本文介绍了一种对小麦籽粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该方案包括乙腈代谢物提取法以及反相液相色谱-质谱分析法，并在正离子和负离子电喷雾电离模式下进行检测。
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本文内容
摘要
摘要
理解农业实践中基因、环境与管理措施之间的相互作用，有助于更准确地预测和管理农产品的产量与品质。代谢组学数据能够反映这些相互作用在特定时间点的状态，并提供有关生物体生化状态的信息。此外，单个代谢物或代谢物组合可作为精确的生物标志物，用于产量和品质的预测与管理。据预测，植物代谢组包含数千种具有不同理化性质的小分子，这为从生化角度深入理解生理特性及发现生物标志物提供了机会。为了充分利用这一资源，代谢组学研究的一个关键目标是在单次分析中尽可能全面地覆盖这些理化多样性。本文介绍了一种基于液相色谱-质谱联用技术的非靶向代谢组学方法，用于田间种植小麦籽粒的分析。该方法利用液相色谱仪的四元溶剂管理系统引入第三种流动相，并将传统的反相梯度与适用于脂质分析的梯度相结合。文中详细描述了籽粒前处理、代谢物提取、仪器分析及数据处理的工作流程。实验结果显示良好的质荷比准确性和信号重复性，每种电离模式下可检测到约500个具有生物学意义的特征信号。此外，不同小麦品种之间的代谢物和脂质特征信号存在显著差异。
引言
理解农业中基因、环境与管理措施之间的相互作用，有助于更准确地预测和管理产品的产量与品质。植物代谢物受到基因组、环境（气候、降雨等）因素的影响，在农业环境中还受到作物管理方式（如肥料、杀菌剂的施用等）的影响。与基因组不同，代谢组受所有这些因素的共同影响，因此代谢组学数据能够提供在特定时间点上这些相互作用的生物化学特征指纹。基于代谢组学的研究通常有两个目标：第一，更深入地理解生物体的生物化学过程，帮助阐明其在生理层面上对扰动（非生物或生物胁迫）响应的机制；第二，将生物标志物与所研究的扰动相关联。在这两种情况下，获得这些知识的最终结果是制定更精确的管理策略，以实现提高产量和品质的目标。
据预测，植物代谢组包含数千种具有不同理化性质的小分子1。目前，尚无任何代谢组学平台（主要是质谱和核磁共振波谱）能够在单次分析中全面捕获整个代谢组。因此，开发能够在单次分析中尽可能广泛覆盖代谢组的技术（包括样品制备、代谢物提取与分析）是代谢组学研究人员的重要目标。以往对小麦籽粒的非靶向代谢组学分析通常结合多种色谱分离方法、不同采集极性及/或不同仪器，以实现更广泛的代谢组覆盖。然而，这种方法通常需要针对每种分析模式分别制备和采集样品。例如，Beleggia 等人2在对非极性分析物进行 GC-MS 分析的同时，还额外制备了衍生化样品用于极性分析物的 GC-MS 分析。Das 等人
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方案
该方法适用于30个样品（每个样品约150粒种子）。本实验采用了10种不同田间种植小麦品种的三个生物学重复。
1. 谷物的制备
- 从 -80 °C 冷冻保存处取出样品（完整谷粒）。
注意：如果需要收集多个生长季的样品，建议在收获后尽快对种子进行冻干处理。这可以最大限度地减少因不同储存时间可能导致的代谢物浓度变化。操作时，将种子转移至 15 mL 塑料离心管中（约 300 粒种子可填满管子），并用铝箔覆盖。用针在铝箔上刺两到三个小孔，然后将完整谷粒过夜冻干（约 24 小时）。此时可将样品重新放回 -80 °C 超低温冰箱，或直接进行下一步操作。 - 使用实验室搅拌机以高速模式研磨种子，每次 20 秒，共运行两次。
注意：本实验方案所用的搅拌机需至少加入约 150 粒种子，才能使样品达到刀片高度，从而获得相对均一的研磨效果。 - 将搅拌机从底座上取下，轻敲搅拌机侧面，使研磨较粗的颗粒重新暴露于样品表面。较粗的材料可弃去或另行保存。
- 将搅拌机中呈粉末状的细磨材料转移至 2 mL 塑料微量离心管中。
注意：在处理不同样品之间，需用去离子水清洗搅拌机，并用液相色谱-质谱（LC-MS）级甲醇冲洗。确保搅拌机完全干燥后再进行下一个样品的处理。 - 将研磨好的细粉样品放回冷冻保存，或直接进入下一步（代谢物提取）。
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结果
植物代谢组受其基因组和环境的共同影响，此外在农业环境中还受到作物管理措施的影响。我们证明了小麦品种之间的遗传差异可以在代谢物水平上被观察到，仅在籽粒中就有超过500种测定化合物的浓度在不同品种间表现出显著差异。良好的质谱准确性（<10 ppm 误差）和信号重复性（<20% RSD）的内标物（图2在负离子和正离子化模式下均观察到（表3）。所述的样品制备及基于液相色谱-质谱联用的分析方法获得了 >负离子化模式下900个去卷积特征 >正离子化模式下1300个去卷积特征。制备空白样（图3）被纳入以确定样品制备和分析方法是否引入了人为特征，从而将所有非生物因素从数据矩阵中消除。结果发现，在负离子模式中有421个信号，在正离子模式中有835个信号，其信号强度等于或大于籽粒样品中平均信号强度的5%。这些特征被剔除后，经过进一步的数据过滤步骤（步骤7和 图1
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讨论
本文介绍了一种基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的非靶向代谢组学方法，用于小麦籽粒的分析。该方法通过在反相梯度中引入第三种流动相，将四种采集模式（正负离子化模式下的反相色谱及适用于脂类的反相色谱）整合为两种模式。该整合方法每种离子极性可获得约500个具有生物学意义的特征峰，其中约一半在不同小麦品种间的信号强度存在显著差异。不同小麦品种籽粒中代谢物浓度的显著变化表明其生物化学过程存在差异，这可能与抗病性、抗逆性以及其他影响籽粒品质和产量的重要表型特征相关。例如，代谢组学方法已被用于描述新的防御机制12，并提出代谢物在抗旱性中的作用13。本实验方案未来的应用有望进一步将特定品种的生物化学谱与特定环境和管理措施下所需的遗传性状关联起来，从而实现对特定基因型籽粒品质和产量的最优化生产。
