评估中，细胞经这些产品处理30分钟。处理后，立即检测细胞在接触干眼症产品后的代谢活性，并在一定恢复时间后再次检测。该评估用于确定这些产品在湿度控制箱中进行干燥处理前对细胞的影响。这些溶液中的防腐剂、表面活性剂或缓冲剂可能对细胞产生一定的细胞毒性作用，可通过代谢染料检测到此类效应。

第二次评估旨在测定细胞在接触干眼症产品并经历干燥处理后的代谢活性。在此评估中，如果产品处理能够保护细胞免受干燥损伤，则细胞的代谢活性将得以维持。若干眼症产品能够以脂质包覆细胞，或从周围环境中吸收液体为细胞补充水分，则可能实现对细胞有害干燥效应的防护。

本实验方案旨在模拟环境压力对细胞造成的严苛条件。其他研究曾采用多种模型来制造此类外部压力。一些研究在层流罩中对细胞进行干燥处理^6,7,8，而另一些研究则采用室温及不同相对湿度（RH）条件^9,10,11。模拟干眼条件的一种方法是提高培养液的渗透压^12,13。另一种用于模拟不利环境条件的体外方法是在细胞培养基中添加细胞因子，以模拟干眼患者泪液的成分¹⁴。尽管这些检测方法作为评估化学物质如何减轻渗透压压力或刺激免疫系统的模型具有研究价值，但这些模型无法直接反映化学配方在防止细胞脱水损伤方面所提供的保护作用。

干燥模型采用温度/湿度箱，条件为37 °C和45%相对湿度（RH）。该模型可模拟可导致眼表液体蒸发的环境条件。利用此方法也可模拟其他极端环境条件，例如飞机舱内常见的低湿度¹⁵或冬季室内环境中的低湿度¹⁶。

细胞培养模型用于模拟干燥应激对人角膜的影响。为了检测细胞应激，需进行细胞活力检测，以评估其对细胞健康的影响。可对细胞执行多种不同的生理学检测，以判断其是否处于应激状态¹⁷。本检测方法采用一种市售的代谢染料（材料表），相较于其他多种细胞应激检测方法，其优势在于无毒性、可溶于培养基，并可在无需固定细胞的情况下对细胞进行评估¹⁸。在本实验中，细胞在每次处理后立即检测其代谢活性，另一组细胞则重新放入培养基中，经过18小时恢复后再进行评估。立即检测以及恢复期后检测的目的在于识别导致代谢活性即时变化的细胞损伤和引起延迟效应的细胞损伤。此外，该方法还可用于评估这些制剂对短期与长期损伤的影响，以及细胞在初始损伤后能否恢复或无法恢复的能力。

本研究旨在比较不同含脂质的干眼症产品在有无干燥条件下对人角膜上皮细胞（HCEC）代谢活性的影响。所测试干眼症产品的成分详见材料表。溶液#1的成分为羧甲基纤维素钠（0.5%）、甘油（1%）和聚山梨酯80（0.5%）；溶液#2的成分为轻质矿物油（1.0%）和矿物油（4.5%）；溶液#3中脂质为矿物油，润肤成分为丙二醇。这些脂质是预期可保护HCEC免受干燥损伤的配方组分。

方案

1. 人角膜上皮细胞培养

1. 在胶原蛋白包被的75 cm²培养瓶中，加入20 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12），于37 °C、5% CO₂条件下培养永生化HCEC¹⁹细胞。
   注意：无需振荡。
2. 每2−3天更换一次培养基。

2. 测试用细胞的制备

1. 当细胞接近融合时，移除培养基。
2. 向每个 75 cm² 培养瓶中加入 4−6 mL 细胞解离液。在 37 °C 下孵育细胞，直至细胞脱落（约 20−30 分钟），期间定期在显微镜下观察。
3. 向每个 75 cm² 培养瓶中加入 2−6 mL 含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基。
4. 将培养瓶中的内容物转移至 50 mL 离心管中。
5. 以 450−500 × g 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，并将细胞重悬于预温的培养基中。
6. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。计算含有 1 × 10⁵ 个细胞的培养基体积。
7. 将 1 × 10⁵ 个细胞接种至 48 孔胶原蛋白-1 包被培养板的每孔中。加入足够量的培养基，使每孔终体积为 0.5 mL 含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基。
   注意：人工泪液配方可能引起细胞毒性，可通过 HCEC 代谢活性的降低来检测。数据的一致性依赖于接种时每孔加入相同数量的 HCEC。推荐用于 48 孔板的接种浓度为 1 × 10⁵。由于哺乳动物细胞在重悬后可能在离心管中沉降，建议在接种过程中频繁振荡重悬细胞，以确保细胞悬液中的 HCEC 分布均匀。
8. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。

