动物气味信号的采样与分析

摘要

我们已开发出一种有效的采样与分析气味信号的方法，以探究这些信号在动物交流中的潜在作用。具体而言，我们采用顶空固相微萃取技术结合气相色谱-质谱联用法，对动物气味及嗅觉标记中的挥发性成分进行分析。

摘要

我们开发了一种有效的气味信号采样与分析方法，通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术，以探究其在动物通讯中的潜在作用。该技术可对气味分泌物中的挥发性成分进行半定量分析，通过分离样品中各组分并初步鉴定其化学结构，随后分析各峰面积比例，以发现可能参与信号传递的化合物变化趋势。本方法的主要优势包括：可分析多种类型的样品；无需复杂的样品前处理或萃取步骤；能够分离并分析混合物中的各个组分；可鉴定所检测到的组分；并能提供所检测组分的半定量甚至定量信息。该方法的主要局限性在于样品本身。由于目标组分具有挥发性，容易在采样后发生损失或浓度改变，因此样品采集后的储存与运输必须得当。这也意味着样品的保存和运输条件相对昂贵。该方法适用于多种样品类型（包括尿液、粪便、毛发以及气味腺体分泌物）。这些气味由复杂混合物组成，存在于多种基质中，因此必须采用适当技术来分离各组分，并提取具有生物学意义的化合物。

引言

关于动物嗅觉信号背后的化学变化，目前所知甚少¹，部分原因在于记录和量化气味挥发性化学谱时面临的方法学挑战²。在处理高度复杂的化学基质时存在多种潜在问题，包括在气味样品的采样和分析过程中可能出现的困难³。

在伍尔弗汉普顿大学罗莎琳德·富兰克林科学中心，我们正在对气味和嗅觉标记进行分析，以了解动物如何利用这些信号。我们将化感化学与行为生态学、内分泌学和细胞学相结合，以增进对嗅觉信号在动物交流中所起作用的理解。

我们已建立一种方法，并对多种物种的气味和标记物进行了分析，包括多种非人类灵长类动物（如冕狐猴、红领狐猴、日本猕猴、橄榄狒狒、黑猩猩）以及其他哺乳动物（如猫、牛）。我们收集并分析了多种样本，包括尿液、粪便、毛发以及气味腺分泌物。这些气味和气味标记由复杂的化合物混合物组成，因此用于分析的任何方法都必须包含某种分离技术。如图所示，这些物质还存在于多种基质中，因此有必要采用技术手段来提取目标成分。

Vaglio 等人⁴及其他作者⁵的先前研究采用动态顶空萃取（DHS）结合气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），而直接溶剂萃取⁶和复杂的溶剂萃取方法⁷也已被使用。特别是，动态顶空取样涉及用已知体积的惰性气体吹扫顶空，最终去除所有挥发性化合物，仅保留对样品基质具有强亲和力的化合物（例如，水相样品中的极性化合物）。

在本方法中，我们采用了顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱联用（GC-MS）的技术。特别是，我们在Vaglio等人先前于其GC-MS实验室所使用的方法基础上，进行了开发与优化^8,9,10。

无溶剂萃取技术在分析小分子、高挥发性化合物时非常有效（这些化合物 otherwise 容易从样品中损失），因为这些方法可将化合物固定在稳定的固相载体上。顶空固相微萃取（HS-SPME）采用涂有吸附性聚合物的纤维，用于捕获样品顶空中的挥发性化合物，或通过浸入水相生物流体中来萃取溶解的化合物¹¹。聚合物涂层对化合物的结合力较弱，因此通过在气相色谱（GC）进样口加热即可使其解吸。该方法比溶剂萃取技术更灵敏，也比动态顶空（DHS）更有效。

在当前的方法中，样品被置于玻璃小瓶内。将这些小瓶加热至40 °C，以模拟动物体温，促使气味标记物中的挥发性成分进入小瓶的顶空环境。将涂有65 µm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）吸附材料的固相微萃取（SPME）纤维暴露于顶空环境中，样品中的挥发性成分即被吸附到纤维上。当在气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）的进样口加热该纤维时，挥发性成分从纤维上解吸，随后由气相色谱进行分离。质谱仪（MS）则获取各组分的质谱裂解图谱。通过将这些质谱图与质谱数据库进行比对，可对气味标记物中的各组分进行初步鉴定。借助自动进样器，我们能够以一致的方式批量分析多个样品。

由于每种SPME纤维对极性化合物的亲和力不同，通常根据目标化合物的极性和/或分子量来选择纤维。此外，根据GC柱的类型和目标化合物的特性，气相色谱条件也会相应调整。

该技术通过实现样品中气味标记挥发性成分的分离和初步鉴定，并进一步分析峰面积比值以寻找可能参与信号传递的气味标记成分的变化趋势，从而对气味标记的挥发性成分进行半定量分析。