在本实验方案中，内标物的加入至关重要，可用于判断信号变化、保留时间漂移以及质量准确性。信号的变化可能提示例如提取效率不理想、进样问题（包括流路系统堵塞）或检测器性能下降等情况。保留时间的偏移可能表明泵性能不.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢西澳大利亚州长农业与食品研究员计划（西澳大利亚州政府就业、旅游、科学与创新部）以及州长研究员西蒙·库克教授（科廷大学和默多克大学数字农业中心）。田间试验和谷物样品采集得到了西澳大利亚州政府“地区特许权使用费”计划的支持。我们感谢Grantley Stainer和Robert French对田间试验所做出的贡献。同时感谢由NCRIS资助的澳大利亚生物平台（Bioplatforms Australia）为设备提供的资金支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 13C6-山梨醇 | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-氨基蒽 | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| 乙腈 | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS 级 |
| 甲酸铵 | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | 版本 1.7 | |
| AnalyzerPro 软件 | SpectralWorks Ltd. | 用于步骤 7.2 的数据处理软件。版本 5.7 | |
| AnalyzerPro XD 软件 | SpectralWorks Ltd. | 用于步骤 7.5 的数据处理软件。版本 1.4 | |
| 天平 | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-反式肉桂酸 | Isotec | 513962-250 mg | |
| 甲酸 | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| 冷冻干燥机（Freezone 2.5 Plus） | Labconco | 7670031 | |
| 玻璃肖特瓶（100 mL、500 mL、1 L） | |||
| 玻璃小瓶（2 mL）及螺口盖（预切口） | Velocity Scientific Solutions | VSS-913（小瓶），VSS-SC91191（盖子） | |
| Sciex TripleToF 安装套件 | Sciex | p/n 4456736 | |
| 异丙醇 | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS 级 |
| 实验室搅拌器 | Waring commercial | 型号 HGBTWTS3 | |
| 亮氨酸脑啡肽 | Waters | p/n 700008842 | 调谐溶液 |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | 用于高通量代谢组学的基于网络的分析流程。免费的在线工具。版本 4.0。 | |
| 甲醇 | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS 级 |
| 咪康唑 | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| 微量离心机（Eppendorf 5415R） | Eppendorf（由中国台湾 Crown Scientific Pty. Ltd. 分销） | 5426 编号 0021716 | |
| 微量离心管（2 mL） | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View 软件 | Sciex | 版本 1.2（64 位） | |
| 移液器吸头（200 µL，100 µL） | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR（200 µL），MBP2179-05-HR（1000 µL） | |
| 移液器（200 µL，1000 µL） | ThermoFisher Scientific | ||
| 塑料离心管（15 mL） | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | 小分子发现分析软件。版本 2.3（64 位） | |
| Sciex 5600 三重飞行时间质谱仪 | Sciex | ||
| 带陶瓷珠的螺口裂解管（2 mL） | Bertin Technologies | ||
| 甲酸钠 | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| 组织研磨仪/匀浆器 | Bertin Technologies | 序列号 0001620 | |
| 容量瓶（10 mL、50 mL、100 mL、200 mL、1 L） | |||
| 涡旋混合器 | IKA Works Inc.（由中国台湾 Crown Scientific Pty. Ltd. 分销） | 001722 | |
| 水 | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS 级 |
| 配备四元泵的 Waters Acquity LC 系统 | Waters | ||
| Waters Aquity UPLC 100 mm HSST3 C18 色谱柱 | Waters | p/n 186005614 |
参考文献
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotyp....
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