本方案介绍了一种完整的、经过验证的由TNBS诱导的克罗恩病小鼠模型，以及利用免疫荧光法对石蜡包埋的甲醛固定结肠组织切片进行雌激素受体免疫组织化学可视化的实验方法。
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本文内容
摘要
摘要
克罗恩病是最常见的炎症性肠病类型。肠道内发生的慢性炎症可导致蠕动功能障碍和肠黏膜损伤，并可能与结肠新生物转化风险增加相关。越来越多的证据表明，雌激素及其受体不仅影响激素敏感性组织，还影响其他与雌激素无直接关联的组织，例如肺或结肠。本文描述了从三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的克罗恩病小鼠模型所获取的结肠组织中成功进行雌激素受体免疫荧光染色的实验方案。同时提供了小鼠克罗恩病诱导及肠道组织制备的详细步骤，以及使用福尔马林固定石蜡包埋肠道切片进行免疫组织化学染色的逐步操作流程。所述方法不仅适用于体内雌激素受体检测及雌激素信号通路的研究，也可推广应用于其他可能参与结肠炎发生发展的蛋白质研究。
引言
克罗恩病（CD）是一种炎症性肠病（IBD），表现为慢性肠道炎症。CD 的病因尚不明确，但已有研究表明其发病可能与肠道微生物群、遗传因素以及环境因素（如饮食或压力）等主要因素有关1。为了更好地理解克罗恩病的发病机制，研究人员已采用多种肠道炎症模型进行研究2,3,4,5,6,7。本文展示了利用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠 CD 模型所获得的研究结果。
已有文献记载，雌激素能够调节慢性肠道炎症8,9,10,11,12。雌激素的生物学活性由其特异性受体介导，其中包括核雌激素受体（ERs），即 ERα（基因 ESR1）和 ERβ（基因 ESR2），以及G蛋白偶联雌激素受体，即 GPER（基因 GPER1），后者被称为膜结合型雌激素受体13,14。目前有多种方法可用于检测雌激素受体水平，但仅有少数方法可用于在肠道中对其进行可视化观察。
免疫组织化学（IHC）是一种在临床和基础研究中广泛应用的方法，用于通过荧光染料偶联的抗体检测细胞或组织中的特定抗原。免疫组织化学在组织结构的可视化以及特异性蛋白质的鉴定与定位方面具有重要意义，这对于理解结肠炎的发生发展可能至关重要。本文介绍了一种完整且经过验证的免疫荧光法检测肠道中雌激素受体的免疫组织化学可视化方案。
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方案
动物实验是在获得地方伦理委员会（28/ŁB29/2016）同意后进行的，遵循欧洲议会和理事会2010年9月22日发布的2010/63/EU号指令以及机构建议。
1. TNBS诱导的小鼠克罗恩病模型
注意：本实验方案使用体重为 25–28 g 的雄性 BALB/C 小鼠。动物饲养在恒定温度（22–24 °C）、相对湿度为 55 ± 5% 的环境中，维持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环，可自由摄取标准颗粒饲料和自来水 ad libitum。
- 将小鼠放入诱导室并紧密关闭盖子。用异氟烷短暂麻醉小鼠（25% O2，O2 流速为 1.5–2 L/min）。
注意：呼吸频率应保持有节律且比正常情况更慢，且对有害刺激不应产生变化。 - 通过导管向远端结肠注入4 mg TNBS溶于0.1 mL 30%乙醇的0.9% NaCl溶液，或仅注入0.1 mL 30%乙醇的0.9% NaCl溶液作为溶剂对照。
注意：导管应小心插入肛门约3 cm深处。 - 从第2天至第8天每日监测小鼠的临床参数，包括体重、直肠出血、粪便性状及死亡率。
- 第8天通过颈椎脱位法处死小鼠。
图1：TNBS诱导的小鼠克罗恩病模型实验时间线。 请点击此处查看此图的放大版本。
2. 结肠的分离与大体评估
注意：结肠分离前 1 天，将 100 µL 抗生素加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释，4 °C 过夜保存。
- 使用75%乙醇和无菌纱布清洁腹部皮肤。
- 使用无菌剪刀和镊子沿腹壁从胸骨向肛门方向剪开。
- 尽可能靠近肛门和盲肠处切除结肠。
- 将结肠置于培养皿中，沿肛门至盲肠方向纵向剪开。用冷的含抗生素PBS溶液清洗结肠2–4次。
- 根据表1使用卡尺进行大体评估。
注意：组织粘连*、红斑/出血#、粪便带血#和腹泻#需通过肉眼评估。*组织粘连采用三分制评分（0：无组织粘连；1：中度组织粘连；2：广泛组织粘连）；#红斑/出血、粪便带血和腹泻根据其有无进行评分（0：无，1：有）。
