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方法文章

通过可切换的原卟啉IX依赖性原位活性氧生成刺激小鼠皮肤干细胞微环境及组织再生

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DOI：

10.3791/60859

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2020年5月8日

 ,  ,  ,  , 
1Ramón y Cajal Institute for Health Research (IRYCIS), Ramón y Cajal University Hospital, 2Centro Integrativo de Biología y Química Aplicada (CIBQA), Universidad Bernardo O'Higgins, 3Department of Molecular Biology, Faculty of Sciences, Universidad Autónoma de Madrid (UAM), 4Instituto de Investigaciones Biosanitarias, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 5Department of Radiology, Rehabilitation & Physiotherapy, Faculty of Medicine, Complutense University

本文内容

摘要

本实验方案的目的是在小鼠皮肤中诱导产生非致死水平的活性氧（ROS），从而进一步促进组织中的生理反应。

摘要

本文介绍了一种在小鼠皮肤中诱导内源性活性氧（ROS）可逆性体内光生成的实验方案。该方法可在原位瞬时产生ROS，有效激活干细胞微环境中的细胞增殖，并显著促进组织再生，具体表现为加速烧伤愈合和毛囊生长过程。该方案基于一种可调控的光动力治疗策略，即先向组织施用内源性光敏剂原卟啉IX的前体物质，随后在严格控制的理化参数下以红光照射组织。总体而言，本方案为研究ROS生物学提供了一种有价值的实验工具。

引言

活性氧（ROS）是分子氧发生化学还原生成水过程中的产物，包括单线态氧、超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基1,2,3。由于活性氧具有极强的化学反应活性，其寿命非常短暂。在需氧生物中，活性氧主要作为线粒体内有氧呼吸（电子传递链）过程中产生的泄漏性副产物，在细胞内偶然生成。细胞内活性氧短暂地大量积累会导致氧化应激状态，可能引发蛋白质、脂质和糖类的不可逆失活，并在DNA分子中引入突变2,3,4,5。细胞、组织乃至整个生物体中氧化损伤的逐渐累积随时间持续增加，已被证实与细胞死亡程序的启动、多种病理状态以及衰老过程相关2,3,4,6。

好氧生物已逐步进化出高效的分子机制，以应对细胞和组织中活性氧（ROS）的过度积累。这些机制包括超氧化物歧化酶（SOD）蛋白家族的成员，它们可催化超氧化物自由基歧化为分子氧和过氧化氢；还包括多种过氧化氢酶和过氧化物酶，它们利用抗氧化剂库（谷胱甘肽、NADPH、过氧化还原蛋白、硫氧还蛋白7,8）催化过氧化氢进一步转化为水和分子氧。

然而，已有若干研究报告支持活性氧（ROS）作为调控细胞关键功能（包括增殖、分化和迁移）的分子回路中重要组分的作用2,3,4。这一概念进一步得到了在需氧生物中发现并表征出专门产生ROS的机制的支持，这些机制包括脂氧合酶、环氧化酶和NADPH氧化酶9,10。在此意义上，ROS在脊椎动物胚胎发育过程中表现出主动作用11,12,13，并且已有研究在不同的实验系统中报道了这些分子在调控特定体内生理功能中的关键作用，例如黑腹果蝇（Drosophila）造血祖细胞的分化程序14、斑马鱼的伤口愈合诱导，或非洲爪蟾（Xenopus）蝌蚪的尾部再生15。在哺乳动物中，ROS已被证实参与神经球模型中神经干细胞的自我更新/分化潜能16，以及结直肠癌起始过程中肠道干细胞功能的失调17。在皮肤中，ROS信号通路与表皮分化、皮肤干细胞微环境的调控以及毛囊生长周期的调节密切相关18,19。

从这一角度来看，确定活性氧（ROS）在生物系统中生理作用的主要实验局限性在于，缺乏适当的实验工具来在细胞和组织中诱导受控的ROS产生，从而精确模拟其作为第二信使的生理生成过程，无论是在正常还是病理条件下。目前，大多数实验方法依赖于外源性ROS的施加，主要是以过氧化氢的形式。我们近期建立了一种实验方法，可通过施用内源性光敏剂原卟啉IX（PpIX）的前体（例如5-氨基乙酰丙酸或其甲酯衍生物甲基氨基乙酰丙酸酯），再以红光照射样本，从而在小鼠皮肤中启动短暂且非致死性的内源性ROS体内生成，实现ROS从细胞内分子氧的原位生成（图1）。这种光动力学方法可有效用于刺激组织驻留的干细胞微环境，从而激活组织的再生程序19,20，为皮肤再生医学中的新治疗模式开辟了道路。本文中，我们详细描述了该实验方案，并展示了干细胞微环境被激活的代表性结果，表现为毛囊隆突区长期保留5-溴-2’-脱氧尿苷（BrdU）标记的细胞（LRCs）数量增加19,21，以及由C57Bl6小鼠品系皮肤中短暂且非致死性ROS产生所诱导的再生程序激活（毛发生长加速及烧伤愈合过程加快）。

