利用免疫荧光显微镜鉴定石蜡包埋的猫动脉血栓中的中性粒细胞胞外诱捕网

摘要

我们描述了一种方法，利用热诱导抗原修复和双重免疫标记方案，在甲醛固定和石蜡包埋的猫心源性动脉血栓中鉴定中性粒细胞胞外陷阱（NETs）。

摘要

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）由无细胞DNA（cfDNA）以及组蛋白和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）等蛋白质组成，是中性粒细胞在应对全身性炎症或病原体时释放的结构。尽管先前研究已表明NETs在人类和犬类中可促进血栓形成并抑制纤维蛋白溶解，但其在患有心源性动脉血栓栓塞（CATE）的猫中的作用尚不清楚；CATE是肥厚型心肌病所继发的一种危及生命的并发症。建立一种标准化方法以识别和定量猫心源性动脉血栓中的NETs，将有助于深入理解其在CATE中的病理作用。本文描述了一种技术，用于检测在尸检期间从主动脉分叉处提取的经甲醛固定、石蜡包埋的血栓组织中的NETs。经二甲苯脱蜡后，对主动脉组织切片进行间接加热诱导的抗原修复。随后对切片进行封闭和通透处理，并通过免疫荧光显微镜检测细胞外DNA（cfDNA）、瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的共定位，以识别体外NETs。为优化血栓中NETs的免疫检测效果，在显微镜观察前采用自发荧光淬灭处理以减少组织成分的自发荧光干扰。该技术可能成为研究其他物种中NETs与血栓形成的重要工具，并为这一复杂疾病的发病机制提供新的见解。

引言

患有肥厚型心肌病的猫存在发生危及生命的血栓栓塞性并发症的风险^1,2。尽管猫心源性动脉血栓栓塞（CATE）具有较高的发病率和死亡率，但目前对猫CATE的潜在病理生理机制仍了解甚少。此外，可用于治疗和识别该严重疾病高风险猫的诊断与治疗手段也十分有限³。

除了在先天免疫中的作用外，中性粒细胞还被证实可通过释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）参与血栓形成。NETs 是由无细胞 DNA（cfDNA）构成的网状结构，其上镶嵌有组蛋白以及中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和髓过氧化物酶等颗粒蛋白。在系统性炎症、直接接触病原体或与活化的血小板相互作用时，中性粒细胞可发生 NETs 的形成^4,5,6,7。在犬类中，中性粒细胞来源的 DNA 被证明可抑制血凝块溶解，而 NETs 中的蛋白质则可加速血凝块形成。NETs 能够捕获循环中的细胞及凝血成分，这一能力也是其促血栓特性的重要基础^8,9,10,11,12。

通过细胞外中性粒细胞蛋白、组蛋白和游离DNA（cfDNA）的共定位来检测中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。因此，采用免疫荧光法对脱蜡组织进行固定后组织中NETs的鉴定与定量，优于使用明场显微镜的传统苏木精-伊红（H&E）染色方法^4,5。多项针对人类的研究利用免疫荧光显微技术，已将NETs确认为冠状动脉血栓、脑卒中血栓、动脉粥样硬化性血栓以及静脉血栓的结构组分^{13,14,15,16,17}。迄今为止，尚未有标准化方法用于检测和定量猫血栓中的NETs。鉴于在猫源性动脉血栓中识别NETs可能有助于未来关于NETs与血栓形成机制的转化研究，本文描述了在猫的石蜡包埋动脉血栓组织中鉴定与评估NETs的技术方法。

方案

此处描述的所有方法均按照加州大学戴维斯分校机构动物照护与使用委员会的指南进行。组织的尸检和活检均在获得主人同意后实施。

1. 组织固定、包埋与切片

1. 在人道安乐死或死亡后立即解剖出主动脉分叉部位，包括降主动脉、股动脉和髂总动脉（图1A）。钝性分离筋膜（图1B）后，将组织完全浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中，固定时间不少于24小时，且不超过48小时。
2. 为脱水处理样本，首先将其浸入加热至37 °C的10%中性缓冲福尔马林溶液中1小时。随后依次浸入加热至37 °C的递增浓度乙醇溶液中（70%、95%、100%），每种浓度重复两次，每次1小时。最后，无需冲洗，将样本浸入加热至37 °C的100%甲苯溶液中两次，每次1小时。
3. 加入加热至62 °C的石蜡，使石蜡充分浸透组织，并于室温下静置过夜使其完全凝固。
4. 使用切片机对石蜡包埋的组织进行2–3 µm厚度的切片，并将切片置于带正电荷的玻璃载片上。切片后的组织样本应储存于-80 °C，待后续分析使用。