| 黏附* | 红斑/出血# | 粪便潜血# | 腹泻# | 溃疡长度 | 结肠厚度 | 结肠长度 |
| 点（0 – 2） | 点（0 – 1） | 点（0 – 1） | 点（0 – 1） | 厘米/点 | 毫米/点 | 厘米/点 |
| 0 – 无 | 0 – 无 | 0 – 无 | 0 – 无 | 0.5 厘米 = 0.5 点 | n 毫米 n 点 | 0 – <比对照组短10% |
| 1 – 中等 | 1 – 现在 | 1 – 现在 | 0.5 – 轻微/稀便 | 1 – 比对照组短10%至20% | ||
| 2 – 现在 | 1 – 现在 | 2 – 比对照组短20%以上 |
表1：TNBS诱导的克罗恩病小鼠模型肠道宏观评分。
- 将溃疡长度（厘米）转换为评分标准，即每0.5厘米溃疡计为0.5分。将结肠厚度（毫米）转换为评分标准，即每 n 毫米对应于 n 点。
- 将结肠长度（厘米）转换为三分制评分。根据每只TNBS诱导的克罗恩病小鼠的结肠长度与对照组平均结肠长度的关系进行评估（0： <比对照组短10%以内，1：比对照组短10%至20%，2：比对照组短超过20%。
- 根据以下公式计算总宏观评分：总宏观评分 = 粘连（分）+ 红斑/出血（分）+ 粪便潜血（分）+ 腹泻（分）+ 溃疡长度（分）+ 结肠厚度（分）+ 结肠长度（分）。
3. 结肠样本制备
- 将结肠切成1-2 cm的片段，每段置于组织学包埋盒中适当标记的海绵上。
注意：组织学包埋盒中的海绵可防止结肠在脱水及浸蜡过程中发生折叠。 - 将结肠片段放入4%甲醛中，于4 °C孵育至少24 h。
- 准备并设置组织包埋机，依次进行50%、70%、90%、95%、100%乙醇、二甲苯/100%乙醇（1:1；v/v）及纯二甲苯的浸润，每步孵育1 h，并在液态石蜡中孵育至少3 h。
注意：脱水过程必须使用浓度递增的乙醇和二甲苯，但乙醇浓度可作调整。推荐使用二甲苯/乙醇混合液，但非必需。 - 将结肠片段转移至组织包埋盒，并放入预设程序的组织包埋机中。
- 运行组织包埋机。
- 完成浸润步骤后，将结肠片段放入金属模具中，使结肠两端保持直立状态，并向模具中加入三分之一体积的液态石蜡。
- 将模具置于冷却区（-5 °C）数秒，然后转移至加热区（70 °C），将模具放入组织包埋盒底部，并用液态石蜡完全覆盖结肠片段。
- 将带有结肠片段的金属模具在冷却区的石蜡中静置数分钟，取出金属模具，将蜡块于4 °C孵育至少24 h。
- 修去蜡块多余的石蜡，将蜡块插入全自动旋转式切片机中。
注意：此步骤前可将蜡块在-20 °C保存数分钟。 - 将结肠片段切成5 µm的切片。
- 将结肠切片转移至预热至40 °C的水浴中。
- 使用标记好的载玻片从水浴中捞取结肠切片。
注意：结肠切片会漂浮在水面上。将标记好的载玻片插入切片下方的水中，然后小心提起载玻片。 - 将载玻片在室温下放置24 h。如需长期保存，应在室温孵育24 h后，将载玻片置于4 °C保存。
4. 免疫荧光染色免疫组织化学
注意：在操作过程中的任何步骤中，均不得让结肠切片干燥。
- 将玻片在二甲苯中孵育 5 分钟以去除石蜡。重复此步骤三次。
- 将玻片置于二甲苯/100% 乙醇（1:1；v/v）中 5 分钟。重复此步骤三次。
- 通过一系列浓度递减的乙醇溶液对结肠切片进行再水化，即依次使用 70%、50%、30% 和 10% 乙醇各 5 分钟。每一步均重复三次。
- 用流水冲洗玻片 5 分钟。
- 将抗原修复缓冲液（10 mM 柠檬酸钠；0.05% Tween 20，pH 6.0）预热至 95–98 °C，并将玻片在沸腾的抗原修复液中加热 10 分钟。
注意：抗原修复步骤为可选步骤，但建议执行。应根据实验中所用抗体优化抗原修复液条件。 - 使用疏水笔在结肠切片周围画一个圆圈。
注意：此步骤为可选步骤，但建议执行。疏水笔可防止液体扩散，使试剂保留在标记圆圈内的小体积区域，从而避免试剂浪费。 - 将切片在 3% 过氧化氢水溶液中孵育 10 分钟。
- 在洗涤液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl；0.05% Tween 20）中洗涤 5 分钟。
- 在封闭液（5% 正常山羊血清；50 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl；0.05% Triton X-100）中于室温孵育 1 小时。
注意：封闭液中的正常血清必须与二抗来源物种一致。在需要孵育的步骤中，应将玻片置于湿盒中，以防止试剂过度蒸发。 - 去除封闭液，加入 20–50 µL 针对 ERα、ERβ 或 GPER 的一抗，用含 1% 牛血清白蛋白、50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl 和 0.05% Triton X-100 的溶液稀释。
