动物气味信号的采样和分析

对于支撑动物嗅觉信号^的化学变化知之甚少，也因为记录和量化气味²挥发性化学特征的方法学挑战。在与高度复杂的化学矩阵合作时，存在几个潜在的陷阱:其中包括在采样和分析气味样本^时3。

在伍尔弗汉普顿大学的罗莎琳德富兰克林科学中心，我们正在对气味和气味标记进行分析，以了解它们如何被动物使用。我们把半化学与行为生态学、内分泌学和细胞学结合起来，以增进我们对嗅觉信号在动物传播中所起的作用的理解。

我们开发了一种方法，然后分析了来自各种物种的气味和标记，包括一些非人类灵长类动物（即加冕狐猴、红斑狐猴、日本猴、橄榄大猩猩、黑猩猩）和其他哺乳动物（即猫、牛）。我们收集并分析了各种样本，包括尿液、粪便、头发和香气味分泌物。这些气味和气味标记由化合物的复杂混合物组成，因此用于分析的任何方法都需要包括某种形式的分离技术。如前所述，它们也发生在一系列矩阵中，需要使用技术来提取感兴趣的组件。

Vaglio等人^的 先前研究^{和其他作者5} 使用气相色谱-质谱仪（GC-MS）的动态头部空间提取（DHS），同时直接溶剂提取⁶ 和复杂溶剂提取⁷ 也被使用。特别是，动态头部空间采样涉及用已知的惰性气体清除头部空间，最终去除所有挥发性化合物，但那些对样品基质有强烈亲和力的化合物（例如，水样中的极性化合物）除外。

在目前的方法中，我们采用了头空间固体相微缩（HS-SPME）与GC-MS相结合的技术。特别是，我们已经开发和改进了Vaglio等人在以前的GC-MS实验室^8、9、10中已经使用的方法。

无溶剂萃取技术非常有效，用于分析小的、高挥发性的化合物（否则很容易从样品中丢失），因为这些方法使化合物在稳定、坚实的相位支撑下无法移动。HS-SPME 使用涂有溶剂聚合物的纤维捕获样品头部空间中的挥发性化合物，或通过浸入水性生物液¹¹提取溶解化合物。聚合物涂层不会对化合物有很强的结合，因此，通过在GC的注入端口加热，可以去除这些化合物。这种方法比溶剂提取技术更强大，也比DHS更有效。

在当前方法中，样品包含在玻璃瓶中。这些小瓶加热到40°C的温度，以模拟动物体温，以促进气味标记的挥发性成分占据小瓶的头部空间。一种SPME纤维，涂有65微米的多晶硅氧烷/二苯二苯（PDMS/DVB）吸收材料，暴露在头部空间环境中，样品中的挥发性成分被吸收到纤维上。在 GC-MS 的入口端口加热纤维时，挥发性部件从纤维中去除，然后由 GC 分离。使用 MS 获取每个组件的质量光谱碎片模式。通过将这些质谱与质量光谱数据库进行比较，可以初步确定气味标记的成分。通过使用自动取样器，我们能够以一致的方式分批分析多个样本。

鉴于每种SPME纤维与极地化学物质具有不同的亲和力，通常根据目标化合物的极性和/或分子量选择纤维。此外，GC 条件会根据 GC 列的类型和目标化合物的特性而改变。

该技术允许对气味标记的挥发性成分进行半定量分析，从而能够分离和初步识别样品中的成分，然后分析峰值区域比率，以寻找可能表示可能涉及信号的气味标记组件的趋势。

目前这种方法的主要优点是:

• 可分析的样本类型范围。
• 无需复杂的样品制备或提取。
• 分析挥发性组件的能力。
• 分离混合物成分的能力。
• 能够识别检测到的组件。
• 能够提供半定量和潜在定量的检测组件信息。

1. 样本收集

1. 样本气味如下:
   1. 通过无菌滤纸上的气味标记（如香味腺气味分泌物）或直接进入小瓶（如尿液），由习惯性研究对象（如动物园灵长类动物）自发释放。
   2. 通过使用积极的强化训练，在训练学习科目后通过摩擦无菌棉签收集。
   3. 研究对象的沉着后，通过摩擦无菌棉签收集。
2. 将样品放入无菌的 10 mL 螺丝盖透明玻璃瓶中，并密封带有 FTFE/硅胶隔膜的螺丝顶盖。立即将其存储在-20°C。
   注意:使用干净的个人防护设备，如氮化物手套，至关重要:经常更改它们;避免与样品和小瓶直接接触皮肤。它更倾向于使用全新的小瓶:但是，在使用小瓶的情况下，必须预先清洁小瓶，然后使用相同的协议。
3. 每次收集气味标记时，都要取环境空白。例如，收集采样介质（例如滤纸或拭子）和在采样时暴露在环境中的头部空间小瓶。