2. 脱蜡、复水和加热诱导抗原修复

1. 对载玻片上的切片进行脱蜡和复水处理：将载玻片置于染色架上，并按以下顺序操作：
   1. 完全浸入100%二甲苯中3分钟，重复此步骤2次。步骤之间无需冲洗。
   2. 依次浸入浓度递减的乙醇溶液（100%、95%、70%）中，室温（RT）下每种浓度处理3次，每次3分钟。步骤之间无需冲洗。
   3. 完全浸入去离子水中2分钟，重复一次。
2. 将切片放入含0.1%吐温的Tris缓冲盐水（TBST，pH = 7.6）中，孵育2–3分钟。
3. 将加热至100 °C的去离子水注入蒸锅储水槽中，使蒸锅腔体平衡20分钟。
   注意：热诱导抗原修复最好使用具有预设温度控制的蒸汽加热设备（如食品蒸锅）进行间接加热。
4. 将市售的含Tris和EDTA的抗原修复液（pH = 9）置于温控加热板上，持续搅拌并加热至95–97 °C，确保不沸腾。
   注意：溶液加热后应变为浑浊状态。
5. 将加热后的抗原修复液倒入载玻片容器中，并将容器放入蒸锅腔体内，使修复液在蒸锅中平衡3–4分钟，确保腔体温度约为95 °C。
6. 将载玻片完全浸入加热的抗原修复液中，继续通过蒸锅加热20分钟。
7. 从蒸锅中取出载玻片容器，使载玻片和抗原修复液自然冷却至室温（RT）。将稀释后的抗原修复液于4 °C保存，必要时可重复使用最多2次。
8. 用TBST洗涤载玻片3次，每次5分钟。

3. 免疫标记与自发荧光淬灭

注意：表1 详细列出了后续步骤中所用封闭缓冲液的组成成分。

1. 将切片置于封闭缓冲液1中，在室温下轻轻摇动（30–50 rpm）孵育2小时。用石蜡膜密封以防止干燥。
2. 无需洗涤，立即在载玻片上直接加入100 µL稀释后的兔多克隆抗人瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）抗体（0.03 mg/mL，用封闭缓冲液1稀释）。
3. 在每个切片上放置盖玻片（24 mm × 40 mm × 0.13–0.17 mm），使抗体混合物均匀分布。
4. 在4 °C下轻轻摇动（30–50 rpm）孵育12–16小时。用Parafilm膜密封以防止干燥。
5. 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
6. 按照步骤3.3所述方法，加入100 µL与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔抗体（最终浓度稀释至0.04 mg/mL或1:50，用封闭缓冲液1稀释），在室温下轻轻摇动（30–50 rpm）孵育1小时。避免光照。
7. 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
8. 将切片在封闭缓冲液2中于4 °C下轻轻摇动（30–50 rpm）过夜孵育。避免光照。
9. 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
10. 按照步骤3.3所述方法，在室温下用封闭缓冲液3封闭切片2小时，同时轻轻摇动（30–50 rpm）。
11. 按照步骤3.2–3.4所述方法，在4 °C下用生物素标记的兔多克隆抗人中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体（终浓度 = 0.2 µg/mL，溶于封闭缓冲液3）孵育切片12–16小时。
12. 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
13. 按照步骤3.2–3.3所述方法，在室温下用Alexa Fluor 594标记的链霉亲和素偶联物（用封闭缓冲液3稀释至1:100或0.02 mg/mL）孵育1小时。避免光照，并用石蜡膜密封以防干燥。
14. 用TBST洗涤1次，每次5分钟。
15. 按照试剂盒说明书操作，直接将100 µL自发荧光淬灭溶液混合物加至切片上，作用1分钟。
16. 立即用TBST洗涤6次，每次10分钟。
17. 在暗处向每张载玻片加入100 µL 300 nM DAPI，染色5分钟。
18. 用TBST洗涤3分钟，重复共5次。
19. 取一滴（约50 μL）抗荧光淬灭封片剂（自发荧光淬灭试剂盒组分之一），直接加至切片周围的载玻片上。轻轻放置盖玻片（24 mm × 40 mm × 0.13–0.17 mm），避免产生气泡。
20. 将样品置于4 °C暗处过夜固化，直至封片剂完全硬化，以便使用浸油物镜进行显微分析。

