利用光遗传学技术在小鼠腹侧被盖区进行两种不同的实时位置偏好实验范式

摘要

本文介绍了两种易于操作的逐步实验方案，用于在小鼠中利用光遗传学进行位置偏好范式的实验。通过这两种不同的实验设置，可以在同一装置内以高空间和时间选择性，简便且可靠地评估偏好和回避行为。

摘要

阐明神经元激活如何导致特定行为输出，是现代神经科学的基本问题。将啮齿类动物中的光遗传学技术与经过验证的行为学范式相结合，可以在高时空选择性的条件下实时测量特定神经元刺激所产生的行为后果，从而建立神经元激活与行为之间的因果关系。本文介绍了一种实时位置偏爱（RT-PP）范式的逐步操作方案，该范式是经典条件性位置偏爱（CPP）测试的一种改进版本。RT-PP实验在三室装置中进行，可用于判断对特定神经元群体的光遗传学刺激是否具有奖赏性或厌恶性。我们还描述了RT-PP方案的一种替代版本，即所谓的中性室偏爱（NCP）方案，可用于验证厌恶效应。这两种方法均基于行为药理学领域的经典方法学扩展，并结合了近年来光遗传学在神经科学研究中的最新应用。除了能够实时测量位置偏爱外，这些实验设置还可提供有关条件化行为的信息。我们提供了易于遵循的分步操作流程，并附上我们自身数据的示例，同时讨论了在实施此类实验时需要考虑的重要因素。

引言

近年来，光遗传学（一种利用光来控制神经元活动的现代神经科学研究工具）的应用极大地推动了人们对特定神经元群体如何影响行为的理解^1,2,3。光遗传学具有优异的空间和时间选择性，能够建立对特定细胞群的兴奋或抑制与行为输出之间的因果关系^2,3。在光遗传学中，空间选择性通常通过Cre-Lox系统实现，该系统中Cre重组酶的活性可导致位于Lox位点之间的任何DNA序列发生重组，即所谓的“floxed”等位基因（两侧由lox位点包围）⁴。在光遗传学中使用Cre-Lox系统的目标是，使编码光遗传学视蛋白的等位基因仅在特定的目标神经元中表达，而周围其他神经元则不表达。视蛋白是一类对光敏感的蛋白质，在特定波长的光照刺激下可介导离子流动，从而影响神经元的兴奋性，或通过调节下游效应通路来影响细胞功能。目前正不断开发新型的视蛋白变体，它们在功能（兴奋性、抑制性、调节性）、作用机制、激活光波长以及动力学特性等方面各不相同⁵，以满足不同实验需求。就神经元兴奋性而言，在脑内施加特定波长的光照时，使用去极化或超极化视蛋白将分别决定神经元的兴奋或抑制状态³。

选择性启动子活性可将Cre重组酶的表达定向至目标神经元。通过使用目标视蛋白的flox等位基因，Cre介导的重组可确保视蛋白仅在共表达Cre重组酶的神经元中选择性表达^3,6。这种利用双转基因策略实现空间特异性的方法在光遗传学中已被证明非常高效。因此，尽管用于激活视蛋白的光刺激通常通过植入脑内的光纤（连接至光源，如LED或激光器）广泛传递³，但只有同时表达Cre重组酶和flox视蛋白等位基因的神经元才会对这种刺激产生反应。在啮齿类动物中，Cre-Lox系统可通过多种方式实现：仅使用转基因方法（Cre重组酶和flox视蛋白构建体均编码于转基因动物中）、仅使用病毒注射（Cre重组酶和flox视蛋白的DNA构建体均通过病毒载体递送），或结合两种方法（例如，Cre重组酶由转基因动物编码，再向其注射携带flox视蛋白构建体的病毒）⁵。flox视蛋白的DNA构建体通常与报告基因进行同框克隆，以便在组织切片中可视化Cre介导的重组事件。尽管光遗传学也可在大鼠中实施，但本文所述方案均针对小鼠设计。为简便起见，将同时携带Cre重组酶和flox视蛋白的小鼠统称为 "光遗传学小鼠"。在下述方案中，光遗传学小鼠是通过混合转基因（Cre重组酶由两个不同启动子调控）与病毒方法（使用腺相关病毒AAV递送flox视蛋白DNA构建体——本例中为ChR2/H134R）相结合的方式构建的。获取并维持转基因小鼠品系是该方法学的重要组成部分。可根据具体研究目的自行培育Cre驱动小鼠和flox视蛋白转基因小鼠，或在有商业供应时直接购买；同样，多种携带编码Cre重组酶及flox视蛋白DNA序列的病毒产品也可购得。