3. 无干燥处理方案

1. 对照程序
   1. 孵育24小时后，从培养板中移除培养基。
   2. 立即向每孔加入150 µL待测制剂和培养基对照溶液。
   3. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟。
   4. 从细胞中移除待测溶液。
   5. 加入0.5 mL 10%代谢染料溶液，以检测细胞代谢活性。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育4小时。
   6. 4小时孵育结束后，从每个孔中移除100 µL代谢染料溶液，并将每100 µL转移至96孔板中的对应孔内。
   7. 使用荧光酶标仪（材料表）测定各孔的荧光强度。激发波长设为540 nm，发射波长设为590 nm。
2. 无干燥处理方案（恢复程序）
   1. 重复步骤3.1.1−3.1.4。
   2. 向每个孔中加入0.5 mL DMEM/F12培养基。
   3. 将一组培养物在37 °C、5% CO₂条件下孵育18小时。
   4. 移除培养基，加入0.5 mL 10%代谢染料溶液。重复步骤3.1.6和3.1.7。

4. 干燥处理方案

1. 对照程序
   1. 在 24 小时孵育后（步骤 2.8），从培养板中移除培养基。
   2. 立即加入 150 µL 待测制剂和培养基对照溶液。
   3. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
   4. 从细胞中移除待测溶液。
   5. 将细胞置于 37 °C 和 45% 相对湿度（RH）的环境中 5 分钟，以使细胞脱水。
   6. 向每孔加入 0.5 mL 10% 代谢染料溶液，以检测代谢活性。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下继续孵育 4 小时。
   7. 4 小时孵育结束后，从每个孔中取出 100 µL 代谢染料溶液，并将每份 100 µL 转移至 96 孔板中的对应孔内。
   8. 使用荧光酶标仪测定每个孔的荧光强度。激发波长设为 540 nm，发射波长设为 590 nm。
2. 恢复程序
   1. 重复步骤 4.1.1–4.1.5。
   2. 向每个孔中加入 0.5 mL DMEM/F12 培养基。
   3. 将一组培养物在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 18 小时。
   4. 移除培养基，加入 0.5 mL 10% 代谢染料溶液。重复步骤 4.1.7 和 4.1.8。

5. 数据分析

1. 计算培养基对照组的平均荧光值。使用以下公式计算样品的存活率：
   样品存活率 =（测试样品荧光值 / 培养基对照荧光值）× 100
   注意：培养基对照的平均值代表100%存活率。代谢染料本身具有微弱的本底荧光。在计算测试样品相对于培养基对照的存活率之前，可将代谢染料试剂的荧光值从对照组和测试样品的荧光值中扣除。
2. 对对照组和测试样品进行正态性检验以及方差齐性检验。
3. 如果通过正态性检验且方差齐性，则进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。为确定特定组之间的显著性差异，进行成对比较的事后检验（例如，Tukey 或 Dunnett 多重比较检验）。
4. 如果通过正态性检验但方差不齐，则进行Welch's ANOVA。为确定特定组之间的显著性差异，进行成对比较的事后检验（例如，Dunnett 或 Games-Howell 多重比较检验）。
5. 如果未通过正态性检验，则使用非参数检验方法（例如，Kruskal-Wallis 检验）。为确定特定组之间的显著性差异，进行成对比较的事后检验（例如，Dunn 检验）。

结果

三种干眼症制剂比较研究的结果如图1所示。该图显示，三种产品——溶液#1、溶液#2和溶液#3（材料表）对人角膜上皮细胞（HCEC）活力的影响存在差异。在干燥处理前，溶液#1和溶液#2对HCEC的代谢活性具有显著影响，表明这些产品中的配方成分可能干扰HCEC的代谢活性。暴露于溶液#1的细胞在经历18小时恢复后，其细胞代谢活性进一步下降，说明HCEC最初已受到损伤，且在18小时后该损伤未得到修复。相比之下，溶液#3对HCEC代谢活性的影响较轻微。

