通过测量活细胞中的 eIF4E-eIF4G 交互来监控 eIF4F 装配

Summary

在这里，我们提出了一个协议，以测量eIF4E-eIF4G在活细胞中的相互作用，使用户能够评估药物引起的扰动eIF4F复杂动态的筛选格式。

Abstract

eIF4F复合物的形成已被证明是信号通路收敛的关键下游节点，这些信号通路经常在人类中经历致癌活化。eIF4F 是一个上限绑定复合体，涉及翻译启动的 mRNA - 相关招聘阶段。在许多癌症的细胞和临床前模型中，eIF4F 的放松管制导致参与癌症增殖和生存的特定 mRNA 子集的翻译增加。eIF4F 是一个由上限绑定子单位 eIF4E、六角酶 eIF4A 和脚手架子单元 eIF4G 构建的异质三元复合体。活性eIF4F复合物组装的关键在于eIF4E和eIF4G蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。在本文中，我们描述了一个测量 eIF4F 组件的协议，该程序可监控活细胞中的 eIF4E-eIF4G 交互状态。eIF4e:4G 基于细胞的蛋白质-蛋白质相互作用检测还允许准确可靠地评估 eIF4F 复杂完整性的药物诱导变化。我们设想，这种方法可以应用于验证市售化合物的活性，或进一步筛选有效破坏eIF4F复合物形成的新化合物或方式。

Introduction

基因表达控制在正确执行细胞程序（如生长增殖和分化）方面起着至关重要的作用。监管控制机制可以在基因转录水平或mRNA转化水平上进行。在过去十年中，越来越明显的是，通过调节启动过程而不是后来的拉长和终止步骤进行转化控制，可以精细地调节具有广泛生物功能的蛋白质特定子集的合成。

参与生存、抗自噬和抗凋亡反应的 mRNA 的翻译增加与几种癌症有关，并且与异常激活或过度表达翻译启动因子¹有因果关系。

eIF4F 综合体是翻译启动的主调节器。通过将上限结构与 mRNA 的 5' 端绑定，eIF4F 正在推动初始 mRNA-里博索姆的招聘，进而提高翻译不力的真核素 mRNA²的 mRNA 翻译效率。据报道，许多癌症模型都存在异常激活RAS/MAPK或AKT/TOR通路的癌症模型，eIF4F的中介翻译，这表明癌细胞会调节eIF4F，以增强自身的抗肿瘤活性。通过抑制eIF4F复合形成来破坏这个进气回路，因此是一个非常有希望的治疗策略^3，4。

eIF4F 综合体由 （i） eIF4E 组成， eIF4F 的帽绑定子单位，与 mRNA 的 5' UTR、（ii） eIF4A、RN....

Protocol

HEK293细胞系用于协议，并在杜尔贝科的改良鹰介质中培养，补充10%胎儿牛血清，2米L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素/链霉素。细胞在37°C的培养下_，在潮湿 的环境中产生5%的二氧化碳。

1. 通过 eIF4E 对 eIF4F 复杂中断进行定量评估:eIF4G^604-646 补充分析

1. eIF4E 的细胞培养和瞬态瞬变:eIF4G^604-646 补充测定
   1. 使用新鲜解冻的细胞，所有实验的通道少于20个。在第 1 天，使用标准细胞计数器确定细胞编号，并使用 Trypan 蓝色排除方法¹³计算总可行细胞。
   2. 种子 6 井板与 0.9 - 1.2 x 10⁶ 的 HEK 293 细胞每井在 2 mL 的标准生长介质.
      注意:为了在上述细胞系内实现最佳的转接效率，确保镀膜细胞在播种后的第二天达到70-90%的汇流。
   3. 在第2天早晨，使用脂基转染试剂（见材料表）与 SubA-eIF4E 和 eIF4G^604-646-SubB 质粒共同传输细胞（见下文所述）。
      1. 在含有 125μL 的减少血清介质的管中稀释 9μL 脂质溶液，每次转染时不含酚红色（见 材料表），并在室温下....

Results

为了验证eIF4E:eIF4G^604-646 补充系统的灵敏度，使用mTOR抑制剂对eIF4F复合组件进行了4EBP1介停抑制评估。通过抑制4EBP蛋白家族的mTORC1激酶依赖磷酸化，mTOR抑制增强4EBP1与eIF4E的关联，因此，eIF4F拆解^15。测试了两类机械上不同的mTOR激酶抑制剂:拉帕洛格（如拉帕霉素），它们是mTORC1的同位素抑制剂，但不是mTORC2和ATP基于竞争的抑制剂（例如PP242），它们专门用来抑制mTORC1和mTORC2激酶催化活性。

HEK293 细胞与 eIF4E:eIF4G^604-646 补充系统（如第 1 步中描述的那样）发生变异。经过24小时的转染后，细胞被重新播种，并使用mTOR抑制剂PP242和拉帕霉素（如第1.2步所述）治疗。治疗四小时后，按照先前描述，对发光进行了评估，然后是细胞存活率。如图

Discussion

本文所述方法采用基于路西法酶的补充测定法，通过直接测量活细胞中的eIF4G-eIF4E相互作用，对eIF4F复合组件进行定量监测。我们提供了使用eIF4E-eIF4G补充系统的详细信息，也表明该系统在测量eIF4E-eIF4G相互作用¹⁶的药物诱导4EBP1介导分离方面非常准确。为了便于此检测的吞吐量，本文中描述的实验设置已设计为 96 井微板格式的使用。

为了获得最佳结果，在执行测定时应考虑两个关键步骤。首先，实验之间的转染效率应该保持相似。这可以通过使用低通道数细胞，并通过在播种当天严格计数细胞来确保。在进行DNA转化之前，还应评估细胞共性，因为如果细胞共性小于70-90%，则不建议用脂基转染试剂对细胞进行变质。其次，将补充分析与细胞生存性分析进行多重分析非常重要。某些化合物可能主要通过有害效应减少可行细胞的数量来影响路西法酶信号。因此，在 eIF4E:eIF4G^604-646 补充测定后立即测量细胞的生存能力，以解决目标外和非特定影响非常重要。

....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT 细胞	Thermo Fisher Scientific	R70007
细胞培养微孔板 96 孔，F 底	greiner bio-one	655083
细胞滴度 Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision 多标签阅读器	PerkinElmer	不适用
Finnpipette F2 多通道移液器 12 通道 30-300 ml	Thermo FisherScientific	4662070
Finnpipette F2 多通道移液器 12 通道 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI 入门系统	PROMEGA	N2014
Optimem I 减血清 Mediun，无酚红	Thermo Fisher Scientific	11058021
轨道摇床	Eppendorf	不适用
&γ;-氨基苯基-m7GTP （C10-spacer）-琼脂糖	Jena Bioscience	AC-155S