光遗传学与行为学测试相结合已被证明是研究特定脑区或特定神经元群体在特定类型行为中作用的有力工具。在与奖赏相关的行为研究中，光遗传学不仅验证了行为药理学和实验心理学领域的先前发现，还实现了对特定神经元如何影响行为的更高时空精度的解析。在评估奖赏相关行为的方法中，一种已被多项研究采用的方法是经典条件性位置偏爱（Conditioned Place Preference, CPP）范式的改良版本。经典的CPP方法通过滥用药物诱导个体将药物效应与环境线索建立巴甫洛夫式关联的能力，来评估药物的奖赏或厌恶特性^7,8。按照巴甫洛夫理论，药物是一种非条件刺激，因为它本身即可引发趋近或回避行为，分别对应其奖赏性或厌恶性。将药物反复与各种中性刺激（即本身不引发任何反应的刺激）配对，可导致仅在呈现这些原本中性、但经配对后称为条件刺激的环境线索时，便引发趋近或回避行为⁹。CPP实验通常在一个包含两个大小相同但特征各异的隔室的装置中进行，每个隔室通过不同的地板质地、墙面图案和光照条件（即中性刺激）加以区分。两个隔室之间通过走廊或开口相连。在条件化阶段，实验对象（通常为小型啮齿类动物）被限制在其中一个主隔室时接受被动注射药物，而在另一隔室时则注射生理盐水。随后在一次无药物状态下，允许实验对象自由探索整个装置，以评估药物的奖赏效应。实验对象在先前与药物配对的隔室中停留的时间长短（即条件反应）被认为反映了药物奖赏效应与其给药环境线索之间所介导的巴甫洛夫学习机制（条件刺激）。若动物在药物配对隔室中停留时间更长，则表明药物诱导了条件性位置偏爱，意味着其对行为具有奖赏效应。相反，若药物被感知为厌恶性刺激，动物将回避药物配对隔室，而在生理盐水配对隔室中停留更长时间，表明出现了条件性位置厌恶（Conditioned Place Aversion, CPA）^8,9,10,11。

由于光遗传学可用于控制神经元活动 "实时"，采用一种与条件性位置偏爱（CPP）装置相似但有所区别的行为范式，可在直接神经元激活的情况下测量位置偏爱。因此，基于光遗传学的位置偏爱分析通常被称为实时位置偏爱（RT-PP）分析范式。在RT-PP范式中，通过Cre-Lox系统对特定神经元进行光遗传学刺激，取代了传统CPP实验中系统性给药的方式，从而检测光遗传学诱导的神经元激活是否被动物感知为奖赏性或厌恶性刺激。本文描述主要针对光遗传学小鼠，但采用类似方案也可对光遗传学大鼠进行测试。

与经典条件性位置偏爱（CPP）范式中一次仅对一个隔室进行条件化不同，在实时位置偏好（RT-PP）范式中，允许光遗传学小鼠在整个装置中自由活动，并在整个实验过程中持续记录其行为。当小鼠进入其中一个隔室时，会同时给予颅内光刺激。在合适的光刺激参数下，表达兴奋性视蛋白的神经元将被激活。如果小鼠将光刺激感知为具有奖赏性，则会倾向于停留在与光刺激配对的隔室中；反之，如果将光刺激感知为厌恶性刺激，则会离开该隔室以逃避刺激。此类分析可用于评估依赖性学习：动物通过进入特定隔室可自主触发光刺激，从而激活神经元，而通过离开该隔室则可终止刺激，这类似于操作性任务中的按压杠杆行为。此外，在后续无刺激阶段的实验中，通过测量小鼠在各个隔室中停留的时间，还可评估其关联学习机制。通过这种方式，研究者能够区分对目标神经元进行刺激时产生的即时奖赏效应与由此形成的关联记忆¹²。

在本研究中，我们描述了两种用于自由活动小鼠的光遗传学驱动位置偏好的逐步实验设置方案。第一种方案描述了在三室装置中进行的实时位置偏好（RT-PP）实验，其设计基于Root及其同事¹³以及其它作者^{12,14,15,16,17,18}近期提出的方法。该实验包括两个阶段，每个阶段包含多个每日实验环节（见图1A）。每个环节具有不同的目的，且将光刺激与特定腔室配对的参数也相应调整。第一个环节为"预测试"，用于评估受试动物对任一腔室的初始偏好。在连接光纤跳线的情况下，允许动物在无刺激条件下自由探索装置15分钟。若动物对任一腔室的初始偏好超过80%，则将其排除在分析之外，因为明显的初始侧向偏好可能干扰结果分析。在完成"预测试"后，进入"第一阶段"。该阶段的第一部分包括连续两天、每天30分钟的"实时位置偏好（RT-PP）"实验。在"第一阶段"期间，将光遗传学小鼠通过光纤跳线连接至激光光源，并放入实验装置中自由探索。当小鼠进入两个主腔室之一时，会接受颅内激光刺激。可通过预实验确定哪一个主腔室被设定为与激光配对，哪一个为非配对腔室。如果刺激表现出奖赏性，则在"预测试"中选择小鼠最不偏好的腔室与激光配对；若刺激具有厌恶效应，则与最偏好的腔室配对。因此，本方案采用的是“有偏设计”，即激光刺激并非随机分配至两个主腔室（无偏设计），而是根据小鼠的初始偏好进行选择，以避免初始偏好对结果的影响。进入另一个主腔室或连接两个主腔室的中性腔室时，不会触发颅内光刺激，因此这些区域不与光刺激配对。这些实验环节可用于实时评估对特定神经元群体进行刺激所产生的奖赏或厌恶效应。在"第一阶段"的最后一天，进行一次15分钟、无任何刺激的实验环节。该环节用于检测由刺激与所处环境之间的关联学习所引发的条件化反应（"CR"）。在"第一阶段"结束至少三天后，进行"反转阶段"，其结构与"第一阶段"相同，但原先未与光刺激配对的主腔室此时开始与光刺激配对。与"第一阶段"类似，两次刺激实验之后同样进行一次"CR"环节。"反转阶段"用于验证小鼠的行为变化确实依赖于光遗传学刺激，而非由随机因素引起。RT-PP实验的每一个环节都必须在追踪软件中单独编程。本方案以特定软件为例说明相关设置，但任何能够向光源发送晶体管-晶体管逻辑（TTL）调制信号的追踪软件均可使用。

