本文旨在介绍一种改进的小鼠插管方法。该方法具有非侵入性，因此非常适合需要对呼吸功能进行连续监测和/或向肺部给予治疗物质的研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
文献中描述了多种小鼠插管方法，这些方法要么需要通过口腔观察声门，要么需在颈部腹侧做切口以直接确认导管在气管内的位置。此类操作的相对难度或对实验动物造成的组织创伤，可能会影响研究者开展纵向研究的能力。本文介绍了一种技术：在使用脱毛剂去除小鼠颈部腹侧毛发后，通过物理操作小鼠，可实现气管的经皮可视化，从而进行经口插管，且不受皮肤色素沉着程度的影响。该方法对实验动物无伤害，且仅需掌握有限的小鼠解剖学知识即可轻松完成。这种改进的方法有助于实现反复插管，这对于监测疾病进展或给予治疗干预可能是必要的。采用此方法可减少在呼吸系统疾病小鼠模型中测定肺功能所需的动物数量和技术要求。
引言
实验室小鼠是人类呼吸系统疾病的常用动物模型。因此，已有多种发表的方法用于小鼠插管，以实现治疗药物的灌注以及呼吸力学的测量。大多数已描述的操作程序需要借助喉镜或光纤光源等特殊设备，通过口腔观察声门1,2,3,4,5,6,7。然而，当需要使用相对较粗的导管时，操作可能变得困难，因为导管会遮挡研究人员的视野。Limjunyawong 等人8提出了一种改进的插管方法，通过在颈部腹侧正中线做一小段皮肤切口，暴露气管以实现可视化。操作完成后，使用组织粘合剂闭合切口。
对于需要频繁重复插管的研究，反复切开和闭合该部位会导致颈部腹侧皮肤边缘的清创以及组织损伤。经皮气管可视化引导的经口插管技术旨在提供一种精细且无创的方法，特别适用于小鼠的重复插管研究，也适用于单次插管操作。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有动物实验均已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并在经AAALAC认证的设施中进行。
1. 实验准备
- 构建插管平台。为获得合适的平台坡度，使用一个三英寸（7.6 cm）的三环活页夹。将一段15−20 cm长的3-0丝线或其他线材对折，并用胶带将线的两端粘贴在倾斜平台的顶部，形成一个悬挂环（图1）。
- 选择合适尺寸和长度的套管。
注意：对于体重20−30 g的小鼠，可使用长度为1−1.5英寸（2.5−3.8 cm）、规格不超过18 G的导管。本研究中使用了18周龄雌性BALB/c小鼠和10周龄C57BL/6小鼠（每种品系n = 3）。不透明的白色导管鞘可提供最佳的经皮可视性。 - 在导管远端尖端切割出斜面，并用砂纸打磨切面以形成圆滑的斜面尖端。在距离斜面约1 cm处，轻轻弯曲套管形成轻微弯度（图2）。
注意：每只小鼠应使用新的导管。 - 通过腹腔注射给予氯胺酮（5.4 mg/g体重）和赛拉嗪（16 µg/g体重）麻醉小鼠。 在眼睛上涂抹无菌眼用软膏。
注意：通过用力捏压脚趾无反应来判断麻醉深度是否合适。 - 将小鼠仰卧位悬挂在插管平台上，将其上门齿钩在倾斜表面顶部的丝线上（图3）。当小鼠准确处于仰卧位置后，轻轻抓住尾根部并向操作台方向牵拉尾巴，再用胶带固定尾根部以固定小鼠。
- 在颈部腹侧区域涂抹脱毛膏（材料表），保持30−45秒，然后用干纱布彻底清除颈部区域的所有脱毛膏。如有需要，可重复涂抹。用生理盐水或蒸馏水彻底冲洗皮肤以去除残留物，随后擦干。
2. 插管操作步骤
- 用非优势手持直而扁平的镊子，轻轻牵拉舌头，使口腔充分打开，以便引入导管。
注意：不应使用鼠齿镊，否则会损伤舌头。 - 用优势手将导管推进口腔，使导管上略弯曲处远端的末端紧贴受试动物口腔顶部。
- 松开舌头，将闭合的镊子扁边沿颈部腹侧向尾侧滑动，直至到达胸骨柄。此动作可将唾液腺向侧方推移，并压平覆盖气管的肌肉。气管透过皮肤呈现为一条白色线条（图3A）。如有必要，在保持皮肤向尾侧牵拉张力的同时，将镊子朝头背侧旋转，使被推向侧方的唾液腺隆起。该操作可增强气管周围的对比度（图3B）。
注意：避免对颈部腹侧施加过大压力，否则可能导致气管塌陷并影响呼吸。 - 推进导管的同时，通过优势手的旋后动作并伴随腕关节屈曲，使导管远端尖端向腹侧倾斜。
- 导管位置正确的标志是在气管内可见不透明的导管（图4B,D）。若导管已推进至咬肌起点水平以下但仍未确认其位于气管内，则应撤回导管并重新尝试操作。
- 通过将肺充气球连接至导管并观察装置下压时胸廓扩张情况，确认导管位置是否正确。
- 在不移动导管的前提下，小心将小鼠门齿从插管平台解钩。将小鼠转移至水平平台（材料表），并将导管插入呼吸机上的适配器。完成深部充气后，对小鼠通气60秒，随后测量呼吸阻力。
3. 恢复
- 操作完成后，将小鼠移至预热的平台。通过持续轻捏脚趾或尾部给予刺激，以促进其自主呼吸。
- 当小鼠刚开始出现咀嚼动作时，即可进行拔管。在接头水平处夹住套管，轻柔地将管子向头侧方向并远离小鼠身体牵拉，直至套管完全从小鼠口腔中移除。
注意：在恢复过程中，尽可能长时间地使用硬质套管维持气道通畅是较为理想的做法。 - 拔管后，将小鼠转移至带有加热支持的清洁恢复笼中。持续监测小鼠状态，直至其完全恢复自主活动能力，完成恢复过程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
基线肺功能的连续监测
