联合灌注与刺激结合快速扫描循环伏安法（CIS-FSCV）评估腹侧被盖区受体对时相性多巴胺的调控

摘要

本实验方案的目的是直接操控腹侧被盖区受体，以研究其对次秒级多巴胺释放的贡献。

摘要

从中脑腹侧被盖区（VTA）到伏隔核的阶段性多巴胺（DA）释放，在奖赏信息处理和强化学习中起着关键作用。了解多种神经元输入如何调控VTA中的阶段性DA释放，有助于更全面地揭示控制奖赏处理和强化学习的神经环路机制。本文介绍了一种结合VTA内套管给予药理学激动剂和拮抗剂与刺激诱发的阶段性DA释放（即联合给药与刺激，CIS）的方法，并通过活体快速扫描循环伏安法（FSCV）进行检测。在麻醉大鼠中应用CIS-FSCV方法时，可通过在VTA植入带有套管的双极电极进行电刺激，同时在伏隔核核心区域记录，从而诱发阶段性DA反应。通过直接在刺激部位灌注药理学激动剂或拮抗剂，可研究VTA特定受体在驱动阶段性DA释放中的作用。CIS-FSCV的主要优势在于能够在活体条件下研究VTA受体功能，从而在体外研究的基础上进一步推进。

引言

从中脑腹侧被盖区（VTA）到伏隔核（NAc）的时相性多巴胺（DA）释放，在与奖赏相关的行为中起着至关重要的作用。VTA中的DA神经元会从紧张性放电（3–8 Hz）转变为簇状放电（>14 Hz）¹，从而在NAc中引发时相性DA释放。VTA表达多种胞体-树突受体，这些受体在调控从紧张性放电向簇状放电转换过程中具有关键作用^2,3,4,5。明确哪些受体及其相应的输入通路调控时相性DA释放，将有助于加深我们对奖赏相关神经环路组织方式的理解。本文所述方法——结合灌注与刺激的快速扫描循环伏安法（CIS-FSCV）——旨在快速且可靠地评估VTA受体在驱动时相性DA释放中的功能作用。

联合输注与刺激（CIS）是指通过药理学手段调控一组神经元（此处为腹侧被盖区，VTA）上的受体，同时刺激这些神经元，以研究受体功能。在麻醉大鼠中，我们通过电刺激VTA，在伏隔核（NAc）核心区诱发显著的时相性多巴胺（DA）信号（1–2 µM），并通过快速扫描循环伏安法（FSCV）进行检测。在刺激位点输注药理学药物（如受体激动剂或拮抗剂），可通过观察诱发的时相性DA释放变化来评估VTA受体的功能。FSCV是一....

方案

所有实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并经伊丽莎白敦学院和耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本方案专门针对使用CIS-FSCV技术的麻醉大鼠实验准备。

1. 术前准备

1. 电极溶液的制备
   1. 配制电极填充液：制备含有140 mM氯化钾的4 M醋酸钾溶液¹⁶。
2. 电极的制备
   1. 使用真空负压，将一根T-650型碳纤维（直径7 µm）插入硼硅酸盐玻璃毛细管中（长度 = 100 mm，外径 = 1.0 mm，内径 = 0.5 mm）。
   2. 将碳纤维置入玻璃毛细管后，将毛细管放入垂直电极拉制仪中，加热元件应大致位于毛细管中部。将加热器设定为55，磁体保持关闭状态。
   3. 拉制完成后，小心抬高上部毛细管夹持器，使电极尖端不再被加热元件包围。
   4. 使用锋利的剪刀剪断仍连接两段毛细管的碳纤维，从而得到两个独立的碳纤维微电极。
   5. 在光学显微镜下，用锋利的手术刀小心地切割暴露的碳纤维，使其伸出玻璃末端约75–100 µm。
   6. 在光学显微镜下检查电极，确保毛细管表面无裂纹；同时确认碳纤维从毛细管引出处的密封良好，无明显痕迹且无裂纹。
      注意：良好的密封有助于降低记录过程中的噪声。更详细的....