第二个方案描述了一种称为中性区偏好（Neutral Compartment Preference, NCP）的新实验设置。该方案是对实时位置偏好（RT-PP）实验的改进，利用了连接走廊体积小且透明的特点——由于其狭窄且透明的结构，小鼠会自然回避该区域。通过将两个主实验区均与光刺激配对，而仅使连接走廊不施加光刺激，NCP 设置可用于检测光遗传学刺激是否会迫使小鼠在走廊中停留更长时间，以避免接受光刺激。通过比较小鼠在两个配对光刺激区域所花费的时间与在走廊中停留的时间，可验证光遗传学诱导的厌恶效应。NCP 实验包括连续两天的两个实验阶段，每天对光遗传学小鼠施加刺激（每次30分钟），以实时测量其偏好行为，以及一个无激光阶段（15分钟），用于评估条件化反应，其方式与RT-PP方案中的评估类似。

我们实验室最近在研究腹侧被盖区（VTA）中不同类型的神经元如何参与奖赏相关行为的各个方面的研究中，验证了以下提供的RT-PP和NCP方案¹²。在此，为了示范RT-PP和NCP方案的实施，我们对多巴胺转运体（DAT）-Cre¹⁹和囊泡型谷氨酸转运体2（VGLUT2）-Cre²⁰转基因小鼠进行了立体定位注射，将携带floxed通道视紫红质2（ChR2）DNA构建体的AAV注入VTA，并在VTA上方植入光纤。通过使用所提供的RT-PP和NCP方案分析这些小鼠所获得的行为反应，展示了激活VTA内的多巴胺能和谷氨酸能神经元会导致不同的行为反应（图1）。

本文提供了RT-PP和NCP范式的逐步操作流程，内容涵盖转基因小鼠的基因分型、立体定位病毒注射和光纤植入，到用于激光控制和行为评估的追踪软件编程。此外，还讨论了在刺激参数和可能影响科学结果的实验条件方面对实验方案进行修改的建议。尽管这些操作流程以腹侧被盖区（VTA）为背景进行描述，但只要具备相应的光遗传学工具（如相应的Cre驱动小鼠和floxed视蛋白），该方法可应用于任何脑区或神经元群体。

方案

本研究使用了两种性别的杂合型 DAT-Cre¹⁹ 和 VGLUT2-Cre²⁰ 小鼠，小鼠年龄>8 周，体重>20 g。所有实验均根据瑞典《动物福利法》（SFS 1998:56）和欧盟法规（ETS 123 公约及指令 2010/63/EU）在获得当地动物伦理委员会许可后进行。

1. 小鼠基因分型

1. 使用耳缘打孔器采取耳组织样本，用于转基因小鼠的基因型鉴定。
2. 制备耳组织样本，以使用特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）。
   注意：本实验方案中使用了针对 Cre 基因的引物。
   1. 在每个含有耳组织样本的 1.5 mL 离心管中加入 75 µL 裂解缓冲液（缓冲液 1：250 mM NaOH，2 mM EDTA）。
   2. 在 96 °C 的加热块中孵育 30 分钟。
   3. 让样本冷却 5 分钟，然后加入 75 µL 中和缓冲液（缓冲液 2：400 mM Tris-HCl，pH 8.0）。
3. 按照标准操作程序^12,21 使用相应的引物进行 PCR 扩增（本实验中使用引物：Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3'，Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3'）。
   警告：操作时需在冰上并在 PCR 生物安全柜内进行，注意避免试剂和样本受到污染。
   1. 配制 PCR 主混合液。根据待分析样本数量（包括适当的对照样本）计算所需体积。按以下顺序混合各试剂，配制单个终体积为 25 µL 的反应体系：去离子水（18.9 µL）、含 MgCl₂ 的 10x 缓冲液（2.5 µL）、10 mM dNTP 混合液（0.5 µL）、10 µM 正向引物（1 µL）、10 µM 反向引物（1 µL）、5 U/µL DNA 聚合酶（0.1 µL）以及模板 DNA（1 µL；将在下一步加入）。
      注意：每次实验均应设置阴性对照、阳性对照和空白对照（不加模板 DNA），以确保结果可靠。
   2. 向每根 PCR 管中加入 24 µL 主混合液。
   3. 向每根 PCR 管中加入 1 µL 模板 DNA（来自每只小鼠的耳组织样本）。
   4. 短暂离心 PCR 管，确保模板 DNA 完全进入主混合液中。
   5. 使用热循环仪，按照 表 1 中的循环程序进行 PCR 扩增。
4. 制备琼脂糖凝胶，用于电泳分析样本。
   注意：凝胶大小应根据待分析样本数量确定。
   1. 在玻璃瓶中加入 1% w/v 琼脂糖粉末和 1x Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液，微波加热至琼脂糖完全溶解，期间定期检查防止沸腾溢出。
      警告：注意防止烫伤。
   2. 待凝胶冷却至约 50 °C 时，加入核酸凝胶染料（每 50 mL 凝胶加入 0.5 µL）。
   3. 将凝胶倒入带有加样孔梳子的制胶槽中，室温静置至完全凝固，然后轻柔取出梳子。
   4. 用电泳槽装入 1x TAE 缓冲液，并将凝胶放入槽中。
   5. 向每个 DNA 样本中加入 2 µL 1x DNA 上样染料。
   6. 在凝胶的第一个加样孔中加入 4 µL DNA 分子量标记物，随后将各样本全部体积加入其余加样孔中。
   7. 将电泳仪电压设为 140 V，电泳 25−30 分钟。
   8. 将凝胶置于紫外光源下成像，记录实验结果。

