无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

摘要

本文介绍了一种利用带有loxP位点的盒式基因交换突变技术（FLAEM）在Chlamydia trachomatis中实现靶向、无标记基因删除的方法。

摘要

Chlamydia trachomatis 是一种专性胞内病原体，历史上对其遗传操作一直存在困难。由于缺乏有效的遗传工具，目前对 C. trachomatis 建立和维持其特异性胞内生态位机制的研究进展有限。幸运的是，近年来在遗传操作技术方面取得了一系列新进展。其中一项是荧光报告等位基因交换诱变技术（FRAEM）。该方法可实现靶向基因删除，并同时插入编码抗生素抗性及绿色荧光蛋白（GFP）的筛选盒。然而，当靶向多顺反子操纵子内的基因时，由于可能对下游基因产生极性效应，该策略的应用会变得复杂。本文所述的“loxP位点修饰筛选盒等位基因交换诱变技术”（FLAEM）正是为减轻筛选盒引起的极性效应而开发的。FLAEM利用Cre-loxP基因组编辑技术，在通过等位基因交换实现靶向删除后，将筛选盒切除。最终获得的菌株包含一个或多个编码序列的无标记基因缺失。该技术有助于直接评估基因功能，并拓展了 C. trachomatis 遗传操作工具的应用范围。

引言

Chlamydia trachomatis 是细菌性性传播疾病的首要致病原，对人类健康构成重大负担。每年有超过一亿人感染 C. trachomatis¹。尽管该感染可导致盆腔炎、异位妊娠和/或不孕等严重生殖健康问题，但约70%的女性感染者无明显症状。疾病后遗症与 C. trachomatis 感染引发的免疫病理反应直接相关²。目前尚无有效的疫苗问世，因此，阐明细菌毒力因子及其他细菌基因产物的功能是一个重要而紧迫的研究课题。

作为胞内细菌，宿主细胞侵袭、胞内复制、子代释放以及逃避免疫应答是其关键的生命过程。C. trachomatis 会形成一种由寄生性膜包围的空泡结构，称为包涵体（inclusion），用于胞内发育。包涵体的建立及其他许多关键过程依赖于通过III型分泌系统（T3SS）分泌效应蛋白来实现³。由于C. trachomatis遗传操作困难，这些分泌效应蛋白的功能在多年内一直难以阐明。与E. coli不同，许多经典克隆技术不适用于Chlamydia。主要限制因素包括转化效率低、缺乏如sacB等反向筛选报告基因，以及质粒稳定性差等问题。虽然E. coli质粒通常只需复制....

方案

1. 设计并构建针对目标基因的具有同源臂的pSUmC-4.0质粒

1. 确定目标基因上下游约 3 kb 的区域，作为同源重组的 5' 和 3' 同源臂图1).
2. 设计PCR引物以：1）从衣原体基因组DNA扩增约3 kb的5'同源臂，以及2）在Sall限制性酶切位点消化后，包含一段长度为15–30 bp、特异性针对pSUmC-4.0的突出末端。确保引物中与pSUmC-4.0重叠区域的熔解温度为55 °C，且整个引物的发夹结构熔解温度 <35 °C
3. 设计PCR引物以：1）从衣原体基因组DNA扩增约3 kb的3'同源臂，以及2）在SbfI限制性酶切位点处切割后，包含一段特异性针对pSUmC-4.0的15–30 bp突出端。确保引物中与pSUmC-4.0重叠区域的熔解温度为55 °C，且整个引物的发夹结构熔解温度 <35 °C
4. 设计PCR筛选引物，用于在DNA组装反应后扩增每个同源臂插入pSUmC-4.0载体的片段¹⁶设计引物时应使其退火位置位于限制性酶切位点外侧约 500 bp 处，以便即使插入失败也能轻松观察到 PCR 产物（图1).
5. 从新提取的衣原体基因组DNA中，通过PCR扩增约3 kb的5'和3'同源臂，可使用一至两个反应以获得足量的片段用于后续DNA组....

结果

利用FLAEM技术在C. trachomatis中实现无标记基因删除的方法依赖于精细的克隆和转化技术。成功的等位基因重组是关键的第一步，需要将同源臂序列鉴定并插入到pSUmC-4.0克隆载体中（图1）。无标记基因删除的第二个关键步骤是通过Cre-lox基因组编辑技术去除荧光报告基因和抗生素筛选盒，如图2所示。图3标注了完成上述每一步所使用的载体。图4展示了从野生型C. trachomatis出发，构建无标记基因删除突变株的转化策略示意图。

代表性数据如图5和图6所示，其中以tmeA为基因敲除靶点。利用FRAEM技术构建了C. trachomatis tmeA.......

