微波与荧光素-酪胺信号放大技术用于小鼠肾上腺多重免疫染色——使用同一宿主物种的非偶联一抗

摘要

已建立多种不同方法，用于在同一宿主物种来源的初级抗体基础上进行多重免疫染色。本文描述了在甲醛固定石蜡包埋的小鼠肾上腺切片上进行多重免疫染色时，采用微波介导的抗体剥离以及荧光素-酪胺来阻断抗体交叉反应性的方法。

摘要

免疫染色在生物医学研究中被广泛用于显示特定蛋白质的细胞表达模式。多重免疫染色技术允许多种一抗同时标记。为了最大限度减少抗体交叉反应，采用间接染色法进行多重免疫染色时，需要使用来自不同宿主物种的未标记一抗。然而，并非总能找到合适组合的不同物种来源抗体。本文介绍一种使用来自相同宿主物种（例如本实验中两种抗体均来自兔）的未标记一抗，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的小鼠肾上腺切片上进行多重免疫荧光染色的方法。该方法利用抗原修复步骤中相同的程序和试剂，去除先前染色的一抗复合物的活性。首先按照常规免疫染色流程，使用第一种一抗对切片进行孵育，随后与生物素化二抗结合。接着采用亲和素-生物素-过氧化物酶信号放大法，以荧光素-酪胺作为底物进行信号显色。通过将切片浸入微波加热的沸腾柠檬酸钠溶液中8分钟，去除第一种一抗复合物的免疫活性，而不可溶性的荧光素-酪胺沉积物仍保留在样本上，从而允许切片继续使用其他一抗进行染色。尽管该方法可消除大部分假阳性信号，但仍可能存在由抗体交叉反应引起的背景信号。如果样本中内源性生物素含量较高，可使用过氧化物酶偶联的二抗替代生物素化二抗，以避免内源性生物素恢复所导致的假阳性信号。

引言

在多重免疫染色中，使用偶联的一抗进行直接染色可获得具有信息性的结果。由于无需使用二抗，直接染色法因抗体交叉反应而产生假共定位信号的风险较低。然而，一抗上偶联的报告分子（荧光染料、酶）或生物素会限制其后续使用。相比之下，间接免疫染色通常通过使用未偶联的一抗与标记的二抗配合，可获得更强的信号。理想情况下，用于多重免疫染色的一抗应来源于不同宿主物种，以避免抗体交叉反应。然而，并非总能找到来源于不同宿主物种的合适一抗组合。

已有多种方法被建立，用于消除二抗与非目标一抗发生交叉反应的风险。一种常用方法是在使用第二种一抗染色前，利用F(ab)单体抗体阻断第一种一抗复合物上任何残留的结合表位¹。抗体剥离法类似于Western印迹膜上的剥离与重新孵育，可在不破坏可检测报告分子（如3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）²和荧光酪胺沉积物³）沉积的前提下，去除先前染色的抗体复合物。采用该方法，不同颜色的报告分子可在同一张切片上实现多重检测结果。多重染色也可通过完全去除先前沉积的抗体层，并对后续其他抗体获得的图像进行精确对齐来实现^4,5。这些方法均能提供可靠的结果，但每种方法均有其局限性，或需要复杂的操作步骤，或依赖特殊的成像系统。

本方案展示了使用常规缓冲液进行抗体剥离的方法。该方案可用于对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的小鼠肾上腺切片，利用来自同一宿主物种的两种未标记一抗，进行多重免疫荧光染色。

