利用小发夹RNA在C2C12成肌细胞系中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因

摘要

我们提供了一种利用小发夹RNA（shRNA）在C2C12成肌细胞中稳定敲低编码细胞外基质（ECM）蛋白基因的实验方案。以ADAMTSL2基因为例，本文描述了在C2C12成肌细胞向肌管分化过程中，从mRNA、蛋白质及细胞水平上验证基因敲低效率的方法。

摘要

细胞外基质（ECM）蛋白对骨骼肌的发育和稳态至关重要。通过在C2C12成肌细胞中稳定敲低编码ECM蛋白的基因，可用于研究这些蛋白在骨骼肌发育中的作用。本文以小发夹RNA（shRNA）在C2C12细胞中敲低ECM蛋白ADAMTSL2为例，描述了一种具体的实验方案。在转染shRNA质粒后，使用嘌呤霉素对细胞进行批量筛选以获得稳定细胞系。我们进一步介绍了这些细胞系的维持方法，以及通过mRNA表达、蛋白表达和C2C12细胞分化进行的表型分析。该方法的优势在于能够相对快速地获得稳定的C2C12基因敲低细胞系，并且在细胞培养基中去除血清后，C2C12细胞可稳定地分化为多核肌管。C2C12细胞的分化过程可通过明场显微镜观察，并通过检测经典标志基因（如MyoD、肌生成素或肌球蛋白重链（MyHC））的表达水平来评估，这些标志物可反映C2C12成肌细胞向肌管分化的进程。与利用小干扰（si）RNA进行的瞬时基因敲低相比，构建稳定表达shRNA的C2C12细胞系可更有效地靶向在C2C12分化后期或肌管成熟过程中表达的基因。该方法的局限性包括不同shRNA导致的敲低效率存在差异，这一问题可通过基于CRISPR/Cas9的基因敲除策略加以克服；此外，还需考虑shRNA可能存在的脱靶效应。

引言

细胞外基质（ECM）蛋白为所有组织提供结构支持，介导细胞间通讯，并决定细胞命运。因此，ECM 的形成及其动态重塑对于维持组织和器官的稳态至关重要^1,2。多个编码 ECM 蛋白的基因发生致病性变异可导致骨骼肌系统疾病，其表型范围从肌营养不良症到假性肌肉发达^3,4。例如，ADAMTSL2 基因的致病性变异会引起极为罕见的骨骼肌系统疾病——小人症样发育不良（geleophysic dysplasia），其特征之一为假性肌肉发达，即骨骼肌质量看似增加⁵。结合小鼠和人类中的基因表达数据，这提示 ADAMTSL2 在骨骼肌发育或稳态中具有重要作用^6,7。

本文所述方案旨在研究ADAMTSL2在细胞培养条件下调控骨骼肌发育和/或稳态的机制。我们在小鼠C2C12成肌细胞系中稳定敲低了ADAMTSL2。C2C12成肌细胞及其向肌管细胞的分化是一种已被充分描述且广泛应用的细胞培养模型，用于研究骨骼肌分化及骨骼肌生物工程^8,

方案

1. 准备shRNA质粒DNA 大肠杆菌

1. 生成携带 shRNA 质粒的克隆细菌菌落
   1. 从商业来源获取携带靶向特异性 shRNA 质粒及对照质粒的 E. coli 甘油菌种（材料表）。
      注：使用了三种不同的 shRNA 质粒，分别靶向小鼠 Adamtsl2 mRNA 的不同区域。其中一种 shRNA 被设计用于靶向 Adamtsl2 的 3'-非翻译区（3'UTR），以便利用编码重组全长 ADAMTSL2 或单个 ADAMTSL2 蛋白结构域的表达质粒进行挽救实验。此外，还包含一个随机序列 shRNA 质粒作为阴性对照。shRNA 序列的详细信息见图 1A。
   2. 在室温（RT）下解冻 shRNA 细菌甘油菌种。取 10 µL 甘油菌液转移至添加了 100 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板（LB-Amp）上。
      注：LB-Amp 平板的制备方法为：将 1 L LB 培养基（每升含 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl，调节 pH 至 7.0）与 12 g 琼脂一同高压灭菌。待培养基冷却至约 50 °C 时，加入氨苄青霉素（储存液：50 mg/mL 溶于无....