2. 立体定位手术

1. 基因型鉴定后，筛选出携带Cre基因阳性的小鼠，并饲养至至少8周龄且体重>20 g后再进行手术。
   1. 对手术环境进行消毒，并对所有手术器械进行灭菌，以确保在无菌条件下进行手术操作。
   2. 术前30分钟，对小鼠皮下注射镇痛剂。
   3. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉（诱导麻醉浓度为2−3%的异氟烷混合正常空气，维持麻醉浓度为1.5−2.0%）。通过轻轻夹捏小鼠脚趾以检测疼痛反射是否消失，确认麻醉深度足够；根据需要调整异氟烷的输送浓度。
   4. 将小鼠固定于立体定位仪上，涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥损伤，剃除颅骨顶部的毛发，并使用加热垫维持小鼠体温稳定。
   5. 在颅骨皮肤下注射100 µL局部麻醉药，等待5分钟使其起效。
   6. 采用酒精或无菌生理盐水与碘伏交替进行三次环形擦拭，对切口部位进行消毒。使用无菌棉签，从切口线开始向外周方向擦拭。
   7. 用镊子轻轻提起皮肤，使用手术剪沿前后轴方向做约1.5 cm的切口，暴露颅骨表面。
   8. 使用棉签涂抹H₂O₂溶液以清除骨膜。
   9. 用无菌生理盐水冲洗颅骨，并使用无菌棉签吸干。
   10. 定位前囟（bregma）和后囟（lambda）。
   11. 将安装在立体定位架上的注射针尖置于前囟和后囟处，检查颅骨是否水平。分别测量两处的腹侧坐标并进行比较；当颅骨水平时，前囟与后囟的腹侧坐标值应相同。若不一致，则调整头部位置后重新测量。
   12. 根据Franklin和Paxinos²²图谱确定并标记注射Cre依赖性病毒及植入光纤的位置（前囟后-3.45 mm，内侧-0.2 mm），并使用微型钻头钻出小孔。
   13. 使用精密泵将400 nL病毒溶液装入安装于立体定位装置上的10 µL注射器中。
   14. 小心降低注射针头（34 G，斜面针头），在腹侧被盖区（VTA）（从前囟起：AP: -3.45 mm，ML: -0.2 mm，深度：颅骨表面下-4.4 mm，依据Franklin和Paxinos²²图谱）以100 nL/min的速率注射300 nL的Cre依赖性光遗传病毒（AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5.6 x 10¹² vg/mL]）。
   15. 注射完成后，将针头留置原位10分钟，以促进病毒扩散（图2A）。
   16. 缓慢将针头从注射部位撤出。
   17. 使用微型钻头钻出若干小孔，用于安装固定螺丝，以稳定光纤和牙科水泥复合结构。
   18. 再次确认前囟坐标，并将光纤（直径200 µm，数值孔径0.37）植入以下位置：从前囟起AP: -3.45 mm，ML: -0.2 mm，深度为颅骨表面下-4.0 mm（图2B），依据Franklin和Paxinos²²图谱。
   19. 使用牙科水泥将光纤固定于颅骨上。在光纤套管周围施加足够的水泥以确保牢固，但需注意保留套管顶端3−4 mm不被水泥覆盖，以便连接光纤跳线（图2C）。
       注意：注意避免将水泥填入颅骨孔洞内，以免造成脑组织损伤。可在孔洞内添加止血材料以防止此类情况发生。
   20. 使用组织胶或可吸收缝线闭合所有开放性伤口，术后至少恢复两周。手术后12−24小时追加一次镇痛剂。

3. 设置激光光源的控制

1. 使用单板微控制器控制激光源。利用适当的软件编写脚本，并通过合适的连接线缆将该脚本加载至微控制器板。
   注意：该脚本应包含通过TTL盒从追踪软件传入的外部调制（输入），以及用于控制刺激参数的激光输出。对于20 Hz频率、10 ms脉冲宽度的情况，使用以下脚本： 补充编码文件.
2. 将电路板连接至激光器和追踪硬件的TTL盒。
   1. 使用网线将TTL盒连接到电路板（对于提供的脚本，连接至5号引脚）图3A，C).
   2. 确保激光器设置为外部调制控制，并使用FC/PC电缆将激光器连接到电路板（对于给定脚本，连接至13号引脚）图3B，C).
   3. 将相应的引脚连接到电路板的接地部分。
3. 将激光源连接至光纤。
   1. 将激光源连接至旋转接头（图3D).
   2. 连接一根跳线（图3E) 连接到旋转接头。
   3. 将旋转接头固定在装置上方，但位于记录区域之外。确保光纤 patch cord 的长度合适，使小鼠在实验 arena 内活动时无碍图3F).