方案

1. 第一抗体染色

1. 使用二甲苯或等效试剂脱蜡，并依次进行以下步骤，每个步骤持续5分钟：二甲苯或等效试剂处理3次，100%乙醇2次，95%乙醇1次，70%乙醇1次，50%乙醇1次，蒸馏水2次。
   注意：从本脱蜡水化步骤开始，切片应始终保持湿润，直至最终封片步骤。
2. 如需进行抗原修复，将切片置于275 mL沸腾的柠檬酸钠溶液（10 mM，pH = 6.0）中，持续8分钟。为保持溶液沸腾，将切片平放于一个14 × 9.5 × 9 cm³（宽 × 长 × 高）带盖的移液枪头盒底部，在700 W微波炉中以70%功率微波加热8分钟。随后将移液枪头盒从微波炉中取出，打开盖子，让溶液在室温（RT）下冷却至少20分钟。
3. 将切片转移至盛有PBST（含0.1%吐温-20/80的磷酸盐缓冲液）的考普林瓶中，每次5分钟，洗涤3次。若不立即进行下一步操作，可将切片在考普林瓶中的PBST中于室温保存数小时，或于4 °C保存1-2天。
4. 配制封闭液时，使用与二抗来源物种相同的正常血清作为封闭试剂。也可使用其他市售封闭试剂。若使用本研究所采用的正常血清，则将100 µL正常驴血清加入4.9 mL PBST中。封闭液可在4 °C保存最多3天。
5. 进行封闭时，甩去切片上的PBST，迅速加入足量封闭液覆盖切片。将切片置于湿盒中，在室温下孵育30分钟。
6. 使用封闭液稀释一抗至所需浓度，配制一抗溶液（每两张切片使用500 µL）。溶液在使用前应置于冰上保存。
   1. 对于3βHSD，将2 µL 3βHSD抗体加入498 µL封闭液中。
   2. 对于TH，将0.5 µL TH抗体加入499 µL封闭液中。
   3. 对于β-catenin，将1 µL β-catenin抗体加入499 µL封闭液中。
   4. 对于20αHSD，将1 µL 20αHSD抗体加入499 µL封闭液中。
   5. 对于CYP2F2，将2 µL CYP2F2抗体加入498 µL封闭液中。
7. 孵育一抗时，甩去切片上的封闭液，迅速加入足量一抗溶液覆盖切片。将切片置于湿盒中，在4 °C下过夜孵育。孵育期间可用一小片石蜡膜覆盖切片以防止干燥。
8. 次日早晨，用PBST洗涤切片，每次5分钟，共3次。
9. 使用封闭液稀释生物素标记的二抗至所需浓度，配制二抗溶液（每两张切片使用500 µL）（例如，将1 µL驴抗小鼠抗体或驴抗兔抗体加入499 µL封闭液中）。溶液在使用前应置于冰上保存。
10. 孵育二抗时，甩去切片上的PBST，迅速加入足量二抗溶液覆盖切片。将切片置于湿盒中，在室温下孵育1小时。
    注意：若存在内源性生物素干扰问题，应使用辣根过氧化物酶标记的二抗替代生物素标记的二抗。若在步骤1.10中使用辣根过氧化物酶标记的二抗，则跳至步骤1.14。
11. 用PBST洗涤切片，每次5分钟，共3次。
12. 通过将0.5 µL SA-HRP（辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素）加入499 µL PBS中，配制SA-HRP溶液（每两张切片使用500 µL）。最终浓度为1 µg/mL。
13. 孵育SA-HRP溶液时，甩去切片上的PBST，迅速加入足量SA-HRP溶液覆盖切片。将切片置于湿盒中，在室温下孵育0.5小时。
14. 用PBST洗涤切片，每次5分钟，共3次。
15. 根据制造商说明书，用稀释缓冲液稀释荧光素-酪胺，配制荧光素-酪胺溶液（例如，将5 µL荧光素-酪胺加入496 µL稀释缓冲液中）。
16. 进行信号显色时，甩去切片上的PBST，迅速加入足量荧光素-酪胺溶液覆盖切片。在湿盒中于室温孵育1分钟。可根据需要调整孵育时间以获得理想的荧光强度。将切片转移至盛有PBST的考普林瓶中以终止反应。用PBST洗涤切片，每次3分钟，共2次。
17. 可在荧光显微镜下快速检查信号以确认结果。若未使用盖玻片，可在每个组织区域滴加一滴甘油:PBS（1:1）以保持样本湿润。用PBST洗涤切片，每次3分钟，共2次。切片可在PBST中于4 °C保存数天后再进行下一步操作。

2. 去除第一抗体

1. 将载玻片放入275 mL沸腾的柠檬酸钠溶液（10 mM，pH = 6.0）中，至少处理8分钟。将载玻片平放在一个14 × 9.5 × 9 cm³（宽 × 长 × 高）带盖的移液枪头盒底部，并在700 W微波炉中以70%功率微波加热8分钟，以维持溶液持续沸腾。若需延长脱蜡时间，可能需要补充预热的柠檬酸钠缓冲液，以确保载玻片始终浸没在缓冲液中。从微波炉中取出移液枪头盒，打开盖子，让溶液在室温下冷却至少20分钟。
2. 将载玻片转移至盛有PBST的考普林瓶中，用PBST洗涤5分钟，重复3次。若下一步操作不能立即进行，可将载玻片置于含PBST的考普林瓶中，在室温下保存数小时，或在4 °C下保存1–2天。

