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方法文章

利用小发夹RNA在C2C12成肌细胞系中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因

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DOI：

10.3791/60824

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2020年2月12日

 ,  , 
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

本文内容

摘要

我们提供了一种利用小发夹RNA（shRNA）在C2C12成肌细胞中稳定敲低编码细胞外基质（ECM）蛋白基因的实验方案。以ADAMTSL2基因为例，本文描述了在C2C12成肌细胞向肌管分化过程中，从mRNA、蛋白质及细胞水平上验证基因敲低效率的方法。

摘要

细胞外基质（ECM）蛋白对骨骼肌的发育和稳态至关重要。通过在C2C12成肌细胞中稳定敲低编码ECM蛋白的基因，可用于研究这些蛋白在骨骼肌发育中的作用。本文以小发夹RNA（shRNA）在C2C12细胞中敲低ECM蛋白ADAMTSL2为例，描述了一种具体的实验方案。在转染shRNA质粒后，使用嘌呤霉素对细胞进行批量筛选以获得稳定细胞系。我们进一步介绍了这些细胞系的维持方法，以及通过mRNA表达、蛋白表达和C2C12细胞分化进行的表型分析。该方法的优势在于能够相对快速地获得稳定的C2C12基因敲低细胞系，并且在细胞培养基中去除血清后，C2C12细胞可稳定地分化为多核肌管。C2C12细胞的分化过程可通过明场显微镜观察，并通过检测经典标志基因（如MyoD、肌生成素或肌球蛋白重链（MyHC））的表达水平来评估，这些标志物可反映C2C12成肌细胞向肌管分化的进程。与利用小干扰（si）RNA进行的瞬时基因敲低相比，构建稳定表达shRNA的C2C12细胞系可更有效地靶向在C2C12分化后期或肌管成熟过程中表达的基因。该方法的局限性包括不同shRNA导致的敲低效率存在差异，这一问题可通过基于CRISPR/Cas9的基因敲除策略加以克服；此外，还需考虑shRNA可能存在的脱靶效应。

引言

细胞外基质（ECM）蛋白为所有组织提供结构支持，介导细胞间通讯，并决定细胞命运。因此，ECM 的形成及其动态重塑对于维持组织和器官的稳态至关重要1,2。多个编码 ECM 蛋白的基因发生致病性变异可导致骨骼肌系统疾病，其表型范围从肌营养不良症到假性肌肉发达3,4。例如，ADAMTSL2 基因的致病性变异会引起极为罕见的骨骼肌系统疾病——小人症样发育不良（geleophysic dysplasia），其特征之一为假性肌肉发达，即骨骼肌质量看似增加5。结合小鼠和人类中的基因表达数据，这提示 ADAMTSL2 在骨骼肌发育或稳态中具有重要作用6,7。

本文所述方案旨在研究ADAMTSL2在细胞培养条件下调控骨骼肌发育和/或稳态的机制。我们在小鼠C2C12成肌细胞系中稳定敲低了ADAMTSL2。C2C12成肌细胞及其向肌管细胞的分化是一种已被充分描述且广泛应用的细胞培养模型，用于研究骨骼肌分化及骨骼肌生物工程8,9。在撤除血清后，C2C12细胞会经历明确的分化阶段，经过3−10天的培养后形成多核肌管细胞。这些分化过程可通过检测特定标志基因（如MyoD、肌生成素或肌球蛋白重链（MyHC））的mRNA水平进行可靠监测。在C2C12细胞中建立稳定基因敲低的一个优势在于，相较于通过小干扰（si）RNA实现的瞬时敲低（其效应通常在转染后持续5−7天，且受转染效率影响），该方法能更有效地靶向在C2C12分化后期表达的基因。本方案的第二个优势是可通过嘌呤霉素筛选相对快速地获得成批的C2C12基因敲低细胞。其他替代方法，例如CRISPR/Cas9介导的基因敲除，或从人类样本或目的基因缺陷小鼠中分离原代骨骼肌前体细胞，则在技术上更具挑战性，或分别依赖于患者肌肉活检样本或目的基因缺陷小鼠的可获得性。然而，与其他基于细胞培养的方法类似，C2C12细胞作为骨骼肌细胞分化模型也存在局限性，例如细胞培养体系为二维（2D）结构，且缺乏体内微环境——而后者对于维持未分化骨骼肌前体细胞至关重要10。

