本实验方案的目的是在小鼠皮肤中诱导产生非致死水平的活性氧（ROS），从而进一步促进组织中的生理反应。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种在小鼠皮肤中诱导内源性活性氧（ROS）可逆性体内光生成的实验方案。该方法可在原位瞬时产生ROS，有效激活干细胞微环境中的细胞增殖，并显著促进组织再生，具体表现为加速烧伤愈合和毛囊生长过程。该方案基于一种可调控的光动力治疗策略，即先向组织施用内源性光敏剂原卟啉IX的前体物质，随后在严格控制的理化参数下以红光照射组织。总体而言，本方案为研究ROS生物学提供了一种有价值的实验工具。
引言
活性氧（ROS）是分子氧发生化学还原生成水过程中的产物，包括单线态氧、超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基1,2,3。由于活性氧具有极强的化学反应活性，其寿命非常短暂。在需氧生物中，活性氧主要作为线粒体内有氧呼吸（电子传递链）过程中产生的泄漏性副产物，在细胞内偶然生成。细胞内活性氧短暂地大量积累会导致氧化应激状态，可能引发蛋白质、脂质和糖类的不可逆失活，并在DNA分子中引入突变2,3,4,5。细胞、组织乃至整个生物体中氧化损伤的逐渐累积随时间持续增加，已被证实与细胞死亡程序的启动、多种病理状态以及衰老过程相关2,3,4,6。
好氧生物已逐步进化出高效的分子机制，以应对细胞和组织中活性氧（R....
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方案
所有小鼠饲养和实验操作必须符合有关动物实验的本地、国家和国际法律法规及指导原则。
1. 毛发生长诱导、烧伤诱导及尾部皮肤上皮全组织标本中长期BrdU标记滞留细胞的鉴定
注意：建议使用10日龄或7周龄的C57BL/6小鼠（最好为同窝仔鼠）进行下述实验设计。在所有实验操作中，动物将根据需要通过吸入3%异氟烷进行麻醉，或通过颈椎脱位法处死。
- 诱导小鼠背部皮肤在第二个休止期（约出生后第50天）的毛发生长
- 使用3%异氟烷吸入麻醉小鼠。通过脚掌反射（用力捏压脚趾）消失确认小鼠进入完全深度麻醉状态。每只小鼠分别使用电动剃毛器和脱毛膏，在背部皮肤上剃除两个独立且并列的区域材料表）。左侧用于对照，右侧用于处理。
注意：剃毛后应检查下层背部皮肤是否呈粉红色，而非灰黑色，后者是该小鼠品系进入生长期（anagen 期）并发生黑色素生成的标志。 - 用 PBS 充分洗涤以去除所有残留的乳膏，然后按照第 2.1 节所述方法诱导产生非致死水平的瞬时原位 ROS。
- 通过每日采集每只动物对照组和处理组背部皮肤区域的高分辨率图像，记录毛囊生长情况（例如，使用与5−20倍双目镜头耦合的高清相机）。
- 使用3%异氟烷吸入麻醉小鼠。通过脚掌反射（用力捏压脚趾）消失确认小鼠进入完全深度麻醉状态。每只小鼠分别使用电动剃毛器和脱毛膏，在背部皮肤上剃除两个独立且并列的区域材料表）。左侧用于对照，右侧用于处理。
- 2的诱导nd 小鼠第二次休止期（出生后约第50天）背部皮....
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结果
在小鼠背部和尾部皮肤局部施用mALA前体后，该组织内会显著积累PpIX，尤其是在毛囊中表现明显，这可通过该化合物在蓝光（407 nm）激发下呈现的粉红色荧光观察到（图2A,C）。随后以2.5−4 J/cm2的光剂量用红光（636 nm）照射处理过的组织，可在组织中诱导活性氧（ROS）的瞬时生成，尤其集中在毛囊的隆突区域（图2B,D）。
在活体小鼠皮肤中启动非致死性活性氧（ROS）产生后，经光照处理两天，毛囊隆突区被归类为体干细胞的标记滞留细胞（LRCs）数量显著增加（图3，左图）。值得注意的是，LRCs数量的增加是暂时性的，在处理后6天恢复至正常水平（图3，右图）。由于该区域是小鼠皮肤中主要的干细胞微环境之一，该区域细胞增殖的短暂诱导主要反映了隆突微环境以及.......
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讨论
本文介绍了一种可在小鼠皮肤体内瞬时激活内源性活性氧（ROS）产生的方法，并具有生理效应。该方法基于光动力学技术，可实现对内源性光敏剂原卟啉IX（PpIX）的可控且局部的刺激（图1B）。这一实验策略为在活体实验系统中研究ROS生物学提供了有力工具，相较于使用外源性ROS（通常为过氧化氢）的方法具有显著优势，能够实现在组织或样本中的可控且局部的ROS生成。
由于基于氨基乙酰丙酸的前体物质需过量给予以促进细胞内原卟啉IX（PpIX）的积累，因此该方法中的一个关键步骤是确定适当的光照剂量，以在组织中诱导产生活性氧（ROS）的瞬时水平，该水平应低于损伤阈值，但具有显著的刺激效应。目前尚无可用技术能够直接定量细胞和组织中产生的任何类型活性氧（ROS）的确切含量。在本方法中，仍无法建立特定光照剂量、所产生的活性氧（ROS）确切含量与特定生物学效应（例如细胞死亡或细胞增殖）之间的直接关联。因此，针对任何特定实验模型的光照剂量（能量密度）应由研究人员根据具体情况选择定性或半定性参数，通过实验经验确定。以小鼠皮肤为例，我们选择了一个易于测量的.......
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披露
本研究中所述方法的所有商业应用均受由 EC、MIC 和 JE 共同发明并授权给 Derma Innovate SL 公司进行商业开发的 CSIC-UAM 专利（EP2932967A1）保护。JE 和 JJM 在 Derma Innovate SL 公司担任顾问职务。
致谢
本工作得到了西班牙经济与竞争力部（Ministerio de Economía y Competitividad）基金（项目号：RTC-2014-2626-1，授予 JE）和卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）基金（项目号：PI15/01458，授予 JE）的资助。EC 得到了马德里自治区与马德里自治大学（Comunidad de Madrid 和 UAM）授予的2017-T2/BMD-5766 研究人才引进基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯 | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-溴-2'-脱氧尿苷 | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| 抗溴脱氧尿苷-荧光素 | Roche | 11202693001 | |
| 脱毛膏（例如，Veet） | Veet | ||
| 二氢乙啶 | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| 活体成像系统，例如 IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| 外用乳膏形式的甲基氨基乙酰丙酸（mALA），例如 METVIX 160 mg/g 乳膏 | Galderma | ||
| 光能量计（例如，ThorLabs 型号 PM100D） | ThorLabs | ||
| 红光光源，例如 636 nm Aktilite LED 灯 | Photocure ASA |
参考文献
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Th....
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重印与许可
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