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方案

所有小鼠饲养和实验操作必须符合有关动物实验的本地、国家和国际法律法规及指导原则。

1. 毛发生长诱导、烧伤诱导及尾部皮肤上皮全组织标本中长期BrdU标记滞留细胞的鉴定

注意：建议使用10日龄或7周龄的C57BL/6小鼠（最好为同窝仔鼠）进行下述实验设计。在所有实验操作中，动物将根据需要通过吸入3%异氟烷进行麻醉，或通过颈椎脱位法处死。

  1. 诱导小鼠背部皮肤在第二个休止期（约出生后第50天）的毛发生长
    1. 使用3%异氟烷吸入麻醉小鼠。通过脚掌反射（用力捏压脚趾）消失确认小鼠进入完全深度麻醉状态。每只小鼠分别使用电动剃毛器和脱毛膏，在背部皮肤上剃除两个独立且并列的区域材料表）。左侧用于对照，右侧用于处理。
      注意：剃毛后应检查下层背部皮肤是否呈粉红色，而非灰黑色，后者是该小鼠品系进入生长期（anagen 期）并发生黑色素生成的标志。
    2. 用 PBS 充分洗涤以去除所有残留的乳膏，然后按照第 2.1 节所述方法诱导产生非致死水平的瞬时原位 ROS。
    3. 通过每日采集每只动物对照组和处理组背部皮肤区域的高分辨率图像，记录毛囊生长情况（例如，使用与5−20倍双目镜头耦合的高清相机）。
  2. 2的诱导nd 小鼠第二次休止期（出生后约第50天）背部皮肤的二度烧伤病变
    1. 麻醉小鼠。使用电动剃毛器和脱毛膏剃除每只小鼠背部皮肤区域的全部毛发，并用PBS彻底清洗，以去除残留的脱毛膏。
      注意： 给予 原位 在烧灼术前，使用无菌生理盐水配制的0.5%利多卡因（2 mg/ml），皮下注射，浓度不超过7 mg/ml。
    2. 将横截面为1 cm的黄铜棒浸入沸水中，在95 °C下预热，然后将其置于每只小鼠背部中央皮肤区域，持续5 s。
    3. 烧伤造模后，立即将动物置于电热毯上，腹腔注射1 mL生理盐水（0.9% NaCl）以防止脱水。让动物恢复24小时，随后按照2.3节所述方法诱导产生非致死水平的活性氧（ROS）原位瞬时生成。
    4. 通过每日采集每只动物对照组和治疗组背部皮肤区域的高分辨率图像（例如，使用与5−20倍双目镜头耦合的高清相机），记录烧伤伤口的进展过程。
  3. 尾部皮肤上皮中长期BrdU标记滞留细胞的生成与鉴定
    1. 对10至14日龄的同窝幼鼠进行腹腔注射，每天一次，连续4天，每次注射50 mg/kg体重的BrdU（溶于PBS中，无需麻醉）。标记阶段结束后，让小鼠继续生长50至60天，然后再进行任何处理。
      注意： 每次注射均使用新针头。 
    2. 按照第2.3节所述步骤，在制备组织全装片前的不同时间点，对尾部皮肤进行瞬时原位非致死性ROS诱导。
    3. 通过颈椎脱位法处死小鼠，然后用手术剪剪下尾部，以制备尾部表皮全组织标本。
      1. 使用手术刀沿尾部纵向做一条直线切口，从脊柱处将整块皮肤完整剥离。将剥离的皮肤置于含有5 mM EDTA的PBS溶液中，于5 mL离心管内37 °C孵育4小时，随后用镊子小心分离出完整的表皮层与真皮层。
      2. 在室温下用4%多聚甲醛PBS溶液固定组织，至少72小时，随后使用适当的抗体进行BrdU检测。
      3. 使用荧光/共聚焦显微镜鉴定并定量各实验条件下（包括光照对照组以及在制备组织全装片前不同时间点进行的光动力处理组）的滞留细胞（LRCs），具体方法如前所述。19,20.
        注意：固定的表皮片可在含0.02%叠氮化钠的PBS中于4 °C保存长达三个月。固定的表皮片可用于后续标准组织学切片程序，进行目标蛋白的免疫定位。