图2展示了含脂质的干眼症制剂对细胞保护作用的影响。在18小时恢复时间点，溶液#1和溶液#2处理组的HCEC代谢活性接近0%，表明其无法保护细胞免受干燥应激损伤。然而，溶液#3对干燥应激具有一定的保护作用。

图1：含脂质的干眼产品对细胞活力的影响。 通过HCEC代谢活性测定经含脂质干眼产品处理后的相对细胞活力。* = 与溶液#3相比具有统计学显著性（p < 0.05）；Δ = 与相应恢复时间段的培养基对照组相比具有统计学显著性（p < 0.05）。柱高表示均值，误差线表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：干眼症脂质增强产品对干燥保护的影响。 含脂质的干眼制剂对细胞保护作用的影响。溶液#1和溶液#2未能保护细胞免受干燥应激损伤，且细胞随时间推移未能从干燥效应中恢复。相比之下，溶液#3对干燥应激提供了一定程度的保护作用。* = p < 0.05，相对于溶液#3；Δ = p < 0.05，相对于未处理（对照）培养基在相应恢复时间的值。柱高表示平均值，误差线表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本实验方案旨在确定人工泪液对细胞干燥的保护作用。首先，将细胞暴露于干眼滴眼液中，以使细胞表面被覆盖。随后，对细胞进行干燥处理，并监测其代谢活性，以评估不同配方是否能够减轻干燥应激带来的不利影响。这些步骤对于理解干眼制剂对角膜上皮细胞总体存活能力可能产生的影响至关重要。

在大多数干眼症制剂从培养孔中移除后，残留并接触细胞的分子化学性质将影响细胞的脱水情况。一些产品含有可减少细胞蒸发的油类微乳液²⁰。一项在冲洗后评估摩擦力的分析研究表明，某些干眼症制剂能够维持较低的摩擦力，这可能表明这些制剂在眼部具有更长的滞留时间²¹。本实验方法的一个局限性在于，尽管可以比较不同滴眼液配方对脱水的保护效果，但由于所评估的干燥时间较短，无法确定该保护作用的持续时间。在本体外实验中若需更长的干燥时间，可能需要使用多层细胞培养模型，因其总体含水量高于单层细胞。

如果温度和湿度值发生变化，配方在细胞上的特定孵育时间以及干燥时间可能需要相应调整。由于季节性和局部环境条件变化较大，选择用于模拟可能导致干眼的环境应激条件（如温度、相对湿度和气流）较为困难²¹。现代用于人体研究的环境舱可将温度调节在5 °C至35 °C之间，相对湿度（RH）调节在5%至95%之间²²。通过使用蒸发计和紧密贴合的护目镜发现，当相对湿度为40−45%时，角膜表面的蒸发速率为0.037 µL/cm²/min，而在相对湿度为20−25%时，蒸发速率为0.065 µL/cm²/min²³。如果体外模型旨在评估配方在极低相对湿度环境（例如飞机舱内¹⁵、沙漠地区或干燥的室内环境¹⁶）下的保护作用，则可能需要缩短孵育时间，以适应细胞表面蒸发速率的增加。人泪液中含有多种来源于睑板腺及其他腺体的脂质，可防止泪液过度蒸发。这些脂质具有不同的熔点²⁴。温度变化可能影响泪液的流动性，因此在室温下进行的测试与在37 °C下进行的测试相比，其蒸发速率可能存在显著差异。鉴于眼表平均温度范围为32.9至36 °C²⁵，建议在接近该温度范围内进行实验。

除了本实验方案中使用的代谢染料（alamarBlue）外，还有其他化学试剂可用于评估产品配方对细胞代谢活性的影响。四氮唑盐类（MTT、XTT、MTS、WST）是可替代的化学物质。不同四氮唑盐之间的区别在于，MTT 是一种带正电荷的分子，因此能够进入活细胞的细胞质²⁶。MTT 被 NAD(P)H 还原后会变为不溶性物质²⁷，因此在使用酶标仪测定吸光度之前必须将其溶解。其他四氮唑盐则带负电荷²⁸，由于无法进入细胞并与细胞内分子直接相互作用，它们必须依赖细胞外的次级分子进行还原²⁹。对于 XTT、MTS 和 WST-1 检测，添加电子耦合剂 1-甲氧基吩嗪硫酸甲酯（PMS）可提高检测性能³⁰。相比之下，alamarBlue 无需额外的溶解剂或电子耦合剂。此外，与 XTT、MTS 或 WST-1 不同，alamarBlue 可穿透细胞膜，并可被细胞内的酶直接还原^27,29。alamarBlue 与四氮唑盐的直接比较研究表明，alamarBlue 在评估多种细胞系（包括 HCEC）的代谢活性方面更为敏感^3,27,31,32。