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方案

1. 准备shRNA质粒DNA 大肠杆菌

  1. 生成携带 shRNA 质粒的克隆细菌菌落
    1. 从商业来源获取携带靶向特异性 shRNA 质粒及对照质粒的 E. coli 甘油菌种（材料表）。
      注：使用了三种不同的 shRNA 质粒，分别靶向小鼠 Adamtsl2 mRNA 的不同区域。其中一种 shRNA 被设计用于靶向 Adamtsl2 的 3'-非翻译区（3'UTR），以便利用编码重组全长 ADAMTSL2 或单个 ADAMTSL2 蛋白结构域的表达质粒进行挽救实验。此外，还包含一个随机序列 shRNA 质粒作为阴性对照。shRNA 序列的详细信息见图 1A。
    2. 在室温（RT）下解冻 shRNA 细菌甘油菌种。取 10 µL 甘油菌液转移至添加了 100 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板（LB-Amp）上。
      注：LB-Amp 平板的制备方法为：将 1 L LB 培养基（每升含 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl，调节 pH 至 7.0）与 12 g 琼脂一同高压灭菌。待培养基冷却至约 50 °C 时，加入氨苄青霉素（储存液：50 mg/mL 溶于无菌水），使其终浓度为 100 µg/mL（LB-Amp 琼脂）。立即向每个 10 cm 培养皿中倒入约 20 mL LB-Amp 琼脂，待其凝固后使用。1 L LB-Amp 琼脂通常可制备约 40 个 10 cm 培养皿。若将含 LB-Amp 琼脂的培养皿密封后避光保存于 4 °C，可稳定至少一个月。
    3. 使用无菌 Drygalski 涂布棒或其他适当方法将菌液均匀涂布，以获得单个细菌菌落。将平板倒置，在 37 °C 下过夜培养。
  2. 质粒制备
    1. 次日早晨，取出带有单个细菌菌落的培养皿，并置于 4 °C 保存，以防止细菌菌落过度生长及卫星菌落形成。若需过夜或更长时间保存，应密封培养皿。
    2. 下午时，向聚丙烯细菌培养管中加入 5 mL LB-Amp 培养基。用移液器吸头从过夜培养的培养皿中挑取单个细菌菌落，并将其接种至含有 LB-Amp 培养基的细菌培养管中，通过弹出吸头完成接种。
    3. 将细菌培养物置于摇床中，在 37 °C、250 rpm 条件下过夜培养，管盖松开以保证通气。
    4. 次日早晨取出细菌培养管，置于 4 °C 保存以避免细菌过度生长。下午时，通过涡旋重悬细菌，取 1 mL 过夜培养物转移至含 50 mL LB-Amp 培养基的 250 mL 锥形瓶中。继续在 37 °C、250 rpm 摇床中过夜培养。
    5. 次日早晨，将细菌转移至 50 mL 一次性离心管中，在室温下以 6,000 x g 离心 15 分钟。弃去上清液，继续进行步骤 1.2.6。
      注：若无法立即提取质粒 DNA，可在离心后弃去 LB-Amp 培养基，将细菌沉淀保存于 -20 °C。
    6. 按照质粒提取试剂盒（中量级）说明书操作，从细菌中提取质粒 DNA。使用分光光度计测定 A260/A280 比值以评估质粒 DNA 的质量。
      注：理想的 A260/A280 比值应>1.8，表明质粒 DNA 提取物纯度较高。较低的 A260/A280 比值提示可能存在蛋白质污染或提取试剂去除不充分，可能需要额外的质粒纯化步骤。

