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方法文章

通过活细胞中eIF4E-eIF4G相互作用的检测来监测eIF4F复合物的组装

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DOI：

10.3791/60850

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2020年5月1日

 ,  , 
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

本文内容

摘要

本文介绍了一种在活细胞中检测eIF4E与eIF4G相互作用的实验方案，该方法可用于在筛选条件下评估药物对eIF4F复合物动态的干扰作用。

摘要

eIF4F复合物的形成已被证实是多种信号通路在人类中发生癌基因激活后汇聚的关键下游节点。 eIF4F是一种帽结合复合物，参与翻译起始过程中mRNA与核糖体的招募阶段。在多种细胞和癌症的临床前模型中，eIF4F的失调会导致特定mRNA亚群的翻译增加，而这些mRNA与肿瘤的增殖和存活密切相关。eIF4F是由帽结合亚基eIF4E、解旋酶eIF4A以及支架亚基eIF4G组成的异源三聚体复合物。活性eIF4F复合物组装的关键是eIF4E与eIF4G蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用。本文中，我们描述了一种用于检测eIF4F组装的实验方案，该方法可在活细胞中监测eIF4E与eIF4G相互作用的状态。基于细胞的eIF4E:4G蛋白质-蛋白质相互作用检测方法还可准确、可靠地评估药物诱导的eIF4F复合物完整性的变化。我们预期该方法可用于验证市售化合物的活性，或进一步筛选能够有效破坏eIF4F复合物形成的新型化合物或其他干预手段。

引言

基因表达的调控在细胞程序（如生长、增殖和分化）的正确执行中起着关键作用。这种调控机制可作用于基因转录水平，也可作用于mRNA翻译水平。在过去十年中，越来越多的证据表明，通过调控翻译起始过程（而非延伸和终止等后续步骤）能够精细调控特定蛋白质亚群的合成，这些蛋白质具有广泛的生物学功能。

参与生存、抗自噬和抗凋亡反应的mRNA翻译增加已在多种癌症中被证实，并且与翻译起始因子的异常激活或过表达存在因果关联1。

eIF4F复合物是翻译起始的关键调控因子。通过结合mRNA 5'端的帽结构，eIF4F促进mRNA与核糖体的初始招募，从而提高翻译效率较低的真核mRNA的翻译效率2。在多种携带RAS/MAPK或AKT/TOR信号通路异常激活的癌症模型中，均已报道eIF4F介导了与癌症相关mRNA的翻译，提示癌细胞通过上调eIF4F来增强自身的促肿瘤活性。因此，通过抑制eIF4F复合物的形成来阻断这一正反馈环路，是一种极具前景的治疗策略3,4。

eIF4F复合物由以下组分构成：(i) eIF4E，即eIF4F的帽结合亚基，可与mRNA 5'非翻译区（UTR）的帽结构结合；(ii) eIF4A，一种RNA解旋酶；以及(iii) eIF4G，一种支架蛋白，可同时与eIF4A和eIF4E相互作用，并最终招募40S核糖体亚基5。eIF4G与eIF4E的结合是功能性eIF4F复合物组装的限速步骤，该过程受到eIF4E结合蛋白（4EBP，包括1、2和3三个成员）的负向调控6。4EBP通过与eIF4G竞争结合eIF4E，其结合界面包含经典的和非经典的eIF4E结合序列7,8,9（位于人eIF4E的氨基酸604-646区域），从而减少参与翻译的活性eIF4E数量，并抑制eIF4F复合物的形成。这些蛋白质-蛋白质相互作用主要由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）介导的4EBP磷酸化进行调控。在促有丝分裂信号刺激下，mTOR直接磷酸化4E-BP蛋白家族成员，降低其与eIF4E的结合能力，从而促进eIF4E与eIF4G的相互作用，推动功能性eIF4F复合物的形成10。

尽管在开发靶向eIF4F复合物完整性的化合物方面已投入大量努力，但缺乏能够在活细胞内直接检测eIF4E与eIF4G相互作用中断的检测方法，这限制了对具有细胞活性的候选化合物的筛选。我们采用了一种基于腔肠素类似物（例如NanoLuc互补性检测）的荧光素酶检测方法，用于实时监测eIF4E-eIF4G相互作用状态，从而反映eIF4F复合物的完整性。该荧光素酶互补蛋白系统由一个18 kDa的蛋白片段（SubA）和一个11个氨基酸组成的肽片段（SubB）构成，经过优化以最大程度减少自聚集并提高稳定性11。 当这两个片段分别与人全长eIF4E蛋白以及人eIF4G1的eIF4E结合结构域（氨基酸604-646）融合表达时，eIF4E与eIF4G的相互作用将使SubA和SubB片段彼此靠近，从而诱导形成具有活性的荧光素酶；在加入可穿透细胞膜的底物后，最终产生强烈的发光信号（图1）。我们已在其他文献中报道了eIF4E:eIF4G604-646互补系统的构建与验证过程16。