本方法的主要优势在于：

• 可分析的样品类型范围。
• 无需复杂的样品前处理或提取步骤。
• 能够分析挥发性组分。
• 能够分离混合物中的各组分。
• 能够鉴定所检测到的组分。
• 能够对所检测到的组分提供半定量甚至定量的信息。

方案

1. 样本采集

1. 采集以下其中一种类型的样本气味：
   1. 通过让已适应的研究对象（例如动物园灵长类动物）在无菌滤纸上进行气味标记（如气味腺分泌物），或直接排入小瓶（如尿液），收集其自然释放的气味。
   2. 在使用正向强化训练使研究对象配合后，用无菌棉签擦拭采集样本。
   3. 在对研究对象实施镇静后，用无菌棉签擦拭采集样本。
2. 将样本放入无菌的10 mL螺口透明玻璃小瓶中，并用带有PTFE/硅胶隔垫的螺口盖密封。立即在-20 °C条件下保存。
   注意：必须使用洁净的个人防护装备（如丁腈手套），并频繁更换；避免皮肤直接接触样本和小瓶。建议使用全新的小瓶；若使用过的小瓶，则必须预先彻底清洗，再采用相同的处理流程。
3. 每次采集气味标记时，均应同步采集环境空白样本。例如，在采样过程中将采样介质（如滤纸或棉签）以及顶空小瓶暴露于环境中，以作为空白对照。

2. 样品制备

1. 在野外准备样品时，使用刀片从带有气味标记的滤纸上切取约10 mm见方的样本，或取棉签头部，放入10 mL带螺口盖的顶空瓶中。
2. 每处理完一个样品后，应使用适当的抗菌湿巾和/或酒精清洁切割采样介质所用的刀片，并彻底擦干。
3. 将所有样品储存在-20 °C条件下。
   注意：建议在-20 °C保存，若条件受限，则应在野外尽可能低的温度下保存。

3. 分析前准备

1. 从冷冻箱中取出样品，于室温下自然解冻至少1小时。
2. 按以下条件设置气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析方法：
   1. 进行固相微萃取（SPME）分析时，首次使用前应按照制造商说明对SPME萃取头进行活化处理：萃取头预活化（260 °C，5分钟）、样品孵育（40 °C，2分钟）、萃取时间（15分钟）、解吸时间（2分钟）以及萃取头后活化（260 °C，20分钟）。
   2. 采用以下气相色谱（GC）条件：色谱柱（HP5-MS，30 m × 0.25 mm，0.25 µm）、进样口温度（270 °C）、载气流速（1 mL/min）、进样模式（不分流模式）、GC程序升温程序（45 °C保持2分钟；以4 °C/min升温至170 °C；再以20 °C/min升温至300 °C）、质谱检测器（MSD）传输线温度（280 °C）。
      注：为提高样品间保留时间的一致性，本分析方法采用保留时间锁定技术。
   3. 采用以下质谱检测器（MSD）条件：溶剂延迟时间（2.5分钟）、扫描范围（29至400 amu）。
      注：先前的实验方案中曾使用10至400 amu的扫描范围⁴。
3. 确保纤维活化单元的吹扫气体供应已开启。
   ​注：必须正确安装SPME组件至自动进样器中，并确保其与自动进样器样品盘、纤维活化单元及GC进样口对齐。对齐不当可能导致SPME萃取头损坏或断裂。

4. 分析

1. 将一个空的顶空瓶（作为系统空白）放入GC-MS自动进样器托盘的第一位置。将环境空白样品放入自动进样器托盘的第二位置。将待分析的样品依次放入自动进样器托盘的后续位置。
2. 创建分析序列以分析样品托盘中的每个样品。
   1. 在MassHunter主界面中，选择 Sequence | Load sequence。
   2. 通过输入相应信息，填写所有空白样品和待测样品的序列表格，并保存已完成的序列表格。
      注意：序列表格所需的具体信息取决于实验室对该表格的格式要求。通常至少应包括样品类型、样品名称、进样瓶位置与编号、分析方法以及数据文件的存储位置和名称（将数据文件名设置为与样品名称一致有助于后续的数据处理）。在分析过程中可随时向序列中添加额外样品。
3. 通过选择 Sequence | Run sequence 运行序列。
4. 分析完成后，应尽快将样品放回冷冻保存。
   ​注意：样品可能可进行重复分析，但需注意某些挥发性成分可能已在初次分析中被完全萃取，且部分化合物可能已在40 °C条件下发生热降解或细菌分解，因此再次获得的色谱图可能无法完全代表原始气味标记的组成。

5. 数据分析

注意：初步数据分析包括使用 ChemStation 软件和 NIST（美国国家标准与技术研究院）质谱数据库（版本 MSD F.01.01.2317）对色谱图进行积分，以获得保留时间和峰面积数据，并对峰进行初步鉴定。数据分析可手动进行，也可采用半自动化方法。若采用半自动化方法，有时需进行一定程度的手动数据分析，以验证初步鉴定结果。