2. C2C12 细胞的培养与转染及嘌呤霉素筛选

  1. C2C12 细胞培养
    1. 在 37 °C 水浴中快速解冻 C2C12 细胞（材料表），并将细胞倒入无菌一次性 15 mL 离心管中，管内预先加入 8 mL 含 100 单位青霉素和链霉素抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（无血清 DMEM），操作在细胞培养超净台中进行。在室温下以 160 × g 离心 3 分钟。
    2. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的完全 DMEM 培养基中。将细胞转移至 10 cm 组织培养处理的塑料培养皿中。将细胞置于 37 °C、5% CO2 气氛的加湿培养箱中孵育。
    3. 次日，更换为新鲜的完全 DMEM 培养基。
    4. 在 3−4 个 10 cm 培养皿中扩增低代次 C2C12 细胞。当 C2C12 细胞达到 50−60% 汇合度时，吸除培养基，并用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。
    5. 加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，室温孵育 2 分钟。在显微镜下观察细胞脱落情况，必要时延长孵育时间，直至大多数细胞脱落。
      注：轻轻敲击培养皿有助于细胞脱落。
    6. 当大多数细胞脱落后，向培养皿中加入 10 mL 完全 DMEM，用移液器反复吹打数次，将细胞悬液转移至无菌一次性 15 mL 离心管中。在室温下以 160 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL 冻存液（10% 二甲基亚砜 [DMSO]/90% FBS）中。
    7. 每 10 cm 培养皿分装两份 1 mL 细胞悬液至冻存管中。将冻存管置于装有室温异丙醇的细胞冻存盒中，在 -80 °C 冰箱中至少放置 24 小时，使冷冻速率达到约 -1 °C/分钟，以避免冰晶形成。长期保存时应将细胞储存在液氮的气相中。
      注：供应商建议 C2C12 细胞使用代次不超过 15 代。作者经验表明，较低代次的细胞向肌管分化更为一致且迅速。必须保持 C2C12 细胞在低密度（<50% 汇合度）下培养，以防止过早启动分化。已分化或正在分化的 C2C12 细胞无法逆转为原始成肌细胞状态，必须弃用。
  2. 转染前 C2C12 细胞的准备
    1. 将未分化的 C2C12 细胞在 10 cm 培养皿中培养至 50−60% 汇合度。吸除培养基，用 10 mL PBS 冲洗细胞，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。室温孵育 2 分钟，在显微镜下观察细胞脱落情况，必要时延长孵育时间，直至大多数细胞脱落。
      注：轻轻敲击培养皿有助于细胞脱落。
    2. 当大多数细胞脱落后，向培养皿中加入 10 mL 完全 DMEM，将细胞悬液转移至无菌一次性 15 mL 离心管中。在室温下以 160 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 4 mL 完全 DMEM 中。
