研究环境污染物对斑马鱼幼鱼神经行为学的影响

摘要

本文提供了一种利用斑马鱼幼鱼模型评估环境污染物神经行为毒性的详细实验方案，包括暴露过程及神经行为指标的检测方法。

摘要

近年来，越来越多的环境污染物被证实具有神经毒性，尤其是在生物体的早期发育阶段。斑马鱼幼鱼是研究环境污染物神经行为效应的优秀模型。本文提供了一套详细的实验方案，用于评估环境污染物对斑马鱼幼鱼的神经毒性，内容包括胚胎采集、暴露过程、神经行为指标、检测流程及数据分析。同时，还讨论了培养环境、暴露过程和实验条件，以确保实验的成功。该方案已应用于精神类药物的开发以及环境神经毒性污染物的研究，也可进一步优化，用于相关研究或机制性研究。本方案为研究斑马鱼幼鱼的神经行为效应提供了清晰的操作流程，能够揭示多种神经毒性物质或污染物的影响效应。

引言

近年来，越来越多的环境污染物被证实具有神经毒性^1,2,3,4。然而，与内分泌干扰或发育毒性相比，评估环境污染物暴露后的体内神经毒性并不容易。此外，在毒性研究中，早期暴露于污染物（特别是环境相关剂量下的暴露）正受到越来越多的关注^5,6,7,8。

斑马鱼正被确立为一种适用于研究环境污染物暴露后早期发育阶段神经毒性的动物模型。斑马鱼是脊椎动物，受精后其发育速度比其他物种更快。由于卵黄膜中的营养足以维持其生长，幼体在受精后7天内无需喂食。⁹幼虫在约2 dpf时从绒毛膜中孵出，发育出游泳和转向等行为，这些行为可利用行为学仪器进行观察、追踪、量化和自动分析。^10,11,12,13 从3-4 dpf开始^{14,15,16,17,18}此外，行为学仪器还可实现高通量检测。因此，斑马鱼幼体是研究环境污染物神经行为效应的优秀模型。¹⁹本文提供了一种利用高通量监测技术，在光刺激条件下研究环境污染物对斑马鱼幼鱼神经行为毒性的实验方案。

本实验室已利用所述方案研究了2,2',4,4'-四溴二苯醚（BDE-47）^20,21、6'-羟基/甲氧基-2,2',4,4'-四溴二苯醚（6-OH/MeO-BDE-47）²²、十溴二苯醚（BDE-209）、铅以及商用氯化石蜡²³的神经行为毒性。许多实验室也采用该方案研究其他污染物对幼鱼或成鱼神经行为的影响^24,25,26,27。该神经行为学方案曾被用于提供机制性证据，表明双酚A及替代物双酚S在低剂量暴露下可诱导斑马鱼胚胎下丘脑过早发生神经发生²⁷。此外，部分研究人员对该方案进行了优化以开展相应研究。最近一项研究利用酪蛋白包被的金纳米颗粒（βCas AuNPs），在一种简便、高通量的斑马鱼模型中消除了淀粉样蛋白β（Aβ）的毒性。研究显示，βCas AuNPs在全身循环中可跨越斑马鱼幼体的血脑屏障，并以非特异性、类似分子伴侣的方式螯合脑内Aβ42，从而缓解其毒性，该结论得到了行为病理学结果的支持²⁸。

运动能力、路径角度和社会活动是本方案中用于研究斑马鱼幼鱼在暴露于污染物后神经毒性效应的三个神经行为学指标。运动能力通过幼鱼的游泳距离来测量，暴露于污染物后可能受到损伤。路径角度和社会活动则与大脑及中枢神经系统的功能关系更为密切²⁹。路径角度是指动物运动轨迹相对于其游泳方向的角度³⁰。系统中设置了从约-180°至约+180°的八个角度类别。为了简化比较，根据我们之前的研究^21,22，最终结果中的六个类别被定义为常规转向（-10° ~ 0°，0° ~ +10°）、中等转向（-10° ~ -90°，+10° ~ +90°）和显著转向（-180° ~ -90°，+90° ~ +180°）。双鱼社会活动是群体聚集行为的基础；在此，将两条幼鱼之间距离< 0.5 cm 定义为有效社会接触。

本文介绍的实验方案展示了研究斑马鱼幼虫神经行为效应的明确流程，并提供了一种揭示各种物质或污染物神经毒性效应的方法。该方案将有助于致力于研究环境污染物神经毒性的科研人员。