结果

采用CIS-FSCV技术研究腹侧被盖区（VTA）N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）、烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）和毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChRs）在驱动伏隔核（NAc）核心区相位性多巴胺（DA）释放中的功能。图2展示了阴性对照实验的代表性数据，即在输注0.9%生理盐水前（基线）和输注后9分钟（生理盐水）的结果。图2包含一个彩色图谱，其中纵轴表示电位，横轴表示时间，电流（以伪彩色表示）作为z轴，同时还包括电流-时间曲线（IvT）以及在诱发反应峰值处采集的循环伏安图，以证明所检测的分析物为多巴胺（DA）。与预期一致，生理盐水输注未改变刺激诱发的相位性多巴胺释放。

为了证明CIS-FSCV在使用激动剂和拮抗剂时可产生双向效应，我们比较了NMDAR激动剂NMDA（500 ng；图3

讨论

CIS-FSCV 为研究VTA受体机制在短暂性多巴胺（DA）释放中的作用提供了独特的机会。为确保获得有效的记录，有两个关键步骤。首先，必须获得稳定的基线记录，且诱发的DA信号漂移应尽可能小。提高建立稳定记录可能性的一个重要方法是确保电极在60 Hz和10 Hz下均有充分的循环时间（通常在60 Hz下循环15分钟，在10 Hz下循环10分钟）。在碳纤维电极循环过程中，碳纤维本身会发生氧化并被蚀刻，导致表面积减小，但同时产生新的表面以利于多巴胺吸附²³。这可能会提高对DA的检测灵敏度。因此，在实验过程中，观察到刺激诱发的多巴胺释放随时间略有增加，可能是由于蚀刻程度增加所致，而非任何药理学干预的结果。此外，在初次麻醉后的90至120分钟内开始记录，有助于在较长时间内获得更稳定的记录。值得注意的是，当大鼠接近麻醉致死状态时，诱发的DA释放通常会缓慢下降。

该操作的第二个关键步骤是确保输注套管被轻柔地插入双极刺激电极中。若在插入内套管时施加过大的压力，可能会导致立体定位仪的臂杆发生移动，从而引起多巴胺信号出现人为的升高或降低，因为刺激部位可能已.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电极填充液/耗材
微量移液器	World Precision Instruments	MF286-5 (28 gauge)
乙酸钾	Sigma	236497-100G
氯化钾	Sigma	P3911-25G
电极耗材
碳纤维	Thornel	T650
电极拉制仪	Narishige International	PE-22	注：也可使用水平拉制仪
玻璃毛细管	A-M systems	626000
电极用绝缘导线	Weico Wire and Cable Incorporated	UL 1423	长度：10 cm；直径：0.4 mm；需定制；绝缘材料应覆盖导线5 cm
显微镜（用于观察和切割电极）	Fischer Scientific	M3700
插针	Phoenix Enterprises	HWS1646	用于焊接到绝缘电极导线和参比电极上；连接至前置放大器
橡皮泥	Alcolin	23922-1003	用于在切割碳纤维时固定电极
手术刀片	World Precision Instruments	500239	用于将碳纤维切割至适当长度
银丝	Sigma	327026-4G
FSCV 硬件/软件
法拉第屏蔽笼	U-Line	H-3618 (36" x 24" x 42")
恒电位仪	北卡罗来纳大学电子设施
刺激电极	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	订购时，请要求底座下方切割22 mm
TarHeel HDCV 软件	北卡罗来纳大学教堂山分校	-	https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ 获取订购信息
UEI 接线盒	北卡罗来纳大学电子设施		https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ 获取订购信息
UEI 电源	北卡罗来纳大学电子设施		https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ 获取订购信息
刺激器硬件
Neurolog 刺激隔离器	Digitimer Ltd.	DS4	Neurolog 800A
输注/刺激耗材
输注泵	New Era 注射泵	NE-300
内插管	PlasticsOne	C315I/SPC INTERNAL 33GA
微升注射器	Hamilton	80308
导管	PlasticsOne	C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
手术耗材
插管固定器	Kopf 仪器公司	1776 P-1
棉签	Vitality Medical	806
电极固定器	Kopf 仪器公司	1770
加热垫	Kent Scientific	RT-0501
聚维酮碘	Vitality Medical	29906-004
螺钉	Stoelting	骨锚螺钉/每包100个	外径1.59 mm，长3.2 mm
镀氯化银的银丝参比电极	InVivo Metric	E255A
方纱布	Vitality Medical	441408
立体定位仪	Kopf 仪器公司	型号 902（双臂杆）
组织学耗材
福尔马林	Sigma	1004960700
电源	BK Precision	9110
蔗糖	Sigma	80497
钨微电极	MicroProbes	WE30030.5A3
输注用药
((2R)-氨基-5-磷酸戊酸	Sigma Aldrich	A5282
N-甲基-D-天冬氨酸	Sigma Aldrich	M3262
盐酸美加明（M9020-5mg）	Sigma Aldrich	M9020
氢溴酸东莨菪碱（S0929-1g）	Sigma Aldrich	S0929