分别于第0、3、10和17天，对18周龄雌性BALB/c小鼠和10周龄C57BL/6小鼠（每种品系n = 3）采用前述方法进行气管插管。每次插管后，将小鼠连接至机械呼吸机，并通入100%氧气（材料表）。在给予深部充气至25 cm H2O并维持5秒后，采用强迫振荡技术测量呼吸系统阻力（Rrs），持续60秒。在整个屏气过程中未出现软件错误，且Rrs值处于生理范围内，进一步证实了导管位置正确。数据显示，在每种品系内，各时间点测得的Rrs值之间无显著差异（图5）。据此推断，在连续四个时间点上Rrs未随时间增加，表明呼吸系统未发生与操作相关的创伤性炎症。
统计分析
描述性统计（均值和标准误）使用统计分析软件计算得出（材料表）。采用 Kolmogorov-Smirnov 方法验证数据的高斯分布。数据集的统计分析采用非配对 ANOVA 进行，显...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
采用经皮气管可视化技术进行插管，为标准皮肤切开法提供了一种更为精细的替代方案。只要特别注意几个关键步骤，即可快速、顺利地完成插管。动物必须准确地仰卧于插管平台上，并将小鼠稳妥固定以实现轻柔牵拉，从而使其身体伸展至垂直对齐状态，为插管提供正确的体位。此外，脱毛膏与动物皮肤接触的时间不应超过30−45秒，并应彻底冲洗以清除所有残留物。脱毛膏与皮肤接触时间过长会引起动物不必要的疼痛，且可能导致溃疡，进而阻碍对气管的观察9。当主用手将导管插入声门时，必须采用正确的手腕动作：主用手腕应屈曲，同时手部做旋后运动。在使用镊子的扁平边缘压迫颈部腹侧以观察气管时，必须密切监测实验对象。若镊子施加的压力持续时间过长，会导致气管阻塞并引发缺氧。若发现动物出现发绀现象，应暂停操作，待黏膜颜色恢复粉红、呼吸稳定后再重复尝试。
进行此项技术无需 extensive 的小鼠插管经验。经验不足者最常见的并发症包括因多次插管尝试导致的喉部损伤和上呼吸道炎症。这些动物在恢复期间需要密切监测，可能需要使用非甾体抗炎药进行医疗干预。反复插管失败可能导致远端口腔组织损伤和炎症...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Lucia Rosas、Lauren Doolittle、Lisa Joseph和Lindsey Ferguson提供的技术协助，以及大学实验动物资源中心提供的动物护理支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）T35OD010977和R01-HL102469项目资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 G x 1 1/4" 静脉导管，Safelet | 费舍尔科学公司 | #14-841-14 | 插管用套管 |
| 70% 乙醇，10 L | 费舍尔科学公司 | 25467025 | 清洁套管 |
| 砂纸（磨砂纸） | 波特-电缆公司 | 74001201 | 套管制备 |
| AnaSed（赛拉嗪无菌溶液）注射液（100 mg/mL） | Akorn 动物健康公司 | NDC# 59399-111-50 | 麻醉 |
| 蓝色标签胶带（0.5 英寸 x 14 码） | 费舍尔科学公司 | 15966 | 固定插管平台 |
| 带线无针编织丝线缝合线（3-0），非无菌 | 亨利·谢因公司 | 货号 #1007842 | 插管平台 |
| Deltaphase 等温垫 | 布雷因特里科学公司 | 39DP | 小鼠体温调节与恢复 |
| Deltaphase 手术板 | 布雷因特里科学公司 | 39OP | 小鼠恢复（拔管前） |
| 蒸馏水 | 赛默飞世尔科技公司 | 15230253 | 脱毛后清洁小鼠 |
| 眼科剪刀，成角，锐/锐 | 哈佛仪器公司 | 72-8437 | 套管制备 |
| FlexiVent（FX 模块 2） | Scireq 公司 | N/A | 记录肺功能数据（非操作必需，本研究中用于验证操作） |
| 纱布海绵 | 费舍尔科学公司 | 13-761-52 | 脱毛 |
| 重型 3" 三环视窗活页夹 | Staples 公司 | 24690CT | 插管平台 |
| Instat 软件 | Graphpad 公司 | N/A | 统计分析软件 |
| 胰岛素注射器（0.5 cc，U100） | 费舍尔科学公司 | 329461 | 麻醉给药 |
| 盐酸氯胺酮注射液，USP（100 mg/mL） | Llyod 实验室 | 目录号 4871 | 麻醉 |
| 肺膨胀球囊 | 哈佛仪器公司 | 72-9083 | 确认套管位置 |
| 微型弯头平头镊 | 哈佛仪器公司 | 72-0445 | 牵拉舌头并在颈部施加张力以可视化套管 |
| Nair（脱毛乳液），9 盎司瓶装 | Church & Dwight 公司 | 42010440 | 脱毛 |
| 无菌生理盐水（0.9%），10 mL | 费舍尔科学公司 | NC9054335 | 麻醉，脱毛后皮肤清洁 |
参考文献
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179(1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107(2013).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