1. 在左侧导航栏中点击相应的文件以打开数据文件。总离子色谱图（TIC）将显示在数据分析界面的上方窗口中。
2. 使用 RTE 积分器对 TIC 进行积分，请选择 色谱图 | 积分。
3. 调整积分参数，确保高于基线噪声 3 倍以上的峰被积分。选择 色谱图 | 质谱信号积分参数。在输出框中适当调整最小峰面积（在我们的示例中，设置为 1.0 可获得可接受的结果）。
4. 要识别峰并生成汇总报告，请选择 导出报告 | 将谱库检索结果报告导出为 XLS。
   注意：在进行谱库检索之前，必须预先在软件中设定要搜索的谱库以及要显示的谱库匹配数量。
5. 生成的电子表格报告包含每个峰的积分数据以及初步的谱库匹配结果以推测其身份。通常，谱库质量/匹配度应大于 >80 才可接受该初步鉴定结果。请保存该电子表格。
6. 直接从 TIC 中识别某个峰。
   1. 选择感兴趣的峰。
   2. 如果峰较小，可通过按住鼠标左键并在峰周围拖拽出一个方框来放大该区域，然后释放鼠标。
   3. 将光标线放置在峰的最高点（或紧随其后的位置）。
   4. 双击鼠标右键，该峰的质谱图将出现在数据分析界面的下方窗口中。
   5. 要搜索谱库，请将光标移至谱图窗口中的任意位置，然后双击鼠标右键。谱库检索结果将在新窗口中显示。
   6. 要从感兴趣谱图中去除背景噪声，首先在目标峰上双击鼠标右键。然后在目标峰前方无峰的区域双击鼠标右键。选择 色谱图 | 扣减谱图。扣减后的谱图将显示在数据分析界面的下方窗口中，并在窗口标题栏的 SCAN 数据旁显示“(-)”标记。

结果

根据本方案，我们初步鉴定出红领狐猴（Varecia variegata rubra）在滤纸上自然释放的14份肛周腺体气味标记中共含有32种挥发性化学化合物，并将这些气味图谱与信号发出者的特征进行了比较¹²。这些图谱中包含天然存在的挥发性化合物，如烃类、萜烯类、萜烯醇类和酮类，其中一些化合物此前已在其他动物物种中被发现具有性信息素功能或可作为健康状况的化学信号。初步鉴定出的化合物列于表1中。图1展示了两个代表性色谱图（1个来自对照样本，1个来自狐猴气味标记）。不同研究对象之间的样本在组分数量和相对丰度上存在差异。然而，有六种化合物（苯甲醛、2-乙基-1-己醇、对甲酚、顺式-对薄荷-2,8-二烯-1-醇、2-蒎烯-4-酮、十五烷）在所有样本中均被检测到。

本研究的结果表明，红领狐猴利用气味标记传递有关性别和雌性年龄的信息，其中肛-生殖区标记在社会性交流中发挥着作用。

采用本...

讨论

使用对照样品（包括采样时建立的环境对照和系统空白）对于解释气味标记样品至关重要。必须从气味标记样品中排除归因于采样环境或仪器系统的任何峰，以确保在分析中仅包含目标峰。这些对照还可用于评估和监测仪器的“运行状态”。

该方案包括在每次萃取前后对纤维进行活化的步骤。使用自动进样器可使这一过程更加简便，并确保样品之间不会发生交叉污染。

该方法的主要局限性与样本本身有关。采集后，必须对样本进行适当的保存和运输。其中特定关注的组分具有挥发性，容易丢失或浓度发生变化。目前，样本通常在-20°C条件下冷冻保存和运输。因此，样本的储存和运输成本较高。若将样本运送至实验室进行分析的过程出现延迟，将进一步增加成本，并可能影响从气味标记中获得的分析结果。仍需进一步研究以明确时间和储存条件对样本分析结果的影响。由于气味标记中特别重要的组分多为挥发性较强的物质，因此在样本采集后，这些组分的含量可能发生改变。此外，还需考虑某些类型样本中潜在的细菌作用。例如，在尿液样本的酒精检测中，尿液中存在的细菌可能产生酒精，从而导致检测到的酒精水平升高。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 自动进样瓶	Agilent	5188-5392	带18 mm 瓶盖的10 mL 螺口瓶
18 mm 瓶盖	Agilent	8010-0139	带PTFE/硅胶隔垫的磁性瓶盖
自动进样器	Agilent	GC120 PAL autosampler
毛细管色谱柱	Agilent	HP5-MS	30 m × 0.25 mm；0.25 µm
数据分析软件	Agilent	-	ChemStation
气相色谱仪	Agilent	7890B
进样口隔垫	Agilent	5182-3442	Merlin 微密封隔垫
质谱选择性检测器	Agilent	5977A
报告软件	Microsoft	-	Excel
质谱图库	NIST	-	NIST/EPA/NIH 质谱图库
质谱图库检索程序	NIST	-	MS Search v.2.2
不分流进样衬管	Agilent	5190-4048
SPME 萃取头	Agilent	SU57345U	65 µm PDMS/DVB 萃取头