2. 在小鼠皮肤中诱导产生非致死性活性氧（ROS）水平的瞬时升高

注意：为了在小鼠皮肤中诱导产生非致死水平的活性氧（ROS），将采用光动力治疗，使用内源性光敏剂原卟啉IX（PpIX）的前体物质甲基氨基乙酰丙酸酯（mALA）以及红光。

  1. 为启动背部皮肤毛发生长的短暂活性氧（ROS）产生，按照第1.1节所述准备实验动物。
    1. 涂抹约25 mg的mALA乳膏制剂材料表) 位于右侧区域，左侧作为内部对照，以避免个体间差异。在避光条件下孵育2.5小时，用PBS彻底洗去多余乳膏。为确认麻醉深度，需监测动物状态 每10分钟一次，直至完全恢复。
      注意：应通过蓝光（407 nm）激发下原位观察背部皮肤中PpIX的红色荧光来检测其生成情况。
    2. 麻醉动物。
    3. 使用适当的红光光源照射整个背部皮肤（材料表) 总剂量为 2.5−4 J/cm2将小鼠置于电热毯上直至完全恢复，然后按照步骤1.1.3所述进行操作。
      注意：应通过调节光源与组织之间的距离来调整辐照度，并使用功率能量计进行测量（材料表当观察到每只动物任一独立剃毛区域完全长出毛发时，即视为实验结束。整个实验过程仅包含一次光处理。
  2. 开启瞬时活性氧产生以促进2的愈合改善nd 二度烧伤创面，按第1.2节所述准备动物。
    1. 沿烧伤表面及周围约4 mm的邻近组织均匀涂抹约25 mg的mALA乳膏。避光孵育2.5小时，用PBS彻底冲洗去除多余乳膏。 为确认麻醉深度，需监测动物的反应 每10分钟一次，直至完全恢复。
    2. 麻醉动物。
    3. 使用适当的红光光源对整个背部皮肤进行照射，总剂量为2.5−4 J/cm²2将小鼠置于电热毯上直至完全恢复，然后按照步骤1.2.4所述进行操作。
      注意：当观察到动物烧伤完全愈合时，视为该动物的实验程序结束。整个实验过程仅包含一次光疗处理。
  3. 为启动尾部皮肤中短暂的活性氧（ROS）产生，按照第1.3节所述准备小鼠，将约25 mg的mALA以局部乳膏形式涂抹于背部组织区域的整个尾部皮肤，并按照第2.1节所述方法处理背部皮肤。在动物安乐死后及进一步制备尾部皮肤全层铺片前24 h、48 h或72 h进行光照处理及相应的光照对照。
    注意：在所有实验设计中，通过使用抗氧化剂活性氧清除剂来检测该过程对活性氧的依赖性（例如，在mALA处理开始前5天起，每天腹腔注射20 mg/mL、pH 7.2的PBS溶液配制的N-乙酰半胱氨酸，剂量为100 mg/kg体重；或者在mALA处理与红光照射之间的时间段内，将100 mg/mL抗坏血酸溶于50%乙醇中，局部涂抹于皮肤，间隔30分钟，共给药两次）。

3. 皮肤中活性氧的检测

  1. 使用羟乙啶对光动力治疗后尾部皮肤中的活性氧（ROS）进行离体评估
    注意：羟乙啶是一种非荧光分子，可特异性地与活性氧反应生成荧光染料2-羟乙啶（hET）。
    1. 将按1.3.3节所述获取的完整尾部皮肤在PBS溶液中含5 mM EDTA的条件下于37 °C孵育3小时（对照样本），或额外加入2 mM mALA（光动力治疗样本）。
    2. 在所有情况下，从二甲基亚砜（DMSO）中配制的25 mg/mL储备液中加入羟乙啶，使其终浓度为3.2 μM，并在室温下避光孵育1小时。
    3. 用指尖将尾部皮肤样本展平于玻璃表面，使用636 nm红光以10 J/cm2的辐照剂量进行照射。
    4. 立即按照1.3.3节所述方法分离表皮与真皮，并固定表皮片。
    5. 在荧光/共聚焦显微镜下使用绿色激发光检测hET的红色荧光发射，采集高质量图像并进行后续分析。
      注意：将未接受光动力治疗的组织样本进行hET染色作为阴性对照，以排除hET自氧化的影响。
  2. 在诱导毛发生长及烧伤愈合后，通过光动力治疗对背部皮肤中活性氧（ROS）的产生进行活体检测
    注意：本步骤使用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DHF-DA），该化合物具有细胞膜通透性且本身无荧光；在细胞内酯酶的作用下裂解后，可特异性地与活性氧反应生成荧光染料2′,7′-二氯荧光素（DCF）。
    1. 使用已按1.1节（诱导毛发生长）或1.2节（烧伤愈合）准备好的动物模型。在局部涂抹mALA乳膏前（见2.1和2.2节），在所有目标对照/处理皮肤区域表面涂抹100 μL浓度为1 mg/mL、溶于50%乙醇的DHF-DA溶液，待皮肤完全吸收后，继续进行mALA乳膏的局部应用。
    2. 将处理后的动物在避光条件下孵育4小时，用PBS彻底清洗皮肤表面的mALA乳膏，随后在皮肤上再次涂抹100 μL DHF-DA溶液。 为确认麻醉深度，需 每10分钟监测一次动物状态，直至其完全恢复。
    3. 将处理后的动物在避光条件下继续孵育50分钟，随后麻醉动物，并使用LED灯以636 nm红光对整个背部皮肤进行照射，辐照剂量范围为2.5至4 J/cm2。
    4. 照射后立即使用活体成像系统（材料表）评估皮肤中产生的ROS水平。设置滤光片为445−490 nm激发波长和515−575 nm发射波长，采集高质量图像并进行后续分析。
      注意：将未接受光动力治疗的组织样本进行DHF-DA染色作为阴性对照，以排除DHF-DA自氧化的影响。