    3. 取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合于 1.5 mL 反应管中，通过反复吹打并轻弹反应管混匀，将混合液转移至细胞计数板。使用自动细胞计数仪测定每毫升细胞数量。
    4. 将 C2C12 细胞稀释至 50,000 个细胞/mL，在 6 孔板中每孔接种 100,000 个细胞（2 mL），使细胞在过夜培养后达到约 40−50% 汇合度。将细胞置于 37 °C、5% CO2 气氛的加湿培养箱中孵育。
  3. 使用聚乙烯亚胺（PEI）对 C2C12 细胞进行 shRNA 质粒转染及嘌呤霉素筛选
    1. PEI 储存液的配制
      1. 在 50 mL 带螺口盖的玻璃培养瓶中，将 16 mg PEI 溶解于 50 mL 无菌蒸馏水中（储存液浓度：0.32 mg/mL）。将溶液在 65 °C 孵育 1 小时，孵育期间多次剧烈涡旋，以确保 PEI 完全溶解。
      2. 每 50 mL 溶液加入 15 µL 1N HCl，调节 pH 至 8。
        警告：盐酸具有腐蚀性。浓盐酸应在通风橱中操作，操作人员应佩戴适当的个人防护装备。
      3. 将 PEI 溶液在 -80 °C 冷冻 1 小时（瓶盖松动），然后在 37 °C 水浴中快速解冻，以进一步提高溶解度。重复冻融循环 3 次。
      4. 将 PEI 储存液分装为 0.5 mL 每份，用于单次使用，并于 -20 °C 保存。
    2. C2C12 细胞的转染
      1. 在 1.5 mL 反应管中，将 25.5 µL PEI 储存液（8.5 µL/µg 质粒 DNA）与 100 µL 25 mM NaCl 混合，37 °C 孵育 5 分钟。另取 3 µg 质粒 DNA 与 100 µL 25 mM NaCl 混合，同样在 37 °C 孵育 5 分钟。
      2. 将稀释后的 PEI 试剂全部加入稀释后的质粒溶液中，轻轻吹打混匀。37 °C 孵育 25 分钟。
      3. 孵育期间，将拟转染的 C2C12 细胞培养基更换为不含 FBS 和抗生素的 DMEM。
      4. 将 PEI/DNA 转染混合物逐滴加入 C2C12 细胞中，并通过轻轻移动培养皿使混合均匀。将细胞置于 37 °C、5% CO2 气氛的加湿培养箱中孵育。6 小时后，更换为完全 DMEM 培养基。
    3. 嘌呤霉素筛选
      1. 转染 24 小时后，更换为筛选培养基（完全 DMEM 加 5 µg/mL 嘌呤霉素）。持续进行嘌呤霉素筛选，直至获得嘌呤霉素抗性 C2C12 细胞，通常需要 10−14 天。
      2. 在低细胞密度（<50−60% 汇合度）下扩增嘌呤霉素抗性 C2C12 细胞，以维持其未分化状态，并按照步骤 2.1.4−2.1.7 所述方法冻存 6−10 管用于后续实验。
        注：常规细胞培养和扩增过程中应持续在培养基中添加 5 µg/mL 嘌呤霉素。但在分化实验中应去除嘌呤霉素。