2. 样品准备

1. 用刀片从气味标记的滤纸或拭子头切开大约 10 mm 正方形的刀片，将其放入 10 mL 螺丝顶头空间小瓶中，在田间准备样品。
2. 在准备完每个样品后，处理或清洁用于使用适当的抗菌擦拭和/或酒精切割取样介质的刀片，彻底干燥。
3. 将所有样品存储在-20°C。
   注意:在-20°C或其他尽可能低的字段中首选。

3. 准备分析

1. 从冰柜中取出样品，让温度自然加热至室温至少1小时。
2. 在 GC-MS 上设置分析方法如下:
   1. 对于 SPME 分析条件，请按照制造商的指示对 SPME 纤维进行首次使用前的状况:纤维预制（260 °C 代表 5 分钟）、样品孵化（40 °C 代表 2 分钟）、提取时间（15 分钟）、脱硫时间（2 分钟）和纤维后状况（260 °C 代表 20 分钟）。
   2. 使用以下 GC 条件:列（HP5-MS 30 米 x 0.25 毫米; 0.25 μm），喷油器温度（270°C），流速（1 mL/min），注射模式（无分裂），GC烤箱轮廓（45°C 2分钟;4°C/分钟至170°C;20°C/分钟至300°C），MSD传输线（280°C）。
      注意:为了改善样品保留时间一致性，分析方法是锁定保留时间）。
   3. 使用以下 MSD 条件:溶剂延迟（2.5 分钟）和扫描范围（29 至 400 amu）。
      注:在以前的协议⁴中使用了10到400的范围。
3. 确保打开对纤维调节装置的净化气体供应。
   注:SPME 组件正确安装在自动取样器中，并且与自动取样器托盘、光纤调节装置和 GC 入口端口对齐至关重要。不正确的对齐可能导致 SPME 纤维的损坏或破坏。

4. 分析

1. 将空头空间小瓶（作为系统空白）放在 GC-MS 自动取样盘的第一位置。将环境空白放在自动取样盘的第二个位置。将样品放在自动样品托盘的后续位置进行分析。
2. 创建分析序列以分析样品托盘内的每个样本。
   1. 在"大规模猎人"主屏幕中，选择 序列|加载序列。
   2. 通过插入适当的信息，完成所有空白和样品的序列表。保存已完成的序列表。
      注:序列表的确切信息将取决于表的实验室格式。最小信息通常包括样本类型、样本名称、小瓶位置和编号、分析方法以及数据文件位置和名称（分配与样本名称相匹配的数据文件名称有助于未来数据处理）。分析过程中，可以向序列添加其他示例。
3. 通过选择 序列|运行序列运行序列。
4. 分析后尽快将样品放回冰柜。
   注意:可以重新分析样品，但应当指出，在初步分析过程中，可能完全提取了一些挥发性成分，有些化合物可能在 40 °C 时经历了热和细菌分解，因此由此产生的色谱可能无法完全代表原始气味标记。

5. 数据分析

注:初步数据分析包括色谱图的集成，以获得保留时间和峰值区域数据，以及使用ChemStation软件和NIST（国家标准与技术研究所）质量光谱数据库（MSD F.01.01.2317版本）对峰值进行初步识别。数据分析可以手动进行，也可以通过半自动化方法进行。如果使用半自动化方法，则有时进行一定程度的手动数据分析以验证暂定身份验证是有益的。