本文介绍了eIF4E:eIF4G604-646互补系统（可应要求提供）如何用于在活细胞中精确测量4EBP1介导的eIF4E-eIF4G相互作用的破坏。此外，我们通过检测几种目前正处于临床试验阶段、作为潜在抗癌治疗药物的mTOR抑制剂的作用，展示了该系统的实用性12。由于脱靶 效应常常掩盖药物特异性活性，我们还阐述了如何将eIF4E:eIF4G604-646系统的测量方法与细胞活力的正交检测相结合，以综合考虑这些影响。

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方案

本实验采用 HEK293 细胞系，使用添加了 10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U/mL 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）进行培养。细胞在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中培养。

1. 通过eIF4E:eIF4G604-646互补实验对eIF4F复合物解聚进行定量评估

  1. 细胞培养及eIF4E:eIF4G604-646互补实验的瞬时转染
    1. 所有实验均使用新解冻且传代次数少于20次的细胞。第1天，使用标准细胞计数器确定细胞数量，并通过台盼蓝排斥法计数总活细胞数13。
    2. 在6孔板中每孔接种0.9–1.2 × 106个HEK 293细胞，加入2 mL标准生长培养基。
      注意：为获得上述细胞系的最佳转染效率，应确保接种后次日细胞融合度达到70–90%。
    3. 第2天早晨，使用基于脂质的转染试剂（见材料表），将SubA-eIF4E和eIF4G604-646-SubB质粒共转染至细胞中，具体步骤如下：
      1. 每个转染样本取9 µL脂质体溶液，加入不含酚红的低血清培养基125 µL（见材料表）中稀释，室温孵育5分钟。
      2. 制备DNA主混合液：每个转染管中，将每种质粒各3 µg溶于125 µL低血清培养基中。
      3. 向DNA主混合液管中加入12 µL增强剂试剂，充分混匀后立即按1:1比例加入已稀释的脂质体溶液管中，室温孵育15分钟。
      4. 将DNA-脂质复合物加入各孔，置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24小时。
    4. 第3天早晨，用1 mL PBS清洗每孔。
    5. 吸除PBS，每孔加入0.3 mL胰蛋白酶，37 °C孵育5分钟。
    6. 每孔加入2 mL含0% FCS且不含酚红的低血清培养基以中和胰蛋白酶，将转染后的细胞转移至15 mL离心管中。
      注意：酚红可能干扰荧光素酶活性，因此从本步骤起所有操作均需使用不含酚红的培养基。
    7. 290 x g离心5分钟，吸弃上清。用2 mL含0% FCS且不含酚红的低血清培养基重悬细胞，按步骤1.1所述方法进行计数。
    8. 将转染后的HEK 293细胞以每孔30,000个细胞的密度接种于96孔不透光培养板中，每孔体积为90 µL，培养基为含0% FCS且不含酚红的培养基。为在同一实验中对3种不同化合物各获得3个技术重复，接种时避开边缘孔，共接种60孔。
    9. 接种转染细胞后，立即向每孔加入10 µL 10% DMSO的化合物溶液（见步骤1.2）。
  2. 化合物配制
    1. 将目标化合物溶于100% DMSO（v/v）中，配制1 mM的母液。为满足每种化合物滴定实验设置3个重复的需求，取8 µL 1 mM母液使用。
      注意：所用1 mM母液体积略多于实际所需，以补偿可能存在的移液误差。
    2. 对母液进行2倍系列稀释：每个滴定梯度取4 µL 1 mM母液与4 µL 100% DMSO混合。
      注意：完整化合物滴定需在100% DMSO中进行9次连续稀释。若需同时测试多种化合物，可使用96孔板和多通道移液器以简化操作及后续稀释步骤。
    3. 在2倍系列稀释的每个梯度中加入36 µL HPLC级无菌水，配制成总体积为40 µL、含10% DMSO（v/v）的10倍工作液（例如，100 μM至0.39 μM的10% DMSO母液系列，加入细胞后将得到终浓度为10 μM至0.039 μM、含1% DMSO的溶液）。作为处理对照，还需用HPLC级无菌水配制仅含10% DMSO的对照母液。
    4. 向96孔不透光板中的细胞每孔加入10 µL 10倍工作液，使终浓度达到预期值，DMSO终浓度为1%（v/v），总体积为100 µL，于37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
  3. 荧光素酶互补与细胞活力检测
    1. 药物处理3小时后，立即开始配制荧光素酶底物试剂，按1体积底物与19体积稀释液的比例混合（参见试剂盒说明书）。
      注意：荧光素酶检测使用市售试剂盒进行（见材料表）。
    2. 使用多通道移液器立即向每孔加入25 µL底物试剂。
    3. 室温下将培养板置于轨道摇床上，350 rpm振荡50分钟。
    4. 使用酶标仪检测发光信号。设置反射模式为发光检测，发射滤光片为455 nm，检测高度设为6.5 mm，检测时间设为1秒。
    5. 为评估细胞活力，每孔加入33 µL细胞活力检测试剂，室温孵育15分钟后，再次使用酶标仪检测发光信号。
    6. 使用酶标仪检测发光信号，设置反射模式为发光检测，发射滤光片为600 nm，检测高度设为6.5 mm，检测时间设为1秒。
      注意：细胞活力通过检测细胞裂解后胞内ATP水平来评估，具体操作按试剂盒说明书进行。由于活力检测试剂使用具有不同发射波长的荧光素酶，因此可实现多重检测。
    7. 利用实验数据，通过将数据拟合至四参数拟合曲线方程来确定各化合物的IC50值：
      Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D
      在曲线拟合过程中需对数值D和A进行约束：
      D = eIF4E:4G互补实验中预期最小响应值或曲线Y轴上的最小渐近发光值。
      A = eIF4E:4G互补实验中预期最大响应值或曲线Y轴上的最大渐近发光值。
      注意：最小响应值来源于1% DMSO（v/v）对照处理组，最大响应值来源于高亲和力mTOR抑制剂在细胞活力不受影响时达到的最大响应平台期。