3. C2C12 分化表型分析

注意：通过调整蛋白质印迹实验中所用的特异性抗体或定量聚合酶链式反应（qPCR）分析中所用的基因特异性引物，下述方法可轻松适用于C2C12成肌细胞向肌管分化的一般表型分析。

  1. C2C12 细胞分化方案与明场显微镜观察
    1. 在12孔板中每孔接种150,000个细胞。将嘌呤霉素抗性的C2C12稳定细胞在含筛选培养基的12孔板中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。使用完全DMEM培养基培养C2C12细胞，直至细胞融合度达到约95%。
    2. 为诱导C2C12细胞分化，将完全DMEM更换为无血清DMEM（定义为分化的第0天）。每两天更换一次培养基，并使用带相机的倒置明场显微镜观察C2C12成肌管的形成。
      注：许多实验方案使用含2%马血清的培养基来诱导C2C12细胞分化为成肌管。在作者的操作中，完全去除血清可达到类似效果。胰岛素被描述为可加速C2C12分化的培养基添加剂。然而，在本方案中，C2C12细胞在撤除血清后3–5天内即可稳定分化为成肌管，因此认为添加胰岛素并非必要。
  2. 肌球蛋白重链（MyHC）免疫荧光染色以可视化成肌管
    1. 在8孔细胞培养板中，每孔加入500 µL完全DMEM，接种50,000个嘌呤霉素抗性的C2C12细胞。在完全DMEM中培养细胞，直至融合度达到95%（约24小时）。
    2. 为诱导分化，将完全DMEM更换为500 µL无血清DMEM（定义为分化的第0天）。在所需时间点，吸除培养基，并用0.5 mL PBS清洗细胞3次。
      注：以下所有步骤均在室温（RT）下进行。
    3. 用0.2 mL PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA）固定细胞15分钟。随后用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。
      警告：PFA具有危害性。应采取适当防护措施，并将多聚甲醛溶液作为危险废物处理。
    4. 用0.2 mL含0.5 M甘氨酸的PBS溶液淬灭PFA反应5分钟。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。
    5. 用0.2 mL含0.1%非离子型表面活性剂/去垢剂（材料表）的PBS溶液孵育细胞10分钟，以通透细胞膜。随后用0.2 mL含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭1小时。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。
    6. 用0.2 mL MyHC一抗（以PBS按1:200稀释）孵育细胞2小时。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。
    7. 用0.2 mL山羊抗小鼠罗丹明红标记的二抗（以PBS按1:200稀释）孵育细胞。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。
    8. 彻底吸除PBS后，每孔加入一滴含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂。加盖盖玻片，并根据制造商说明固化封片剂，最后用指甲油封边。
    9. 使用配备合适滤光片组的荧光显微镜观察C2C12细胞。
  3. 通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）评估基因敲低效率
    1. 按照第3.1节所述方法，在12孔板中于分化条件下培养C2C12细胞。
    2. 在所需时间点，吸除分化培养基，用1 mL PBS清洗细胞一次，然后每孔加入0.5 mL RNA提取试剂（材料表）。通过轻柔吹打使细胞裂解，并将裂解液转移至无菌1.5 mL离心管中。严格按照制造商说明书提取RNA。
      警告：RNA提取试剂含有苯酚，应在通风橱中操作。收集RNA提取试剂废液并作为危险废物处理。实验人员应佩戴适当的个人防护装备。
    3. 将最终的RNA沉淀溶解于20 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中。使用分光光度计测定RNA浓度和纯度，并以A260/A280比值作为质量评估指标。
      注：通常从12孔板的一个孔中可获得5–7 µg总RNA，A260/A280比值为1.8–2.0。
    4. 为消化残留的共纯化基因组DNA，取1 µg RNA溶于PCR管中，总体积为8 µL DEPC处理水。加入1 µL 10×反应缓冲液和1 µL DNase I（1单位/µL）（材料表），室温孵育15分钟。加入1 µL终止液（25 mM EDTA），70 °C孵育10分钟。