4. 在追踪软件中为RT-PP方法设置实验

1. 校准实验区域设置。使用直尺测量物理装置的特定部分，在软件的Draw Scale to Calibrate选项卡下的图像中绘制与所测部分对应的标线，并输入已知数值（图4中的步骤1）。
2. 设计实验区域。绘制用于记录小鼠运动的区域（图4中的步骤2）。
3. 创建区域。绘制将被指定为激光配对、激光非配对和"中性"的区域（图4中的步骤3）。
4. 验证设置，以确认不存在冲突参数，例如区域超出实验范围（图4中的步骤4）。
5. 在trial control settings选项卡下设置实验参数（图4中的步骤5）。
   1. 设置实验时长，如图5（步骤1）所示，用于一次30分钟的RT-PP实验。
   2. 确保已启用"hardware control"，指定一个区域为激光配对区域，当小鼠进入该区域时，追踪软件将通过TTL信号触发微控制器板。在图5（步骤2）中，激光配对区域为区域A。在反转阶段，交换区域设置，使区域B成为激光配对区域，区域A成为非配对区域。通过在软件中将A替换为B、B替换为A来实现。

5. 使用 NCP 方法修改装置以测试刺激的厌恶特性

1. 按照之前所述的步骤 4.1−4.4 进行操作。
2. 在 "Reference" 框设置中，通过 "Repeat till" 选项将实验时间设定为 30 分钟（见 图 6 中的步骤 1）。
3. 将 A 区和 B 区均设置为激光配对（见 图 6 中的步骤 2），方法是在 A 和 B 区室相关设置的条件框中添加 "when center-point is in any of Zone A and Zone B"。请注意，当动物位于中性区室时，激光将关闭。

6. 使用激光刺激进行实验

1. 设置检测参数。
   1. 使用一个模拟物来模拟小鼠，以确保检测参数设置恰当。
   2. 将模拟物放置在装置的一个腔室中，并使用带有动态减影功能的自动设置。
   3. 将模拟物移出并放置到对侧腔室。确保模拟物被完全检测到，若未完全检测到，则通过软件调整参数以实现正确检测。
      1. 在此步骤中同时检查刺激是否按预期工作。使用先前配置的试验控制参数开始数据采集，将模拟物放入与激光配对的腔室，观察刺激是否被正确触发；然后将模拟物放入未配对和/或中性腔室，观察刺激是否停止。
2. 使用带有传感器的功率计，通过激光器上的旋钮将激光功率调节至 10 mW（图 3B）。每次使用激光刺激时均需执行此步骤。
   警告：请佩戴护目装备，因为激光直射可能导致永久性眼部损伤。
3. 将小鼠放入装置中。
   1. 轻柔地将小鼠从笼中取出，并使用陶瓷套管将光纤植入物与光纤跳线连接。
   2. 将小鼠轻柔地放入三腔装置的中性腔室中。
   3. 等待软件检测到小鼠。
   4. 移除限制动物进入主腔室的垂直滑动门。
   5. 让动物自由探索，避免任何干扰。
      注意：当动物不接受刺激时，操作流程相同，但无需执行步骤 6.2，且激光在整个过程中保持关闭状态。

结果

三室装置（图3F）适用于研究药物的奖赏效应，并可实时评估使用光遗传学直接刺激神经元所产生的奖赏性或厌恶性效应。该装置包含两个主室（20 cm [宽] × 18 cm [长] × 25 cm [高]）和一个较小的连接室（20 cm [宽] × 7 cm [长] × 25 cm [高]）。主室具有不同的墙面和地面纹理及图案，以促进小鼠建立关联学习；而连接/中性室较窄且透明，因此小鼠自然倾向于在此区域停留较短时间。如上所述，追踪软件可用于记录小鼠的多种行为参数，包括运动情况及在各室停留的时间，并可控制激光刺激。整个实时位置偏好（RT-PP）实验共进行8个阶段（图1A），既可用于评估直接刺激的奖赏性或厌恶性效应（第3、4、6和7天），也可用于检测基于先前经验形成的正向或负向关联（第5和8天，“CR”）。

首先，我们测试了在腹侧被盖区（VTA）注射AAV-ChR2-eYFP病毒以靶向多巴胺能神经元的DAT-Cre小鼠。与已有文献一致，我们观察到小鼠更倾向于停留在与光刺激配对的腔室中（图1B，第1阶段，第3天和第4天，蓝色圆圈，双因素重复测量方差分析[RM ANOVA]，腔室效应 F_(2,18) = 141，p < 0.001；实验阶段×腔室交互效应 F_(12,108) = 42.1，p < 0.001；Tukey事后检验，配对腔室 vs 未配对腔室，p < 0.001）。在反转阶段，原本与光刺激配对的腔室被更换，该阶段结果进一步验证了上述观察结果（图1B，第6天和第7天，蓝色圆圈，Tukey事后检验，配对腔室 vs 未配对腔室，p < 0.001），从而排除了第1阶段结果可能由侧向偏好或随机因素导致的可能性。对实时定位偏好实验（RT-PP）四天内各腔室停留时间进行平均后发现，小鼠平均约70%的时间停留在曾与激光刺激配对的腔室，而停留在未配对腔室的时间约为20%，中性腔室约为10%（图1B柱状图，单因素重复测量ANOVA，刺激效应 F_(2,6) = 139，p < 0.001，Tukey事后检验，配对腔室 vs 未配对及中性腔室，p < 0.001）。此外，在无刺激条件下（第5天和第8天），小鼠在先前与激光刺激配对的腔室中停留的时间显著更长（Tukey事后检验，p < 0.001），表明先前的经验已足以诱导形成关联学习行为，表现为对刺激的“寻求”行为。这些结果与已有文献一致，表明本方法可可靠地用于研究光遗传学刺激VTA特定神经元群体所产生的奖赏效应。