2. 将 eIF4E:eIF4G604-646 检测抑制作用与细胞内 eIF4F 复合物解聚相关联

  1. 为了确认检测所测得的信号对应于化合物对 eIF4E-eIF4G 相互作用的物理破坏，按照步骤 1.1 所述接种细胞。
  2. 次日，将培养基更换为 1 mL 不含酚红的低血清培养基，并加入待测化合物孵育 4 小时。确保在总体积 1 mL 中 DMSO 的终浓度为 1%（v/v）。
    注意：为便于与结果进行关联，建议使用在补充分析滴定曲线起始点、中点和终点处的化合物浓度。
  3. 裂解细胞并进行 m7GTP 下拉实验，以分离 eIF4F 复合物及 eIF4E:4EBP1 复合物。有关 m7GTP 下拉实验的详细操作步骤可参见其他文献14。
  4. 通过 Western 印迹分析检测 m7GTP 结合的 eIF4G、eIF4E 和 4EBP1 蛋白水平，然后将其与补充分析中信号抑制所反映的 eIF4F 复合物解离情况进行关联分析。

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结果

为了验证eIF4E:eIF4G604-646互补系统的敏感性，使用mTOR抑制剂评估了4EBP1介导的eIF4F复合物组装抑制作用。通过抑制mTORC1激酶依赖性的4EBP蛋白家族的磷酸化，mTOR抑制可增强4EBP1与eIF4E的结合，从而导致eIF4F复合物解离15。测试了两类作用机制不同的mTOR激酶抑制剂：雷帕霉素类似物（如Rapamycin），其为mTORC1的变构抑制剂，但不抑制mTORC2；以及ATP竞争性抑制剂（如PP242），其设计用于特异性抑制mTORC1和mTORC2的激酶催化活性。

HEK293细胞被转染了eIF4E:eIF4G604-646 补足系统，如步骤1所述。转染24小时后，将细胞重新接种，并用mTOR抑制剂PP242和雷帕霉素处理（如步骤1.2所述）。给药4小时后，按前述方法检测荧光素酶发光信号，随后检测细胞活力。如图所示

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讨论

本文所述方法利用基于荧光素酶的互补实验，通过在活细胞中直接测量eIF4G与eIF4E的相互作用，定量监测eIF4F复合物的组装过程。我们已提供了eIF4E-eIF4G互补系统的使用细节，并证明该系统在测量药物诱导的4EBP1介导的eIF4E-eIF4G相互作用解离方面具有极高的准确性16。为了提高该 实验的通量，本文所描述的实验设计适用于96孔微孔板格式。

为获得最佳结果，在进行检测时应考虑两个关键步骤。首先，不同实验之间的转染效率应保持相近。可通过使用低传代次数的细胞，并在接种当天严格计数细胞来确保这一点。在进行DNA转染前还应评估细胞汇合度，因为当细胞汇合度低于70-90%时，不建议使用基于脂质的转染试剂进行转染。其次，重要的是将互补检测与细胞活力检测进行多重检测。某些化合物可能主要通过有害效应减少活细胞数量，从而影响荧光素酶信号。因此，在完成eIF4E:eIF4G604-646互补检测后，立即测定细胞活力，以排除脱靶效应和非特异性效应的影响。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由p53实验室（BMSI，A*STAR）的核心预算和JCO VIP资助（A*STAR）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293FT 细胞Thermo Fisher ScientificR70007
细胞培养微孔板，96 孔，F 型底greiner bio-one655083
Cell titer Glo 2.0PROMEGAG9241
Envision 多功能酶标仪PerkinElmer不适用
Finnpipette F2 多通道移液器，12 通道，30–300 mlThermo Fisher Scientific4662070
Finnpipette F2 多通道移液器，12 通道，5–50 mlThermo Fisher Scientific4662050
FUGENE6PROMEGAE2692
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015
NanoBiT 蛋白相互作用启动系统PROMEGAN2014
OptiMem I 低血清培养基，无酚红Thermo Fisher Scientific11058021
轨道摇床Eppendorf不适用
γ-氨基苯基-m7GTP (C10-spacer)-琼脂糖Jena BioscienceAC-155S

参考文献

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