质谱引导的基因组挖掘作为发现新型天然产物的工具

摘要

本文建立并描述了一种由质谱引导的基因组挖掘方案。该方案基于基因组序列信息和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，旨在促进从复杂的微生物和植物提取物中鉴定分子。

摘要

天然产物所涵盖的化学空间极为广阔，且在很大程度上尚未被充分认识。因此，亟需便捷的方法来广泛评估其在自然界中的功能以及对人类潜在的益处（例如在药物发现中的应用）。本实验方案描述了基因组挖掘（GM）与分子网络（MN）相结合的方法，这两种现代技术可将全基因组测序中基因簇编码的注释信息与粗制代谢提取物中的化学结构特征相匹配，这是发现新型天然产物的第一步。本文将这两种方法的联合应用定义为质谱引导的基因组挖掘（MS-guided genome mining）。在该方法中，主要成分先前已通过分子网络（MN）确定，而结构相关的新候选分子则通过基因组挖掘（GM）与基因组序列注释相关联。结合基因组挖掘与分子网络是一种高效的策略，可用于靶向发现新分子骨架，或获取代谢谱以从已知化合物中鉴定出类似物。

引言

次级代谢研究通常包括对粗提物进行特定生物活性的筛选，随后对活性组分中的化合物进行纯化、鉴定和表征。这一流程已被证明是高效的，促进了多种化学实体的分离。然而，如今这种方法被认为难以持续，主要原因是重复发现率过高。在制药工业发展的初期，由于缺乏对特化代谢物功能和作用机制的认识，其鉴定工作是在无法真实反映自然环境的实验室条件下进行的¹。如今，人们对自然环境中信号调控、分泌机制以及大多数靶标分子在极低浓度下（难以检测）的存在状态有了更深入的理解。此外，对这些过程的调控将有助于学术界和制药行业充分利用这一知识，并推动与沉默生物合成基因簇（BGCs）相关的代谢物直接分离研究的发展²。

在此背景下，基因组测序技术的进步重新激发了人们对微生物代谢产物筛选的兴趣。这是因为分析尚未被揭示的生物合成基因簇的基因组信息，可以发现编码在实验室条件下未被观察到或未被产生的新型化合物的基因。如今已有大量微生物全基因组项目或草图可供利用，且数量逐年增长，为通过基因组挖掘发现新型生物活性分子提供了广阔前景^3,4。

生物合成基因簇图谱（Atlas of Biosynthetic Gene Clusters）是联合基因组研究所综合微生物基因组平台（....

方案

1. 生物合成基因簇的基因组挖掘

1. 将全基因组测序（WGS）作为选择用于质谱引导基因组挖掘的生物合成基因簇（BCG）的第一步。可通过Illumina MiSeq技术，使用高质量的基因组DNA以及以下试剂盒制备鸟枪法TruSeq PCR-Free文库和Nextera Mate Pair文库，获得目标菌株（细菌）的全基因组草图³³。
   注意：测序完成后，可使用Newbler v3.0（Roche, 454）组装程序（见于 ）对Illumina鸟枪法文库和Illumina配对末端文库进行组装，并采用基于FgeneSB的注释流程（见于 ）进行注释，方法如前所述³³。《微生物资源公告》（Microbiology Resource Announcements, MRA）是一本完全开放获取的期刊，发表存放在公开可用数据库中的各类微生物资源信息（见于 ）。候选蛋白编码基因通过RAST服务器注释³⁴进行识别，全基因组鸟枪法（WGS）项目数据已提交至DDBJ/ENA/GenBank（见于

结果

本研究通过结合基因组挖掘、异源表达以及质谱引导/编码方法，成功实现了对新型缬氨霉素类似物分子的获取。目标分子缬氨霉素（VLM）的“从基因组到分子”工作流程如图8所示。Streptomyces sp. CBMAI 2042的基因组草图经计算机分析后，鉴定出VLM基因簇并将其转移至异源宿主中。异源表达菌株与野生型菌株在适当的发酵条件下进行三重复培养，经乙酸乙酯萃取并浓缩后获得粗提物。对产物进行MS/MS检测，以生成串联质谱代谢物谱图用于分子网络分析。图9展示了来自Streptomyces sp. CBMAI 2042粗提物的MS/MS数据所获得的聚类离子，其中特征性裂解模式及相应的质谱相似性提示存在具有共同结构特征的分子家族²。基于已知的生物合成逻辑和生物信息学分析，并结合基于模式的MS/MS谱图，解析了四种首次报道的环缩肽酯类化合物的结构，并将其来源关联至负责VLM组装的相同生物合成基因簇³²

讨论

该方案最主要的优点在于能够快速去除代谢谱中的重复信息，并将基因组信息与质谱数据相结合，从而阐明新分子的结构，特别是结构类似物²。基于基因组信息，可研究多种天然产物的化学类型，如聚酮类（PK）、非核糖体肽类（NRP）、糖基化天然产物（GNP）以及隐性生物合成基因簇（BGC）。代谢组学筛选可提供证据，显示特定菌株在实验室条件下激活的BGC谱型及其产生的化学多样性。因此，可通过分子网络分析发现的相似性，克隆相应的BGC以定向生产新化合物，或获得与已知BGC相关的未知类似物。该方法有助于区分天然来源中有价值的化合物，并可为天然产物研究流程中常见的后续分离步骤提供指导。

基于质谱的基因组挖掘最初在肽类基因组学⁴¹和糖类基因组学⁴²领域被描述。为了评估肽类天然产物化学多样性的范围，Dorrestein 及其同事开发了一种自动化方法，结合质谱（MS）与基因组学，用于可视化已表达的天然产物（化学型）与其基因簇（基因型）之间的关联。随后，该基于质谱的基因组挖.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Tedia	AA1120-048	HPLC 级
琼脂	Oxoid	LP0011	NA
阿普拉霉素	Sigma Aldrich	A2024	NA
羧苄青霉素	Sigma Aldrich	C9231	NA
离心机	Eppendorf	NA	5804
氯霉素	Sigma Aldrich	C3175	NA
C18 柱	Agilent Technologies	NA	ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar 压力上限 P/N 757700-902
卡那霉素	Sigma Aldrich	K1377	NA
甘露醇 P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
微量离心机	Eppendorf	NA	5418
萘啶酸	Sigma Aldrich	N4382	NA
Phusion Flash 高保真 PCR 预混液	ThermoFisher Scientific	F548S	NA
Q-TOF 质谱仪	Agilent technologies	NA	6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
蔗糖 P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
摇床/培养箱	Marconi	MA420	NA
氯化钠	Synth	NA	P. A. - ACS
大豆提取物	NA	NA	NA
蔗糖	Synth	NA	P. A. - ACS
热循环仪	Eppendorf	NA	Mastercycler Nexus Gradient
硫链丝菌素	Sigma Aldrich	T8902	NA
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042	NA
胰蛋白胨大豆肉汤	Oxoid	CM0129	NA
超高效液相色谱	Agilent Technologies	NA	1290 Infinity LC 系统
酵母提取物	Oxoid	LP0021	NA