1. 单击左侧导航栏中的相应文件，打开数据文件。总离子色谱 （TIC） 将显示在数据分析屏幕的顶部窗口中。
2. 要使用 RTE 集成器集成 TIC，请选择 色谱图|集成。
3. 调整集成参数，以便集成大于 3 x 基线噪声的峰值。选择 色谱图|MS 信号集成参数。在输出框中，根据情况调整最小峰值区域（1.0 在我们的示例中产生可接受的结果）。
4. 要识别峰值并生成汇总报告，请选择 出口报告|库搜索结果报告给 XLS。
   注:要搜索的光谱库以及要显示的库匹配数，需要在软件中预设，然后才能进行库搜索。
5. 由此产生的电子表格报告包含每个峰值的集成数据，以及分配身份的暂定光谱库匹配。通常，图书馆质量/库匹配应>80接受暂定标识。保存电子表格。
6. 直接从 TIC 识别峰值。
   1. 选择兴趣的顶峰。
   2. 如果峰值较小，请通过按住左手鼠标按钮在峰值周围绘制一个框进行放大，将盒子伸展到峰值上并释放。
   3. 放置光标线，使其位于峰值的最高点（或紧接之后）。
   4. 双击右侧鼠标按钮，峰值的质谱将显示在数据分析屏幕的下窗中。
   5. 要搜索光谱库，请将光标移动到光谱窗口的任何地方，然后双击右侧鼠标按钮。库搜索结果将显示在一个新的窗口中。
   6. 要从兴趣谱中去除背景噪音，请先双击有关峰值上的右手鼠标按钮。然后双击感兴趣的峰值前没有峰值的区域中的右手鼠标按钮。选择 色谱图|减去光谱。减去的频谱将显示在数据分析屏幕的下窗，并将在窗口头中的 SCAN 数据旁边显示"（-）"。

根据这项协议，我们初步确定了总共32种挥发性化合物，从分析14个非生殖器气味标记自发释放在过滤纸上由红褶狐猴（Varecia variegata rubra），并比较气味配置文件与信号器12的功能。天然存在的挥发性化合物，如碳氢化合物、三苯甲酸酯、三苯醇和酮，存在于这些特征中，包括以前被发现充当性信息素的化合物，以及其他动物物种健身的线索。已初步确定的化合物列在 表1中。代表色谱图（1 个来自控制，1 个来自狐猴气味标记）显示在 图 1 中。不同研究对象的成分数量和相对丰度因样本而异。然而，所有样品中都存在六种化合物（苯甲醛、2-乙基-1-六氯醇、p-cresol、cis-p-mentha-2、8-dien-1-ol、2-皮宁-4-1、五角苯酚）。

这项研究的结果表明，红发狐猴使用气味标记来传达有关性别和女性年龄的信息，而非生殖器标记在社会流中起着一种作用。

使用本议定书后的另一个有代表性的结果是我们对雌性橄榄大猩猩（帕皮奥·阿努比斯）的生育广告（Vaglio等人未公布的数据）的研究。我们通过对385个雌性大猩猩阴道气味样本的分析，共鉴定了74种挥发性化合物。这些化合物包括一系列自然产生的臭味挥发性化合物，如酮、酒精、醛、三叶草、挥发性脂肪酸和碳氢化合物。典型的色谱图用于比较空白控制和雌性大猩猩阴道气味样本从肥沃和非肥沃时期显示在 图2。我们检查了阴道气味特征和雌性大猩猩的性接受性之间的关系。我们的结果表明，阴道气味的总量与生育力不同，这表明气味可能在信号雌性大猩猩生育能力方面发挥作用。我们还发现组类型之间阴道气味的差异，但我们无法区分组组成、女性年龄和均等的影响。

图1。示例色度图;（顶部色谱图-"控制"）控制样本，显示污染物:（底部色谱图 -"狐猴香味标记"）一个成年女性红发狐猴非生殖器气味分泌物，显示污染物和有意义的生物化合物。红色箭头表示在所有样品中发现的六种有意义的生物化合物:（a） 苯甲醛:（（b） 2-乙基-1赫萨诺尔:（c） p- 克雷索尔:（d） 顺-p-门塔-2，8-迪恩-1-奥尔:（e） 2-皮宁-4-1:（f） 五角大厦。这个数字已经从詹达等人12日修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2。示例色度图从（顶部色谱 - "控制"）控制样本中，显示污染物;（中色谱图-'巴布恩无肥味'）雌性橄榄大猩猩，阴道气味样本来自非肥沃期:和 （底部色谱 - '巴布恩肥沃的气味'） 雌性橄榄大猩猩， 阴道气味样本从肥沃时期。 请单击此处查看此图的较大版本。

表1。 过滤纸样本中存在的挥发性化合物来自女性红毛狐猴非生殖器气味分泌物，初步使用ChemStation软件和NIST质量光谱数据库（MSD F.01.01.2317版本）确定。这张桌子已经从詹达等人的12号表格中修改了。

作者没有什么可透露的。