结果

转染后10−14天内即可完成对嘌呤霉素抗性C2C12细胞的筛选，这是由于非抗性（即未转染）细胞被高效清除（图1B）。通常情况下，超过80%的细胞会从细胞培养皿上脱落，并在常规细胞维护过程中被去除。表达对照（随机）shRNA的嘌呤霉素抗性C2C12细胞在低密度时保持纺锤形、细长的细胞形态，并具有分化为肌管的能力。通过撤除血清诱导C2C12细胞分化后，可利用明场显微镜观察并结合肌管标志物——肌球蛋白重链（MyHC）的免疫染色进行监测（图2）。在启动分化后3−5天内可观察到MyHC阳性的肌管。由于在MyHC阳性细胞边界内存在多个DAPI阳性细胞核，表明肌管为多核结构。图3A展示了在完全DMEM培养基中培养的稳定C2C12细胞的明场图像。此处显示的基因敲低效率范围为40−60%（图3B）。由于mRNA是在增殖.......

讨论

本文介绍了一种在 C2C12 成肌细胞中稳定敲低细胞外基质（ECM）蛋白的实验方案，以及对 C2C12 成肌细胞向肌管分化过程进行表型分析的方法。实验结果受多种因素影响，需仔细考虑。保持 C2C12 细胞处于增殖阶段是维持其成肌前体细胞状态的关键步骤。C2C12 细胞能否持续稳定地分化为肌管，取决于以下三个方面：i）细胞的传代次数，ii）常规培养过程中细胞的密度，以及 iii）营养物质的可获得性，后者要求频繁且定期更换细胞培养基^11,12,13。由于某些尚未明确的机制，高传代次数的 C2C12 细胞也会丧失进一步发生成肌细胞融合的能力¹¹。C2C12 细胞供应商建议将传代次数控制在15代以内，超过此范围后，细胞的分化能力可能下降，使用此类细胞进行实验可能导致肌管形成的一致性降低。另一方面，常规培养中的细胞密度也可能产生类似影响⁹。在常规培养过程中若达到汇合状.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Fisher Chemical	191784
琼脂	Fisher Bioreagents	BP1423
氨苄青霉素	Fisher Bioreagents	BP1760-5
自动化细胞计数仪 Countesse II	Invitrogen	A27977
Bradford 试剂	Thermo Scientific	P4205987
C2C12 细胞	ATCC	CRL-1772
腔室载玻片	Invitrogen	C10283
氯仿	Fisher Chemical	183172
DMEM	GIBCO	11965-092
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
DNase I（扩增级）	Invitrogen	18068015
胎牛血清	VWR	97068-085
GAPDH	EMD Millipore	MAB374
甘氨酸	VWR Life Sciences	19C2656013
山羊抗小鼠二抗（IRDYE 800CW）	Li-Cor	C90130-02
山羊抗小鼠二抗（罗丹明红）	Jackson Immune Research	133389
HCl	Fisher Chemical	A144S
培养箱（摇床）	Denville Scientific Corporation	1704N205BC105
巯基乙醇	Amresco, VWR Life Sciences	2707C122
质粒中量提取试剂盒	Qiagen	12643
肌球蛋白 4（肌球蛋白重链）	Invitrogen	14-6503-82
封片剂	Invitrogen	2086310
NaCl	VWR Life Sciences	241
非离子型表面活性剂/去垢剂	VWR Life Sciences	18D1856500
多聚甲醛	MP	199983
PBS	Fisher Bioreagents	BP399-4
PEI	Polysciences	23966-1
青霉素/链霉素抗生素	GIBCO	15140-122
培养皿	Corning	353003
聚丙烯管	Fisherbrand	149569C
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	33576300
嘌呤霉素	Fisher Scientific	BP2956100
PCR（实时）	Applied Biosystems	4359284
反应管	Eppendorf	22364111
逆转录预混液	Applied Biosystems	4368814
RIPA 缓冲液	Thermo Scientific	TK274910
sh control 质粒	Sigma-Aldrich	07201820MN
sh 3086 质粒	Sigma-Aldrich	TRCN0000092578
sh 972 质粒	Sigma-Aldrich	TRCN0000092579
sh 1977 质粒	Sigma-Aldrich	TRCN0000092582
分光光度计（Nanodrop）	Thermo Scientific	NanoDrop One C
SYBR Green 试剂预混液	Applied Biosystems	743566
三氯乙酸	Acros Organics	30145369
Trizol 试剂	Ambion	254707
台盼蓝	GIBCO	15250-061
胰蛋白胨	Fisher Bioreagents	BP1421
胰蛋白酶 EDTA 0.25%	Gibco-Life Technology Corporation	2085459
水（DEPC 处理且无核酸酶）	Fisher Bioreagents	186163
Western blot 装置	Biorad	Mini Protean Tetra Cell
酵母提取物	Fisher Bioreagents	BP1422