讨论

本文所述利用FLAEM技术在C. trachomatis中构建无标记基因缺失的方法，可实现对非必需基因的靶向删除，并消除因插入筛选标记盒所引发的极性效应。该方案依赖于将精心设计的5'和3'同源臂插入pSUmC 4.0自杀型载体，高效转化C. trachomatis，并对分离获得的突变菌株进行细致筛选。通过该方法成功实现基因组编辑的细菌将不具荧光，且在目标基因缺失位点仅保留一个loxP疤痕序列。此外，该方法有望被进一步优化，用于在同一C. trachomatis菌株中连续靶向多个基因。

精心设计5'和3'同源臂并将其插入自杀载体，是克隆过程的第一步，也是最关键的一步。研究发现，3 kb的同源臂可提供最高效的等位基因重组效率。尽管插入这些同源臂会产生较大且有时难以操作的载体，但较短的同源臂效果较差，其中约2 kb是获得成功所需的最小长度。在进行DNA组装时，利用Sall和Sbfl限制性酶切位点可实现便捷的一步式构建反应。

其他克隆方法（如插入式PCR）在插入同.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	KSE Scientific	BMK-A1705	分子生物学级
盐酸无水四环素	ACROS Organics	233131000
CaCl2 缓冲液			10 mM Tris pH 7.4, 50 mM 二水氯化钙
二水氯化钙	Sigma	C7902-500G	适用于细胞培养
放线菌酮	Sigma	7698-1G
dam-/dcm- 感受态 E. coli	New England BioLabs	C2925H
DMSO	ATCC	4-X	经无菌过滤且适用于细胞培养检测
谷氨酸	Sigma	G8415-100G	L-谷氨酸
生长培养基 #1			RPMI 1640 培养基，添加 10 % (vol/vol) 热灭活胎牛血清 (FBS)。
生长培养基 #2			RPMI 1640 培养基，添加 10 % (vol/vol) 热灭活胎牛血清 (FBS) 和 1 µg/mL 放线菌酮
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) (1x)	Gibco	24020-117
热灭活胎牛血清（经鉴定合格的一次性使用）(FBS)	Gibco	A38402-02
McCoy 细胞	ATCC	CRL-1696
Monarch 质粒小量提取试剂盒	New England BioLabs	T1010S	小规模 DNA 纯化
NaH2PO4	Sigma	S3139-250G	磷酸二氢钠
Na2HPO4	Sigma	S5136-500G	磷酸氢二钠
NEB 10-beta 电转感受态 E. coli 细胞	New England BioLabs	C3020K
NEBuilder HiFi DNA 组装克隆试剂盒	New England BioLabs	E5520S	Gibson 组装试剂盒
青霉素 G 钠盐	Sigma	P3032-10MU	适用于细胞培养的生物试剂
QIAGEN 质粒大量提取试剂盒	QIAGEN	12162	大规模 DNA 纯化
Q5 热启动高保真 DNA 聚合酶	New England BioLabs	M0515	片段 PCR 聚合酶
RPMI 1640 培养基 (1x)	Gibco	11875-093	含 2 mM L-谷氨酰胺
Sall-HF	New England BioLabs	R3138S
Sbfl-HF	New England BioLabs	R3642S
筛选培养基 #1			RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL 放线菌酮, 500 µg/mL 壮观霉素，以及溶解于 DMSO 的 50 ng/mL 无水四环素
筛选培养基 #2			RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL 放线菌酮, 500 µg/mL 壮观霉素
筛选培养基 #3			RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL 放线菌酮, 50 ng/mL aTc, 以及 0.6 µg/mL 青霉素
乙酸钠缓冲液	Sigma	S7899-100ML	3M
SOC 增殖培养基	New England BioLabs	B9020SVIAL
盐酸壮观霉素五水合物，细胞培养级	Alfa Aesar	J61820
蔗糖	Sigma	S1888-1KG	适用于细胞培养的生物试剂
蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液 (SPG)			37.5 g 蔗糖, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 g 谷氨酸，溶于 500 ml 组织培养级水中
Tris	AMRESCO	0497-5KG	超纯级
胰蛋白酶-EDTA (1x)	Gibco	25200-056	0.25%
水	Sigma	W3500-500ML	经无菌过滤，生物试剂，适用于细胞培养