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结果

在小鼠背部和尾部皮肤局部施用mALA前体后，该组织内会显著积累PpIX，尤其是在毛囊中表现明显，这可通过该化合物在蓝光（407 nm）激发下呈现的粉红色荧光观察到（图2A,C）。随后以2.5−4 J/cm2的光剂量用红光（636 nm）照射处理过的组织，可在组织中诱导活性氧（ROS）的瞬时生成，尤其集中在毛囊的隆突区域（图2B,D）。

在活体小鼠皮肤中启动非致死性活性氧（ROS）产生后，经光照处理两天，毛囊隆突区被归类为体干细胞的标记滞留细胞（LRCs）数量显著增加（图3，左图）。值得注意的是，LRCs数量的增加是暂时性的，在处理后6天恢复至正常水平（图3，右图）。由于该区域是小鼠皮肤中主要的干细胞微环境之一，该区域细胞增殖的短暂诱导主要反映了隆突微环境以及...

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讨论

本文介绍了一种可在小鼠皮肤体内瞬时激活内源性活性氧（ROS）产生的方法，并具有生理效应。该方法基于光动力学技术，可实现对内源性光敏剂原卟啉IX（PpIX）的可控且局部的刺激（图1B）。这一实验策略为在活体实验系统中研究ROS生物学提供了有力工具，相较于使用外源性ROS（通常为过氧化氢）的方法具有显著优势，能够实现在组织或样本中的可控且局部的ROS生成。

由于基于氨基乙酰丙酸的前体物质需过量给予以促进细胞内原卟啉IX（PpIX）的积累，因此该方法中的一个关键步骤是确定适当的光照剂量，以在组织中诱导产生活性氧（ROS）的瞬时水平，该水平应低于损伤阈值，但具有显著的刺激效应。目前尚无可用技术能够直接定量细胞和组织中产生的任何类型活性氧（ROS）的确切含量。在本方法中，仍无法建立特定光照剂量、所产生的活性氧（ROS）确切含量与特定生物学效应（例如细胞死亡或细胞增殖）之间的直接关联。因此，针对任何特定实验模型的光照剂量（能量密度）应由研究人员根据具体情况选择定性或半定性参数，通过实验经验确定。以小鼠皮肤为例，我们选择了一个易于测量的...

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披露

本研究中所述方法的所有商业应用均受由 EC、MIC 和 JE 共同发明并授权给 Derma Innovate SL 公司进行商业开发的 CSIC-UAM 专利（EP2932967A1）保护。JE 和 JJM 在 Derma Innovate SL 公司担任顾问职务。

致谢

本工作得到了西班牙经济与竞争力部（Ministerio de Economía y Competitividad）基金（项目号：RTC-2014-2626-1，授予 JE）和卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）基金（项目号：PI15/01458，授予 JE）的资助。EC 得到了马德里自治区与马德里自治大学（Comunidad de Madrid 和 UAM）授予的2017-T2/BMD-5766 研究人才引进基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯Sigma AldrichD6883-50MG
5'-溴-2'-脱氧尿苷Sigma AldrichB5002-500MG
抗溴脱氧尿苷-荧光素Roche11202693001
脱毛膏（例如，Veet）Veet
二氢乙啶Sigma Aldrich37291-25MG
活体成像系统，例如 IVIS Lumina 2Perkin Elmer
外用乳膏形式的甲基氨基乙酰丙酸（mALA），例如 METVIX 160 mg/g 乳膏Galderma
光能量计（例如，ThorLabs 型号 PM100D）ThorLabs
红光光源，例如 636 nm Aktilite LED 灯Photocure ASA

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