随后，我们检测了注射了 VGLUT2-Cre 小鼠 AAV-ChR2-eYFP 在VTA中如上所述，靶向VTA的谷氨酸能神经元。在本实验中，我们观察到与DAT-Cre小鼠所表现出的行为表型相反的结果。因此，小鼠回避与刺激配对的区域，在所有实时位置偏好（RT-PP）实验日中，更多时间停留在未配对的区域。图1C 左侧，双因素重复测量方差分析，区室效应 F_(2,12) = 40.9, p < 0.001；session 与 compartment 交互效应 F_(12,72) = 16.1, p < 0.001；Tukey 事后检验，配对与非配对比较 p < 0.001; 图1C 右侧，刺激效应的单因素重复测量方差分析 F 值_(2,6) = 162, p < 0.001，Tukey 事后检验配对与非配对及中性区室比较 p < 0.001）。有趣的是，在“CR第5天和第8天，小鼠未表现出对先前配对隔室的明显回避行为（配对隔室与非配对隔室之间无差异）。条件化反应缺失可能是因为小鼠在激光配对隔室中停留时间不足，导致无法建立激光激活与特定环境之间的关联。为进一步探究该回避表型，我们采用了一种改良方案，命名为“中性隔室偏好”（neutral compartment preference，简称NCP）。在本实验中，两个主隔室均与刺激配对，而中性隔室则不给予任何刺激。图7A). 我们假设，如果刺激具有厌恶特性，则小鼠将被迫停留在较小的中性区域内以避免该刺激。事实上，在两次刺激日（Stim1 和 Stim2）中，小鼠在中性区域停留的时间均远多于配对区域（约80%）图7B，C；左侧：区室的双向重复测量方差分析效应 F_(2,8) = 70.9, p < 0.001；会话与区室交互效应 F_(4,16) = 6.9, p = 0.002，Tukey 事后检验，“刺激 1”中性区室与区室 1 和区室 2 比较 p < 0.01，“刺激2”中性区室与区室1和区室2的比较 p < 0.001；右侧：单因素重复测量方差分析，刺激效应 F_(2,2) = 54.2, p = 0.018，Tukey 事后检验，1 和 2 组与中性组配对比较 p < 0.05）。与“CR在RT-PP测试期间，小鼠似乎并未在各个隔间与刺激之间形成负面关联；也就是说，在无刺激条件下（CR），它们对所有隔间的探索程度相同（图7B，配对隔室与中性隔室之间停留时间无差异）。这些实验结果证实了在RT-PP设置期间观察到的行为表型，从而支持将RT-PP与NCP范式结合使用。

图1：在RT-PP范式中使用光遗传学进行行为测试。（A）实验时间线的示意图。（B,C）左上：表示注射了AAV-ChR2-eYFP的DAT-Cre（N = 10）和VGLUT2-Cre（N = 7）小鼠在整个RT-PP实验期间在各箱室中停留时间百分比的图表。蓝色圆圈：激光配对箱室；白色、黑色圆圈：主箱室；灰色圆圈：中性箱室。右上：在第3、4、6和7天（RT-PP）期间，各箱室中停留时间的平均百分比。下方：DAT-Cre和VGLUT2-Cre小鼠在各箱室中停留时间的代表性热图。所有数据均呈正态分布（Shapiro-Wilk检验）。结果以均值±标准误表示。***p < 0.001 配对箱室 vs 未配对箱室；#p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001 配对箱室 vs 中性箱室；§§p < 0.01，§§§p < 0.001 未配对箱室 vs 中性箱室。该图改编自Bimpisidis等人的研究¹²。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：光遗传学实验的手术流程。（A）在腹侧被盖区（VTA）注射Cre依赖性病毒载体。（B）在注射位点上方植入光纤。注意用于固定的锚定螺钉。（C）使用牙科水泥将光纤永久固定于颅骨上。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：光遗传学实验中使用的设备。（A）研究中使用的TTL信号盒。它接收来自追踪软件的输入，并向微控制器板发送TTL信号。（B）实验所用激光光源的前面（上）和后面（下）视图。（C）用于控制激光刺激的微控制器板。注意来自TTL信号盒和连接至激光光源的线路。（D）旋转接头。（E）实验中使用的光纤连接线。（F）用于RT-PP和NCP实验的三室装置。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：在追踪软件中设计实验区域及分区。 步骤1：设置校准。步骤2：绘制整个实验区域。步骤3：在实验区域内绘制各个分区。步骤4：设置验证。步骤5：试验控制设置选项卡，用于设定时间与刺激参数。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：在追踪软件中设置 RT-PP 实验的时间参数和刺激参数。 添加关于持续时间（步骤 1）和光刺激条件（步骤 2）的具体规则。这些条件可轻松修改，以满足反转阶段的实验需求。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：在追踪软件中设置NCP实验的时间与刺激参数。 刺激阶段的持续时间（步骤1）与RT-PP实验类似，但光刺激激活的条件（步骤2）有所不同。当动物进入任一主区室（此处命名为区A和区B）时，即触发光遗传学刺激，只有当小鼠进入中性区室时，刺激才会终止。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：在 NCP 范式中使用光遗传学进行行为测试。 （A）实验装置的示意图。（B）左图：VTA 内注射了 AAV-ChR2 的 VGLUT2-Cre 小鼠（N = 5）在两天刺激期（Stim1 和 Stim2）以及条件反应（CR）阶段中在各隔室所花费时间的百分比图。右图：NCP 刺激两天期间在各隔室所花费的平均时间百分比。（C）一只 VGLUT2-Cre 小鼠在某次刺激日中在各隔室停留时间的代表性热图。数据呈正态分布（Shapiro-Wilk 检验）。结果以均值 ± 标准误（SEM）表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，未配对隔室 vs 配对1和配对2隔室。该图已根据 Bimpisidis 等人¹² 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