注意：推荐的一抗稀释比例见表 2。
| 一抗/二抗类型 | 靶向抗原 | 克隆性 | 宿主物种 | 反应物种 | 稀释比例 |
| 一抗 | ERα | 多克隆 | Rabbit | Human | 1:100 |
| Mouse | |||||
| Turtle | |||||
| Capybara | |||||
| ERβ | 多克隆 | Rabbit | Human | ||
| Monkey | |||||
| Rat | |||||
| Mouse | |||||
| Sheep | |||||
| Pig | |||||
| GPER | 多克隆 | Rabbit | Human | ||
| Rat | |||||
| Mouse | |||||
| 二抗 | DyLight 650 | 多克隆 | Goat | Rabbit | 1:250 |
表2：抗体的特性。
- 在 4 °C 避光条件下，加入一抗孵育过夜。
- 移除抗体溶液，并用洗涤液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl；0.05% Tween 20）洗涤 5 分钟。重复此步骤三次。
- 加入 20–50 µL 用 1% 牛血清白蛋白稀释的 DyLight 650 二抗（含 50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05% Triton X-100）。在室温避光条件下，用染料偶联的二抗孵育 1 小时。
注意：二抗推荐稀释比例见表 2。 - 移除抗体溶液，并用洗涤液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05% Tween 20）洗涤 5 分钟。重复此步骤三次。
- 加入用 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl 稀释的 2% DiOC6(3)，在室温避光条件下孵育 10 分钟。
- 移除溶液，并用洗涤液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05% Tween 20）洗涤 5 分钟。重复此步骤三次。
- 在结肠切片上直接滴加数滴含 DAPI 的甘油基封片液，小心加盖盖玻片。将结肠切片在 4 °C 孵育至少 24 小时。
注意：加盖盖玻片时避免产生气泡。 - 使用配备 20× 或 63× 物镜及油浸镜头的共聚焦显微镜，结合专用软件分析结肠切片。
注意：表 3 列出了本研究中所用荧光染料的特性。
| 荧光染料类型 | 波长 (nm) | 染料 | |
| 激发 | 发射 | ||
| DAPI | 405 | 460 – 480 | 蓝色 |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | 绿色 |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | 红色 |
表3：荧光染料的特性。
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结果
三硝基苯磺酸诱导的克罗恩病小鼠结肠的宏观特征
对照组和三硝基苯磺酸（TNBS）处理组小鼠结肠的代表性图像见图2。在三硝基苯磺酸诱导的克罗恩病小鼠模型中，结肠长度缩短，而结肠宽度增加。
图2：来自对照组小鼠（对照）和TNBS处理小鼠（TNBS）的代表性结肠组织。
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讨论
目前存在多种用于研究炎症性肠病（IBD）病理生理学的动物模型，包括遗传性、免疫性或自发性模型，以及化学诱导模型15。在多种结肠炎动物模型中，化学诱导模型（例如本方案中描述的TNBS诱导模型）相对成本较低且易于建立。TNBS诱导的小鼠结肠炎模型具有与克罗恩病（CD）病理基础相关的多种临床症状。诱导性结肠炎动物表现为粪便形态不规则、血性腹泻以及体重减轻。然而，这并不意味着该模型仅适用于研究CD的病因和发病机制。TNBS诱导模型被推荐并广泛用于潜在治疗药物的筛选。在化学诱导性结肠炎模型中，某些关键点需要特别注意。TNBS必须用乙醇稀释，乙醇可破坏黏膜屏障，使TNBS穿透肠壁并与高分子量蛋白质结合，从而引发细胞介导的免疫反应2,16,17。TNBS的剂量和乙醇浓度应根据小鼠品系和体重进行优化。过高的TNBS剂量和乙醇浓度可能导致过高的死亡率，从而影响后续分析；而过低的TNBS剂量和乙醇浓度则可能导致反应不足，不必...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得益于罗兹大学校方的财政支持：科研副校长、国内外合作副校长以及生物与环境保护学院院长。Damian Jacenik 获得了波兰国家科学中心资助的项目（编号：2017/24/T/NZ5/00045 和 2015/17/N/NZ5/00336）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物 | |||