    5. 合成cDNA时，将10 µL经DNase处理的RNA与10 µL 2×逆转录酶预混液混合，后者包含逆转录酶、随机引物、4 mM dNTP混合物（dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1 mM）以及逆转录酶反应缓冲液。将反应体系置于热循环仪中，按照制造商推荐程序进行孵育。将合成的cDNA用水稀释至1:5比例。
    6. 配制qRT-PCR反应体系：每反应加入5 µL SYBR Green qPCR预混液、0.5 µL特异性正向引物和0.5 µL特异性反向引物（储存浓度：10 µM），以及2 µL DEPC处理水。将qPCR反应液加入96孔qRT-PCR板的某一孔中，再加入2 µL稀释后的cDNA。每个生物学重复设置三个技术重复，并包括一个看家基因（如Gapdh或Hprt1）作为内参。
    7. 使用qRT-PCR热循环仪进行扩增，程序如下：50 °C 2分钟（尿嘧啶-DNA糖基化酶[UDG]激活），95 °C 2分钟（双锁DNA聚合酶激活），随后进行40个循环：95 °C 15秒，60 °C 30秒，72 °C 1分钟。
    8. 采用DDCt法对qRT-PCR结果进行定量分析，以内参基因（如Gapdh或Hprt1）进行标准化。
  4. 通过蛋白质印迹（Western blotting）评估基因敲低效率
    1. 为进行蛋白质印迹分析，在6孔板中每孔接种300,000个嘌呤霉素抗性的C2C12细胞。24小时后，更换为无血清DMEM以启动分化（定义为分化的第0天）。
    2. 在所需时间点，收集两份1 mL无血清条件培养基至1.5 mL离心管中，在室温下以500 × g离心5分钟，以去除脱落的细胞和细胞碎片。
      注：此步骤仅在研究细胞外基质蛋白或其他分泌蛋白时需要。若目标蛋白位于细胞质或为膜结合蛋白，则可直接吸除培养基，进入细胞裂解步骤（3.4.7–3.4.12）。为尽量减少蛋白降解及其他因细胞层长时间存放导致的非预期后果，细胞裂解应与条件培养基中的蛋白沉淀步骤同步进行。
    3. 离心后，将1 mL条件培养基转移至新的1.5 mL离心管中，通过加入0.391 mL三氯乙酸（TCA）与非离子型表面活性剂/去垢剂的混合液沉淀蛋白。短暂涡旋混合后，冰上孵育10分钟。
      注：使用前立即配制蛋白沉淀混合液，每1 mL条件培养基加入0.252 mL 55% TCA和0.139 mL 1%非离子型表面活性剂/去垢剂，短暂涡旋，溶液将变浑浊。
      警告：TCA具有腐蚀性，必须谨慎操作。
    4. 在4 °C下以>16,000 × g离心10分钟，收集蛋白沉淀，弃去上清液。
      警告：上清液含有TCA，应单独收集并作为危险物质处理。
    5. 用预冷的丙酮清洗蛋白沉淀3次，每次在4 °C下以>16,000 × g离心10分钟。
    6. 在室温下将蛋白沉淀空气干燥3–4分钟，溶于50 µL 1× SDS-PAGE上样缓冲液（含50 mM Tris pH 6.8、2% SDS、6%甘油、0.004%溴酚蓝，并补充5% β-巯基乙醇）。95 °C煮沸5分钟后，按标准流程进行蛋白质印迹，以检测目标蛋白。
      警告：β-巯基乙醇具有恶臭且有毒，必须在通风橱中操作。
    7. 对于细胞内或膜结合蛋白，用2 mL PBS清洗细胞层一次。
    8. 加入1 mL PBS，用细胞刮刀刮下细胞，收集至1.5 mL离心管中，在4 °C下以3,420 × g离心3分钟。用1 mL PBS清洗细胞沉淀3次，每次在4 °C下以3,420 × g离心3分钟。
    9. 为裂解细胞，将细胞沉淀重悬于0.2 mL裂解缓冲液中（含20 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1% NP40、1%脱氧胆酸钠、2.5 mM焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸钠和1 mM正钒酸钠），并补充1×不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，冰上孵育30分钟。
    10. 在冰上以23 kHz工作频率、输出功率设定为10的条件下超声处理15秒。
    11. 在4 °C下以13,680 × g离心20分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，使用商用Bradford法或其他合适方法测定蛋白浓度。
    12. 每个样品取100 µg蛋白，加入5× SDS-PAGE上样缓冲液，总体积调至60 µL，95 °C煮沸5分钟。按标准蛋白质印迹流程分析样品中目标蛋白的表达水平。