3. 使用第二抗体染色

1. 从封闭步骤开始，按照步骤1.5至步骤1.14的相同流程操作。在信号显色步骤（步骤1.15和步骤1.16）中，使用不同荧光光谱的荧光素-酪胺试剂。
   注意：可通过此方法多次剥离切片，以实现多重染色。最后一个抗体无需使用荧光素-酪胺作为报告分子，可使用荧光标记的二抗来显示最后一个一抗的信号。
2. 如需进行细胞核复染，将切片在室温下与2 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst溶液孵育1分钟，随后用PBST洗涤2次，每次3分钟。

4. 使用荧光显微镜成像以检测信号

1. 使用适合免疫荧光的封片剂，滴加一滴将盖玻片封固。
2. 成像时，使用荧光显微镜检测各荧光通道的信号。首先使用核染色（DAPI）通道和4倍物镜定位载玻片上的组织。
3. 切换至10倍物镜进行成像。调整曝光时间（300 ms）和光源强度（80%强度）。若信号过亮或过暗，可适当调整这些参数。在不移动载物台的情况下，依次采集各通道图像。每个通道可能需要重新对焦。使用显微镜配套软件或ImageJ（imagej.nih.gov/ij/）将各通道图像合并。

结果

结果来自经过包括抗原修复步骤1.2在内的所有步骤处理的样本。此处使用的所有二抗均为生物素标记的二抗。采用荧光素-酪胺进行信号放大，以检测第一和第二种一抗的结合信号。图像使用配备FITC滤光片（用于绿色荧光）、TxRED滤光片（用于Cy3）和DAPI滤光片（用于DAPI）的荧光显微镜采集。

微波介导的剥离可消除交叉反应性。
使用两种兔源一抗对小鼠福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾上腺切片进行染色。未进行剥离时（图1A-C），TH的二抗会识别3βHSD(+)位点，并在肾上腺皮质中产生红色信号（图1B）。由于未进行剥离，导致出现假性的共定位信号（黄色）（图1...

讨论

多重免疫染色可用于检测两种或多种抗原的细胞共定位。当一抗与不同的报告分子偶联时（直接染色），这种广泛应用的技术能够提供令人信服的共定位结果。然而，与使用偶联的二抗来检测一抗的间接染色相比，直接染色通常信号较弱。在间接染色中，高质量的多重免疫染色结果取决于二抗是否能够区分不同的一抗。由于可能存在抗体交叉反应性，使用来自不同宿主物种的一抗进行基于间接染色法的多重染色时，结果更为清晰。Carl 及其他研究者开发了一种利用过量未偶联的 IgG F(ab) 片段阻断抗体交叉反应性的方案¹。类似策略也应用于"鼠抗鼠"染色中，该方法使用单体 F(ab) 抗小鼠抗体，以防止抗小鼠二抗识别组织中的内源性小鼠免疫球蛋白。然而，这种阻断方法耗时较长，且可能无法完全阻断前一步骤中的抗体，特别是当待检测抗原丰度较高时²。

热介导剥离是防止多重免疫染色中抗体交叉反应的另一种方法。其原理类似于蛋白质印迹（Western blot）中的剥离与重新孵育抗体法。使用微波炉将载玻片在柠檬酸盐缓冲液中煮沸，对阻...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
生物素标记的驴抗小鼠IgG	JacksonImmuno	715-066-151	1:500 稀释
生物素标记的驴抗兔IgG	JacksonImmuno	711-066-152	1:500 稀释
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/mL 溶于蒸馏水中
荧光显微镜	ECHO	Revolve 4
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素	JacksonImmuno	016-030-084	1:1,000 稀释
微波炉，700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
小鼠抗CYP2F2抗体	Santa Cruz	SC-374540	1:250 稀释
小鼠抗TH抗体	Santa Cruz	SC-25269	1:1,000 稀释
正常驴血清	JacksonImmuno	017-000-121	PBST中含2%血清
兔抗20αHSD抗体	Kerafast	EB4002	1:500 稀释
兔抗3βHSD抗体	TransGenic	KO607	1:250 稀释
兔抗TH抗体	NOVUS	NB300-109	1:1,000 稀释
兔抗β-catenin抗体	Abcam	ab32572	1:500 稀释
链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）	JacksonImmuno	016-303-084	1:1,000 稀释
TSA Cy3 酪胺	PerkinElmer	SAT704B001EA	1:100 稀释
TSA 荧光素酪胺	PerkinElmer	SAT701001EA	1:100 稀释