| BALB/C 小鼠 | 罗兹大学 | NA | |
| 设备 | |||
| 游标卡尺 | VWR | 62379-531 | |
| 纸板块 | NA | NA | |
| 共聚焦显微镜 - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| 全自动轮转切片机 - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| 载玻片 | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| 加热式石蜡包埋模块 - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| 组织学包埋盒 | Marfour | LN.138747 | |
| 疏水笔 | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| 实验室天平 | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X 软件 | Leica Biosystems | NA | |
| 金属模具 | Marfour | CP.5105 | |
| 无菌纱布 | NA | NA | |
| 无菌剪刀 | NA | NA | |
| 无菌镊子 | NA | NA | |
| 组织处理仪 - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| 试剂 | |||
| 2,4,6-三硝基苯磺酸 | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 二抗 | Abcam | ab96886 | |
| ERα 一抗 | Abcam | ab75635 | |
| ERβ 一抗 | Abcam | ab3576 | |
| 乙醇 | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| 甲醛 | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER 一抗 | Abcam | ab39742 | |
| 盐酸 | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| 过氧化氢酶 | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| 异氟烷（forane） | Baxter | 1001936040 | |
| 正常山羊血清 | Gibco | 16210064 | |
| 石蜡 | Leica Biosystems | 39602012 | |
| 培养皿 | Nest Scientific | 705001 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| 生理盐水 | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin（抗生素） | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| 含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂（基于甘油的含 DAPI 液体） | Invitrogen | P36971 | |
| 氯化钠 | Chempur | WE/231-598-3 | |
| 柠檬酸钠 | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 二甲苯 | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
参考文献
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