本方案介绍了一种完整的、经过验证的由TNBS诱导的克罗恩病小鼠模型，以及利用免疫荧光法对石蜡包埋的甲醛固定结肠组织切片进行雌激素受体免疫组织化学可视化的实验方法。
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本文内容
摘要
摘要
克罗恩病是最常见的炎症性肠病类型。肠道内发生的慢性炎症可导致蠕动功能障碍和肠黏膜损伤，并可能与结肠新生物转化风险增加相关。越来越多的证据表明，雌激素及其受体不仅影响激素敏感性组织，还影响其他与雌激素无直接关联的组织，例如肺或结肠。本文描述了从三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的克罗恩病小鼠模型所获取的结肠组织中成功进行雌激素受体免疫荧光染色的实验方案。同时提供了小鼠克罗恩病诱导及肠道组织制备的详细步骤，以及使用福尔马林固定石蜡包埋肠道切片进行免疫组织化学染色的逐步操作流程。所述方法不仅适用于体内雌激素受体检测及雌激素信号通路的研究，也可推广应用于其他可能参与结肠炎发生发展的蛋白质研究。
引言
克罗恩病（CD）是一种炎症性肠病（IBD），表现为慢性肠道炎症。CD 的病因尚不明确，但已有研究表明其发病可能与肠道微生物群、遗传因素以及环境因素（如饮食或压力）等主要因素有关1。为了更好地理解克罗恩病的发病机制，研究人员已采用多种肠道炎症模型进行研究2,3,4,5,6,7。本文展示了利用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠 CD 模型所获得的研究结果。
已有文献记载，雌激素能够调节慢性肠道炎症8,9,10,11,12。雌激素的生物学活性由其特异性受体介导，其中包括核雌激素受体（ERs），即 ERα（基因 ....
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方案
动物实验是在获得地方伦理委员会（28/ŁB29/2016）同意后进行的，遵循欧洲议会和理事会2010年9月22日发布的2010/63/EU号指令以及机构建议。
1. TNBS诱导的小鼠克罗恩病模型
注意：本实验方案使用体重为 25–28 g 的雄性 BALB/C 小鼠。动物饲养在恒定温度（22–24 °C）、相对湿度为 55 ± 5% 的环境中，维持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环，可自由摄取标准颗粒饲料和自来水 ad libitum。
- 将小鼠放入诱导室并紧密关闭盖子。用异氟烷短暂麻醉小鼠（25% O2，O2 流速为 1.5–2 L/min）。
注意：呼吸频率应保持有节律且比正常情况更慢，且对有害刺激不应产生变化。 - 通过导管向远端结肠注入4 mg TNBS溶于0.1 mL 30%乙醇的0.9% NaCl溶液，或仅注入0.1 mL 30%乙醇的0.9% NaCl溶液作为溶剂对照。
注意：导管应小心插入肛门约3 cm深处。 - 从第2天至第8天每日监测小鼠的临床参数，包括体重、直肠出血、粪便性状及死亡率。
- 第8天通过颈椎脱位法处死小鼠。
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结果
三硝基苯磺酸诱导的克罗恩病小鼠结肠的宏观特征
对照组和三硝基苯磺酸（TNBS）处理组小鼠结肠的代表性图像见图2。在三硝基苯磺酸诱导的克罗恩病小鼠模型中，结肠长度缩短，而结肠宽度增加。
图2：来自对照组小鼠（对照）和TNBS处理小鼠（TNBS）的代表性结肠组织。
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讨论
目前存在多种用于研究炎症性肠病（IBD）病理生理学的动物模型，包括遗传性、免疫性或自发性模型，以及化学诱导模型15。在多种结肠炎动物模型中，化学诱导模型（例如本方案中描述的TNBS诱导模型）相对成本较低且易于建立。TNBS诱导的小鼠结肠炎模型具有与克罗恩病（CD）病理基础相关的多种临床症状。诱导性结肠炎动物表现为粪便形态不规则、血性腹泻以及体重减轻。然而，这并不意味着该模型仅适用于研究CD的病因和发病机制。TNBS诱导模型被推荐并广泛用于潜在治疗药物的筛选。在化学诱导性结肠炎模型中，某些关键点需要特别注意。TNBS必须用乙醇稀释，乙醇可破坏黏膜屏障，使TNBS穿透肠壁并与高分子量蛋白质结合，从而引发细胞介导的免疫反应2,16,17。TNBS的剂量和乙醇浓度应根据小鼠品系和体重进行优化。过高的TNBS剂量和乙醇浓度可能导致过高的死亡率，从而影响后续分析；而过低的TNBS剂量和乙醇浓度则可能导致反应不足，不必.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得益于罗兹大学校方的财政支持：科研副校长、国内外合作副校长以及生物与环境保护学院院长。Damian Jacenik 获得了波兰国家科学中心资助的项目（编号：2017/24/T/NZ5/00045 和 2015/17/N/NZ5/00336）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物 | |||
| BALB/C 小鼠 | 罗兹大学 | NA | |
| 设备 | |||
| 游标卡尺 | VWR | 62379-531 | |
| 纸板块 | NA | NA | |
| 共聚焦显微镜 - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| 全自动轮转切片机 - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| 载玻片 | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| 加热式石蜡包埋模块 - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| 组织学包埋盒 | Marfour | LN.138747 | |
| 疏水笔 | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| 实验室天平 | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X 软件 | Leica Biosystems | NA | |
| 金属模具 | Marfour | CP.5105 | |
| 无菌纱布 | NA | NA | |
| 无菌剪刀 | NA | NA | |
| 无菌镊子 | NA | NA | |
| 组织处理仪 - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| 试剂 | |||
| 2,4,6-三硝基苯磺酸 | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 二抗 | Abcam | ab96886 | |
| ERα 一抗 | Abcam | ab75635 | |
| ERβ 一抗 | Abcam | ab3576 | |
| 乙醇 | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| 甲醛 | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER 一抗 | Abcam | ab39742 | |
| 盐酸 | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| 过氧化氢酶 | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| 异氟烷（forane） | Baxter | 1001936040 | |
| 正常山羊血清 | Gibco | 16210064 | |
| 石蜡 | Leica Biosystems | 39602012 | |
| 培养皿 | Nest Scientific | 705001 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| 生理盐水 | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin（抗生素） | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| 含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂（基于甘油的含 DAPI 液体） | Invitrogen | P36971 | |
| 氯化钠 | Chempur | WE/231-598-3 | |
| 柠檬酸钠 | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 二甲苯 | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
参考文献
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96<....
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