步骤	温度	持续时间	循环次数
1. 初始变性	95 °C	4 min	1
2. 变性	95 °C	30 s	30
3. 退火	55 °C	30 s
4. 延伸	72 °C	40 s
5. 最终延伸	72 °C	6 min	1
6. 保存	4 °C	由实验人员手动终止	1

表1：PCR扩增程序。

补充编码文件。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

讨论

在本研究中，我们提供了两种利用光遗传学在小鼠中进行不同类型位置偏好分析的逐步实验方案。所描述的方案曾用于评估腹侧被盖区（VTA）神经元的奖赏性或厌恶性行为表型（图1 和 图6）¹²，但也可用于探究其他脑区神经元的行为学作用。

最近的几项研究已描述了在双室^23,24和三室装置^{13,14,15,16,17,18}中进行的RT-PP实验范式。本实验方案详细介绍了在三室装置中实施RT-PP和NCP实验的具体设置，该装置类似于传统条件性位置偏爱（CPP）实验中用于评估滥用药物行为效应的装置。虽然此处仅以小鼠在各室中停留时间的百分比来呈现结果，但追踪软件还可对多种其他行为参数进行分析，例如区域穿梭次数、运动速度、静止时间等。对不同参数的分析可能对数据的解释具有重要意义。

目前的RT-PP实验方案具有良好的灵活性，可进行修改以验证不同类型刺激模式是否具有奖赏效应。激光控制参数可通过微控制器板的脚本或跟踪软件轻松调整，体现了该系统的多功能性。我们建议采用20 Hz的刺激频率，该频率处于以往研究中使用相同视蛋白变体（ChR2/H134R）激活多巴胺能和谷氨酸能神经元及其末梢时所应用的频率范围之内，有时甚至更低^{13,14,16,17,18,23,24,25,26,27}。近期研究表明，较高频率的刺激可能产生与较低频率相反的行为效应，且这些效应由高频引起的去极化阻滞所介导²⁸。类似地，在刺激外侧视前区的谷氨酸能和GABA能神经元时也观察到了行为输出的差异¹⁵。这些研究考察的是不同于腹侧被盖区（VTA）的神经元区域，且在非谷氨酸能神经元的高频率刺激下观察到最显著的效应^15,28。我们选择20 Hz的依据来自先前对VTA谷氨酸能和多巴胺能神经元的研究，这些研究表明，改变刺激频率并不会显著影响与奖赏相关的行为输出^24,26。

另一个可调节且可能影响实验结果的参数是光源的功率。较高的激光功率会增大光刺激区域的范围，这在某些类型的实验中可能具有优势，但其缺点是会导致温度升高⁵。事实上，最近一项研究表明，激光引起的温度升高可改变脑生理状态并影响行为学测量结果²⁹。这些观察结果凸显了在实验设计中纳入视蛋白阴性对照的重要性。在本实验方案中，我们采用10 mW的激光功率，该功率与先前研究中用于有效刺激腹侧被盖区（VTA）多巴胺能和谷氨酸能神经元的功率相似且已被证实有效^16,24,26。在设置实验时，应注意目标细胞所在区域的大小以及光纤和补光导线的特性（数值孔径、纤芯直径）。这些参数在进行与激光功率相关的计算时必须予以充分考虑。具体细节可参考Karl Deisseroth实验室开发的计算器（http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php）。

在进行光遗传学实验时，对Cre-Lox重组的组织学验证是另一个关键环节。在开展大规模动物行为学实验之前，必须首先在预实验队列中验证重组效率。这不仅出于伦理考虑，也有助于优化实验结果。不同的病毒载体可能对特定类型的神经元或不同脑区具有差异性的靶向特异性⁵，这一参数可能以不可预测甚至误导性的方式影响实验结果。例如，我们此前已在DAT-Cre小鼠的腹侧被盖区（VTA）中验证了AAV5病毒的Cre-Lox重组模式，发现单侧注射已足以覆盖目标区域的大部分区域。然而，当我们研究VTA内具有空间局限性的神经元亚群（如表达NeuroD6的亚群）时，观察到双侧病毒注射能够更有效地靶向更多数量的神经元，从而在光遗传光刺激下产生更显著的行为学效应¹²。此外，从手术完成到开始行为学实验的时间间隔也需要谨慎确定。如本研究所示，两周时间足以使ChR2 DNA构建体在细胞体中表达；但如果研究者希望检测刺激投射区域的效果，则可能需要更长的等待时间（约8周）^13,14,15,17。