也可考虑其他生物化学终点，以评估干燥对人角膜上皮细胞的保护作用。可使用荧光染料检测细胞膜通透性和细胞酯酶活性¹。此外，可通过细胞表面凋亡标志物染色或检测caspase活性来评估细胞凋亡^1,33。其他检测方法已用于确定眼科产品对HCEC紧密连接的影响³⁴。这些检测方法可被纳入未来基于本文所述干燥程序的评估中。

干眼症有多种病因。干眼症可由泪液分泌减少、眼表炎症增加或眼表脱水加剧引起。对于患有蒸发过强型干眼症的个体，使用一种能够在干燥条件下防止细胞脱水的干眼滴眼液，可能有助于缓解干眼症状。某些干眼制剂存在的问题之一是含有防腐剂，这些成分可能对眼表造成损害。损伤细胞对干眼患者并无益处，因为受损细胞更易受到干燥应激的影响，从而导致更多细胞死亡³⁵。

Garrigue 等人最近发表的一篇综述文章³⁶评估了当前关于脂质类产物如何缓解蒸发性干眼症的知识。向脂质缺乏的泪液中添加脂质可防止水分蒸发，从而保护细胞免受干燥损伤。此外，保湿剂是一类能够吸引并保持眼表水分的分子³⁷。溶液 #1 中的甘油和溶液 #3 中的丙二醇均为保湿剂。溶液 #3 对人角膜上皮细胞（HCEC）表现出更强的保护作用，这可能归因于其配方成分的脂质和保湿剂特性。

本方案旨在评估人角膜上皮细胞（HCEC）在接触干眼症制剂及干燥应激后的代谢活性。通过采用本文所述方法，可为患有蒸发过强型干眼症的患者开发新型无刺激性且具有保护作用的眼药水。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
75 cm2 透气培养瓶	Corning	354485	此为 BioCoat 品牌胶原蛋白包被产品
96 孔板	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Corning 48 孔板	Corning	354505	此为 BioCoat 品牌胶原蛋白包被产品
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	可检测 280 - 700 nm 范围内的荧光信号（本实验使用 540/590 nm）
含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES 的 DMEM/F12 培养基	Gibco	11039-021	该培养基中不含酚红
胎牛血清	Hycone	SH30396.03
人角膜上皮细胞	渥太华大学	N/A	由加拿大渥太华眼科研究所 M. Griffith 博士提供的 SV40 永生化人角膜上皮细胞系，已进行表征：Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. 利用细胞系构建功能性人角膜等效物. Science. 1999;286:2169–72.
温湿度培养箱	Associated Environmental Systems	LH-1.5	经济型湿度培养箱
青霉素-链霉素溶液	Gibco	15140-122	为 100 倍浓缩液，每 99 ml 培养基中加入 1 ml
Refresh Optive Advanced（溶液 #1）	Allergan, Inc		羧甲基纤维素钠 (0.5%)、甘油 (1%)、聚山梨酯 80 (0.5%) — 润滑剂 — 非活性成分：硼酸、卡波姆共聚物 A 型、蓖麻油、赤藓醇、左旋肉碱、纯化水、Purite（稳定化氧氯复合物）；可能含有氢氧化钠以调节 pH 值。
Soothe XP（溶液 #2）	Bausch & Lomb		轻质矿物油 (1.0%)、矿物油 (4.5%) — 柔润剂 — 非活性成分：硼酸、乙二胺四乙酸二钠、辛苯聚醇-40、聚季铵盐-1（防腐剂）、聚山梨酯 80、纯化水、十水合硼酸钠。可能含有盐酸和/或氢氧化钠以调节 pH 值。
Systane Complete（溶液 #3）	Alcon Inc.		丙二醇 0.6% 润滑剂 — 非活性成分：硼酸、双肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、乙二胺四乙酸二钠、羟丙基瓜尔胶、矿物油、聚氧乙烯 40 硬脂酸酯、POLYQUAD®（聚季铵盐-1）0.001% 防腐剂、三硬脂酸山梨醇酐酯、山梨醇和纯化水。可能含有盐酸和/或氢氧化钠以调节 pH 值。
TrypLE Express（细胞解离溶液）	Fisher Scientific	12605036