4. 中性粒细胞胞外诱捕网的鉴定

注意：以下实验方案使用配备1,280 x 960数字CCD相机的倒置落射荧光显微镜（参见材料表）。

1. 为定位血栓，使用10倍物镜在相差显微镜下沿主动脉全长、主动脉分叉及每侧股动脉从头侧向尾侧进行扫描。在相差显微镜和明场显微镜下，血栓表现为紧邻内皮组织的红细胞、白细胞和血小板的聚集物（图2A，图2B）。
2. 首先使用DAPI通道（激发波长 = 357/44 nm）结合10倍和20倍物镜观察切片中的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）（图2C）。需注意，在相差或明场显微镜下观察时，游离DNA（cfDNA）表现为未被限制在细胞胞浆范围内的去凝集DNA结构。
3. 分别使用10倍、20倍和40倍物镜，在Texas Red通道（激发波长 = 585/29 nm，发射波长 = 628/32 nm）和绿色荧光蛋白通道（激发波长 = 470/22 nm，发射波长 = 525/50 nm）中识别细胞外的弹性蛋白酶（NE）和瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）。
4. 使用可用软件（如NIH开发的Image J）对血栓内的NETs进行评估与分析。根据先前描述的方法，通过cfDNA、细胞外citH3和NE的共定位来判定NET的形成¹⁸。在整个图像采集过程中，应保持各通道的曝光时间和增益一致，以避免像素强度饱和。
5. 根据血栓与降主动脉的相对位置，将其分为三个等长区域进行定位：区域1最靠近主动脉，区域3距离主动脉最远，区域2位于区域1与区域3之间。在操作者对各受试者病情设盲的情况下，每个区域至少随机选取十个视野进行观察。通过计算每个区域内含有NETs的视野数量的平均值，或计算每个区域NET占据面积的平均值，来表征NETs在血栓中的分布情况。

结果

通过采用该方案对石蜡包埋的血栓进行脱蜡、热诱导抗原修复和双重免疫标记，我们首次在猫自发性动脉血栓栓塞（CATE）中鉴定出中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。使用荧光显微镜和明场显微镜结合标准H&E染色及相差显微镜观察，定位位于主动脉分叉处的血栓。在明场显微镜下，猫动脉血栓由红细胞、白细胞、纤维蛋白和血小板组成（图3A）。尽管H&E染色无法特异性标记NET的组分，但NET常表现为深紫色、长短不一的丝状网络结构，环绕在邻近的红细胞和白细胞周围（图3A，虚线轮廓）。在相差显微镜下，血栓表现为血管腔内边界清晰的结构（图2A，图4B）。我们进一步通过免疫荧光显微镜确认了这些区域中存在NETs（图3B）。对这些区域的放大观察显示，大量NET聚集物由细胞外DNA（cfDNA）、胞外瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）...

讨论

我们描述了一种利用双重免疫标记法和免疫荧光显微镜技术在固定的猫心源性动脉血栓中鉴定中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的实验方案。尽管本研究仅对心源性动脉血栓进行了染色，但理论上该方案也可用于其他类型的血栓以及其他兽医相关物种。在猫动脉血栓中鉴定出NETs，提示NETs可能在猫的血栓形成过程中发挥作用。

通过免疫荧光法检测经固定和石蜡包埋的组织中的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），其效果优于常规的苏木精-伊红（H&E）染色，后者通常仅显示被中性粒细胞包围的染色质细丝¹³。对固定的动脉血栓进行免疫组织化学和免疫荧光染色，可同时检测到细胞外游离DNA（cfDNA）及其他细胞外蛋白（如瓜氨酸化组蛋白H3，citH3），后者已被证实为NETs形成的特异性标志物^18,19。由于冷冻制备样本在检测组织和血栓中的NETs时效果欠佳，我们采用含4%甲醛和10%甲醇的10%中性缓冲福尔马林固定样本。游离核酸不会被甲醛直接固定...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Life Technologies Corporation	D1306
Alexa Fluor 594 链霉亲和素偶联物	ThermoFisher Scientific	目录号 S11227
抗瓜氨酸化组蛋白 H3 抗体	Abcam	Ab5103
EVOS FL 细胞成像系统	ThermoFisher Scientific	AMEFC4300
EVOS 成像系统 10x 物镜	ThermoFisher Scientific	AMEP4681	数值孔径 0.25，工作距离 6.9/7.45 mm
EVOS 成像系统 20x 物镜	ThermoFisher Scientific	AMEP4682	数值孔径 0.40，工作距离 6.8 mm
EVOS 成像系统 40x 物镜	ThermoFisher Scientific	AMEP4699	数值孔径 0.75，工作距离 0.72 mm
山羊抗兔 Alexa Fluor 488 抗体	ThermoFisher Scientific	目录号 A32723
山羊血清	Jackson Immuno Research Labs	目录号 NC9660079，厂家货号 005-000-121
中性粒细胞弹性蛋白酶抗体	Bioss Antibodies	Bs-6982R-Biotin	兔多克隆抗体，生物素标记
NP40	Pierce	产品编号 28324，批号 EJ64292
正电荷载玻片	Thomas Scientific	厂家编号 1354W-72
兔血清	Life Technology	目录号 10510
靶标修复溶液	Agilent Dako	S2367	TRIS/EDTA，pH 9（10倍浓缩）
TrueVIEW 自发荧光淬灭试剂盒	Vector Laboratories	SP-8400