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结果

转染后10−14天内即可完成对嘌呤霉素抗性C2C12细胞的筛选，这是由于非抗性（即未转染）细胞被高效清除（图1B）。通常情况下，超过80%的细胞会从细胞培养皿上脱落，并在常规细胞维护过程中被去除。表达对照（随机）shRNA的嘌呤霉素抗性C2C12细胞在低密度时保持纺锤形、细长的细胞形态，并具有分化为肌管的能力。通过撤除血清诱导C2C12细胞分化后，可利用明场显微镜观察并结合肌管标志物——肌球蛋白重链（MyHC）的免疫染色进行监测（图2）。在启动分化后3−5天内可观察到MyHC阳性的肌管。由于在MyHC阳性细胞边界内存在多个DAPI阳性细胞核，表明肌管为多核结构。图3A展示了在完全DMEM培养基中培养的稳定C2C12细胞的明场图像。此处显示的基因敲低效率范围为40−60%（图3B）。由于mRNA是在增殖...

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讨论

本文介绍了一种在 C2C12 成肌细胞中稳定敲低细胞外基质（ECM）蛋白的实验方案，以及对 C2C12 成肌细胞向肌管分化过程进行表型分析的方法。实验结果受多种因素影响，需仔细考虑。保持 C2C12 细胞处于增殖阶段是维持其成肌前体细胞状态的关键步骤。C2C12 细胞能否持续稳定地分化为肌管，取决于以下三个方面：i）细胞的传代次数，ii）常规培养过程中细胞的密度，以及 iii）营养物质的可获得性，后者要求频繁且定期更换细胞培养基11,12,13。由于某些尚未明确的机制，高传代次数的 C2C12 细胞也会丧失进一步发生成肌细胞融合的能力11。C2C12 细胞供应商建议将传代次数控制在15代以内，超过此范围后，细胞的分化能力可能下降，使用此类细胞进行实验可能导致肌管形成的一致性降低。另一方面，常规培养中的细胞密度也可能产生类似影响9。在常规培养过程中若达到汇合状...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

D.H. 获得美国国立卫生研究院（关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所，NIAMS，资助号 AR070748）以及西奈山医学院 Leni & Peter W. May 骨科系种子基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Fisher Chemical191784
琼脂Fisher BioreagentsBP1423
氨苄青霉素Fisher BioreagentsBP1760-5
自动化细胞计数仪 Countesse IIInvitrogenA27977
Bradford 试剂Thermo ScientificP4205987
C2C12 细胞ATCCCRL-1772
腔室载玻片InvitrogenC10283
氯仿Fisher Chemical183172
DMEMGIBCO11965-092
DMSOFisher BioreagentsBP231-100
DNase I（扩增级）Invitrogen18068015
胎牛血清VWR97068-085
GAPDHEMD MilliporeMAB374
甘氨酸VWR Life Sciences19C2656013
山羊抗小鼠二抗（IRDYE 800CW）Li-CorC90130-02
山羊抗小鼠二抗（罗丹明红）Jackson Immune Research133389
HClFisher ChemicalA144S
培养箱（摇床）Denville Scientific Corporation1704N205BC105
巯基乙醇Amresco, VWR Life Sciences2707C122
质粒中量提取试剂盒Qiagen12643
肌球蛋白 4（肌球蛋白重链）Invitrogen14-6503-82
封片剂Invitrogen2086310
NaClVWR Life Sciences241
非离子型表面活性剂/去垢剂VWR Life Sciences18D1856500
多聚甲醛MP199983
PBSFisher BioreagentsBP399-4
PEIPolysciences23966-1
青霉素/链霉素抗生素GIBCO15140-122
培养皿Corning353003
聚丙烯管Fisherbrand149569C
蛋白酶抑制剂混合片剂Roche33576300
嘌呤霉素Fisher ScientificBP2956100
PCR（实时）Applied Biosystems4359284
反应管Eppendorf22364111
逆转录预混液Applied Biosystems4368814
RIPA 缓冲液Thermo ScientificTK274910
sh control 质粒Sigma-Aldrich07201820MN
sh 3086 质粒Sigma-AldrichTRCN0000092578
sh 972 质粒Sigma-AldrichTRCN0000092579
sh 1977 质粒Sigma-AldrichTRCN0000092582
分光光度计（Nanodrop）Thermo ScientificNanoDrop One C
SYBR Green 试剂预混液Applied Biosystems743566
三氯乙酸Acros Organics30145369
Trizol 试剂Ambion254707
台盼蓝GIBCO15250-061
胰蛋白胨Fisher BioreagentsBP1421
胰蛋白酶 EDTA 0.25%Gibco-Life Technology Corporation2085459
水（DEPC 处理且无核酸酶）Fisher Bioreagents186163
Western blot 装置BioradMini Protean Tetra Cell
酵母提取物Fisher BioreagentsBP1422

参考文献

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