值得注意的是，注射病毒的体积（在本例中为 300 nL）在研究腹侧被盖区（VTA）神经元时可能是合适的，但注射体积和滴度需根据转导效率以及所研究结构的大小进行调整。此外，对于位于中线两侧且距离较远的双侧结构，可能需要进行双侧注射，并同时双侧植入光纤，以确保双侧半球内的激活或抑制。

最后，必须进行死后组织学分析，以验证和确认 Cre-Lox 重组的效率，并核实光导纤维是否准确植入预定位置。由于在目标区域边界之外可能存在表达 Cre 的神经元分布不明确，或因病毒血清型差异、病毒操作不当、病毒注射用注射器堵塞或其他与手术相关的问题，可能导致意外的、过度受限或过度的 Cre-Lox 重组。为了确保行为学评估统计结果的可靠性并得出安全的结论，必须验证 Cre-Lox 重组是否充分以及光导纤维植入位置是否正确。

就本文提供的数据示例而言，在RT-PP范式中，通过对DAT-Cre小鼠进行VTA内多巴胺能神经元的光遗传学刺激，观察到对光配对侧的显著偏好，这一结果与先前的研究发现一致^{23,24,25,26,27}；而VGLUT2-Cre小鼠表现出对同一侧的回避行为则出乎预期。已有研究表明，VTA中的VGLUT2神经元及其投射通路在奖赏和厌恶反应中均发挥作用^{16,17,24,30,31}，因此我们进一步实施了NCP分析，以更详细地评估当前RT-PP设置中所观察到的明显回避行为。通过将狭窄透明的通道作为唯一的非光配对区室，验证了VTA谷氨酸能神经元刺激的厌恶特性，结果明确显示，在这种特定的三区室设置中，光遗传学激活这些神经元会引发厌恶反应。这些实验旨在说明可能同时受益于RT-PP和NCP两种实验方案的研究情境，相关内容已包含于近期发表的一项研究中，完整的数据集以及对这些发现的深入讨论可参见该出版物¹²。

除了条件性位置厌恶（NCP）外，确认厌恶的其他方法还包括：在开放场区域内的某一区域施加强光照射，同时将场内其余区域与激光激活配对；或者执行主动回避任务，即小鼠必须完成特定的行为模式以终止激光刺激¹⁵。

综上所述，本文所述的实验方案提供了如何以最高效的方式成功开展RT-PP和NCP分析的关键信息，以揭示神经元激活在奖赏与厌恶中的作用。根据不同的科学假设，可利用这些方案分析一系列参数，且每种方案还可与其他已验证的行为学范式相结合，通过光遗传学手段靶向特定脑区和目标神经元，从而实现优化的行为学分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AAV-Cre 依赖型病毒	UNC Vector Core	-	多种多样的病毒，可满足各类研究项目的需求
琼脂糖	VWR Life Science	443666A
PCR 缓冲液	KAPA BIOSYSTEMS	KB1003	10x 浓缩液，使用时为 1x，含 1.5 mM MgCl₂
布比卡因（Marcain）	Aspen	N01BB01	局部麻醉剂，5 mg/ml 溶液，需凭处方购买
卡洛芬（Norocarp）	N-Vet	27636	抗炎药、镇痛药；50 mg/ml 溶液，需凭处方购买
dNTP 混合物	Thermo Fisher Scientific	R0181	100 mM，需稀释至 10 mM 后混合使用
DNA 分子量标准	Thermo Fisher Scientific	SM0243	100 bp，50 μg Gene Ruler
DNA 上样染料	Thermo Fisher Scientific	R0611	6x 浓缩液，使用前稀释至 1x
耳标打孔器	AgnThos	AT7000	用于采集组织样本进行 PCR 检测或标记动物
光纤连接线	Doric Lenses	MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
可植入式光纤	Doric Lenses	MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT	光纤的性能可能因实验条件不同而变化
用于病毒注射的输注泵	AgnThos	Legato 130	包含远程泵，可将注射器直接固定在立体定位仪框架上
异氟烷（Forane）	Baxter	N01AB06	挥发性麻醉剂，需凭处方购买
珠宝螺丝	AgnThos	MCS1x2
激光光源	Marwell Laser Systems	CNI MBL-III-473-100mW
微控制器板	Arduino	"Uno" board	可从多家公司订购
微型钻头	AgnThos	1474	可选择是否配备立体定位仪夹持装置进行订购
针头（34G）	World Precision Instruments	NF36BV
核酸凝胶染料 - GelRed	Biotium	41003-T
PCR 管	Axygen	PCR-0208-CP-C
光功率计	Thorlabs	PM100D
位置偏爱实验装置	Panlab	76-0278
旋转接头	Doric Lenses	FRJ_1x1_FC-FC
连接套管	Doric Lenses	SLEEVE_ZR_1-25	用于连接光纤连接线与植入式光纤
固定水泥	Ivoclar Vivadent	Tetric EvoFlow
注射器（10 µl）	World Precision Instruments	NanoFil
Taq 聚合酶	KAPA BIOSYSTEMS	KE1000	500 U
TAE 缓冲液	Omega BIO-TEK	SKU:AC10089	50x 浓缩液，使用前需稀释
PCR 仪	BIO-RAD S1000	1852148	用于进行 PCR 反应
组织粘合剂	AgnThos	Vetbond
动物行为追踪软件	Noldus	Ethovision XT
TTL 控制盒	Noldus	Noldus USB-IO box
紫外透射仪	Azure Biosystems	c200 型号