方案

该方案符合同济大学动物伦理委员会批准的指南。

1. 斑马鱼胚胎收集

1. 在暴露前一晚，将两对健康的图宾根斑马鱼成鱼放入产卵盒中，保持雌雄比例为1:1。
2. 次日清晨光照后30–60分钟，将成鱼移回养殖系统。
3. 从产卵盒中取出胚胎。
4. 用系统水冲洗胚胎。
5. 将胚胎转移至装有足量系统水的玻璃培养皿（直径9 cm）中。
6. 在显微镜下观察胚胎，挑选健康的胚胎用于后续暴露实验。
   注意：健康的胚胎在显微镜下通常呈透明状并带有淡金色；不健康的胚胎则通常颜色苍白，并在显微镜下呈现聚集状态。

2. 暴露前准备

1. 根据斑马鱼手册的指南配制 Hank's 溶液³¹。
   注意：Hank's 溶液包含 0.137 M NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na₂HPO₄、0.44 mM KH₂PO₄、1.3 mM CaCl₂、1.0 mM MgSO₄ 和 4.2 mM NaHCO₃。
2. 使用无菌水将 Hank's 溶液稀释至 10% Hank's 溶液。
3. 向 999 mL 的 10% Hank's 溶液中加入 1 mL DMSO，配制含 0.1% DMSO 的 10% Hank's 溶液作为对照溶液。
   注意：后续步骤以 BDE-47 为例说明暴露溶液的配制。
4. 将 5 mg 纯 BDE-47 溶解于 1 mL 100% DMSO 中，配制成浓度为 5 mg/mL 的标准暴露溶液。
5. 将 5 mg/mL 溶液涡旋振荡 1 分钟，使 BDE-47 完全溶解于 DMSO 中。
6. 取 10 µL 的 5 mg/mL 溶液转移至一个 12 mL 棕色玻璃瓶中。
7. 加入无菌水至终体积为 10 mL，使 BDE-47 暴露溶液的浓度为 5 mg/L，DMSO 比例为 0.1%，然后涡旋振荡 1 分钟。
8. 分别取 10 µL 和 100 µL 的 5 mg/L 溶液，转移至两个 100 mL 容量瓶中。
9. 用含 0.1% DMSO 的 10% Hank's 溶液（步骤 2.3 中配制）定容至 100 mL，得到 BDE-47 暴露溶液的终浓度分别为 5 µg/L 和 50 µg/L。
10. 将溶液转移至 100 mL 棕色玻璃瓶中，并在 4 °C 下保存。

3. 胚胎暴露

1. 在受精后3-5小时（hpf），将约50个胚胎分别转移至三个玻璃培养皿（直径6 cm）中。
2. 使用1 mL移液枪头吸去胚胎周围的系统水。
3. 用移液器将对照组及两种BDE-47暴露溶液（对照组、5 µg/L、50 µg/L）分别加入三个玻璃培养皿中。
4. 依次轻轻摇晃玻璃培养皿，使胚胎均匀分散于皿底。
5. 将玻璃培养皿放入28.5 °C的光照培养箱中。
6. 每隔24小时更换一半暴露溶液，直至5 dpf。
7. 在1 dpf和2 dpf时检查各组胚胎的死亡情况，并计算死亡率。
8. 在2 dpf和3 dpf时检查各组胚胎的孵化情况，并计算孵化率。
9. 幼虫自卵膜孵出后每日观察其畸形情况，并计算各组的畸形率。
   注：畸形指标包括心包囊肿、脊柱弯曲、尾部弯曲等因素³²。

4. 行为测试的准备工作

1. 在5 dpf当天上午，为运动能力和路径角度测试准备一个48孔微孔板，并为社交活动测试准备三个6孔微孔板。
2. 将800 µL暴露溶液加入48孔微孔板的每个孔中。
   注意：每组使用16个孔（即对照溶液组、5 µg/L组和50 µg/L组）。
3. 使用1 mL移液枪头，从玻璃培养皿中吸取含有一个幼鱼的200 µL暴露溶液，转移至48孔微孔板的一个孔中。
4. 将4 mL暴露溶液加入6孔微孔板的每个孔中。
   注意：每组使用一个6孔微孔板。
5. 使用1 mL移液枪头，将含有两条幼鱼的200 µL暴露溶液转移至6孔微孔板的每个孔中。
   注意：每组设有六个重复组。
6. 确保测试前2小时测试室的温度维持在28 °C。
   注意：行为学测试通常在下午进行。

5. 行为学测试

1. 运动性与路径角度测试
   1. 点击计算机桌面上的启动图标，打开控制高通量监测箱的软件（参见材料表），以启动程序。
   2. 选择"追踪、旋转、路径角度"模块，进入操作界面。
   3. 将步骤4.3中准备好的48孔微孔板转移至记录平台，并拉下盖子。
   4. 在软件中依次点击"文件"和"生成协议"按钮，开始生成新协议。
   5. 在"位置数量"处输入"48"，然后点击"确定"按钮。
   6. 在软件中依次点击"参数"、"协议参数"和"时间"按钮。将实验持续时间设置为1小时10分钟，积分周期设置为60秒³³。
   7. 绘制检测区域。
      1. 选择椭圆形工具，在左上角第一个孔周围绘制第一个圆圈。
      2. 选中该圆圈，依次点击"复制"、"右上标记"、"粘贴"和"选择"按钮，并使用鼠标将复制的圆圈拖动至右上角孔位。
      3. 选中该圆圈，依次点击"复制"、"底部标记"、"粘贴"和"选择"按钮，并使用鼠标将复制的圆圈拖动至右下角孔位。
      4. 依次点击"构建"和"清除标记"按钮。
         注：系统将自动绘制板上其余每个孔的检测区域。新创建的区域应精确贴合每个孔，位于实际鱼体与其在孔壁上的反射像之间。
   8. 点击"绘制标尺"按钮，在屏幕上绘制一条校准线（可为对角线或与微孔板边缘平行），输入其长度并设置"单位"，然后点击"应用于组"按钮。
   9. 在软件中将动物颜色设置为"黑色"。
   10. 将检测阈值设为16–18，以便检测动物。
   11. 分别将“不活跃/小速度”和“小速度/大速度”阈值设为0.5 cm/s和2.5 cm/s。
   12. 设置路径角度分类。输入"-90, -30, -10, 0, 10, 30, 和 90"，以将路径角度划分为从-180°至+180°的八个类别。
   13. 设置光照条件
       1. 在软件中依次点击"参数"、"光驱动"、"使用以下三种触发方式之一"和"增强刺激"按钮，以设置光照条件。
       2. 选择"边缘"按钮，然后设置10分钟黑暗期，随后进行三个交替的10分钟光照和黑暗周期。
   14. 保存协议，并关闭测试室的灯光。
   15. 让幼体在系统中适应10分钟，然后依次点击"实验"和"执行"按钮，选择实验文件保存的文件夹并输入结果名称。
   16. 依次点击"背景"和"开始"按钮，启动测试。
   17. 测试结束后，依次点击"实验"和"停止"按钮，结束实验。
       注：系统停止后将显示测试数据。数据包括每分钟三个速度类别下的追踪距离以及八个角度类别下的路径角度数量。在本示例的运动性测试中，计算每个光照周期（10分钟）内的总移动距离，并比较对照组与处理组之间的差异。
   18. 将48孔微孔板转移回光照培养箱，用于其他实验。
2. 社交活动测试
   1. 点击计算机桌面上的启动图标，打开控制高通量监测箱的软件，以启动程序。
   2. 选择"社交互动"模块，进入操作界面。
   3. 将步骤4.4中准备好的6孔微孔板（对照组）转移至记录平台，并拉下盖子。
   4. 在软件中依次点击"文件"和"生成协议"按钮，开始生成新协议。
   5. 在"位置数量"处输入"6"，然后点击"确定"按钮。
   6. 在软件中依次点击"参数"、"协议参数"和"时间"按钮。将实验持续时间设置为1小时10分钟，积分周期设置为60秒。
   7. 绘制检测区域。
      1. 选择椭圆形工具，在左上角第一个孔周围绘制第一个圆圈。
      2. 选中该圆圈，依次点击"复制"、"右上标记"、"粘贴"和"选择"按钮，并使用鼠标将复制的圆圈拖动至右上角孔位。
      3. 选中该圆圈，依次点击"复制"、"底部标记"、"粘贴"和"选择"按钮，并使用鼠标将复制的圆圈拖动至右下角孔位。
      4. 依次点击"构建"和"清除标记"按钮。
         注：新创建的区域应精确贴合每个孔，位于实际幼体与其在孔壁上的反射像之间。
   8. 点击"绘制标尺"按钮，在屏幕上绘制一条校准线（可为对角线或与微孔板边缘平行），输入其长度并设置"单位"，然后点击"应用于组"按钮。
   9. 将检测阈值设为16–18，以便检测动物。
   10. 在软件中点击"黑色动物"按钮。
   11. 选择"距离阈值"按钮，并在软件中输入"5"。
   12. 设置光照条件。
       1. 在软件中依次点击"参数"、"光驱动"、"使用以下三种触发方式之一"和"增强刺激"按钮，以设置光照条件。
       2. 选择"边缘"按钮，然后设置10分钟黑暗期，随后进行三个交替的10分钟光照和黑暗周期。
   13. 保存协议，并关闭房间灯光。
   14. 让幼体在系统中适应10分钟，然后依次点击"实验"和"执行"按钮，选择实验文件保存的文件夹并输入结果名称。
   15. 依次点击"背景"和"开始"按钮，启动测试。
   16. 测试结束后，在软件中依次点击"实验"和"停止"按钮，结束实验。
       注：系统停止后将显示测试数据。
   17. 将6孔微孔板（对照组）转移回光照培养箱，用于其他实验。
   18. 依次将6孔微孔板（5 µg/L 和 50 µg/L 组）转移至记录平台，并按顺序重复步骤5.2.4至5.2.17。

6. 数据分析

1. 打开运动轨迹和路径角度结果的电子表格文件。
2. 选择三个距离列（inadist、smldist、lardist），并将其相加。
   注：inadist、smldist 和 lardist 的数据分别表示系统在不同速度类别（无活动/小幅度/大幅度）下记录的不同距离。
3. 对每个10分钟的光照时段，分别汇总每孔的距离，计算16孔的平均距离，并比较三组在光照刺激下的数据。
4. 对每个10分钟的光照时段，依次汇总从 cl01 到 cl08 每个光照持续时间下每孔的路径角度数量，并比较三组在光照刺激下的数据。
   注：从 cl01 到 cl08 各列的数据分别表示系统在不同路径角度下记录的角度数量。
5. 打开社交活动结果的电子表格文件。
6. 选择 contct 和 contdur 两列，对每个10分钟的光照时段，分别汇总每孔的社交次数及其持续时间。
7. 计算每组在每个光照持续时间内的平均社交次数和平均持续时间，并比较三组在光照刺激下的数据。

结果

本文介绍了一种利用在光刺激条件下暴露的斑马鱼幼鱼研究环境污染物神经行为效应的实验方案。引言中定义了运动行为、路径角度和社会活动性测试。下文展示了运动行为和路径角度测试中微孔板的设置以及软件界面图像，并以我们自己的研究结果作为示例进行说明。其中两项研究展示了暴露于BDE-47和6-OH/MeO-BDE-47后对运动行为和路径角度的影响，第三项研究则展示了四种商用氯化石蜡对社会行为的影响。

48孔微孔板的设置以及幼虫在运动和路径角度测试中的运动轨迹。
本实验方案包含三个组，分别为一个对照组和两个处理组。由于每组可容纳16只动物，该系统可用于在一块微孔板上进行高通量的运动能力和路径角度检测。图1展示了第一行、中间两行和最后两行的每个孔中分别加入对照溶液、5 µg/L 溶液和 50 µg/L 溶液处理的一只幼虫。

讨论

本研究提供了一种利用斑马鱼幼鱼评估环境污染物神经毒性的详细实验方案。在暴露期间，斑马鱼会经历从胚胎到幼鱼的发育过程，因此对胚胎和幼鱼的精心养护至关重要。任何影响胚胎和幼鱼发育的因素都可能干扰最终实验结果。本文将讨论培养环境、暴露过程及实验条件，以确保整个检测实验的成功实施。

在培养环境中，斑马鱼胚胎和幼鱼在约 28 °C 的稳定温度下生长。本研究使用可自动设置光照条件并保持温度稳定的光照培养箱来饲养胚胎和幼鱼。在受精后1天（1 dpf）和2天（2 dpf）时，胚胎尚未从绒毛膜中孵出，因此在更换暴露溶液时应小心操作，避免损伤未孵化的胚胎。此外，溶液中DMSO的比例应低于0.1%^34,35，且新鲜的暴露溶液在用于更换前应预热至28 °C。

在暴露前选择胚胎的过程也是实验成功的关键因素。为每组选择同时发育且健康的胚胎，可确保毒性评估的准确性。斑马鱼在受精后的前7天内可以不进食，因此在整个暴露期间最好不喂食胚胎或幼鱼，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48孔微孔板	Corning	3548	胚胎培养
6孔微孔板	Corning	3471	胚胎培养
BDE-47	AccuStandard	5436-43-1	污染物
DMSO	Sigma	67-68-5	共溶剂
显微镜	Olympus	SZX 16	观察仪器
移液器	Eppendorf	3120000267	溶液转移
Zebrabox	Viewpoint	ZebraBox	行为检测仪器
斑马鱼	Shanghai FishBio Co., Ltd.	Tubingen	斑马鱼供应商
ZebraLab	Viewpoint	ZebraLab	行为分析软件