我们已开发出一种有效的采样与分析气味信号的方法，以探究这些信号在动物交流中的潜在作用。具体而言，我们采用顶空固相微萃取技术结合气相色谱-质谱联用法，对动物气味及嗅觉标记中的挥发性成分进行分析。
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摘要
摘要
我们开发了一种有效的气味信号采样与分析方法，通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术，以探究其在动物通讯中的潜在作用。该技术可对气味分泌物中的挥发性成分进行半定量分析，通过分离样品中各组分并初步鉴定其化学结构，随后分析各峰面积比例，以发现可能参与信号传递的化合物变化趋势。本方法的主要优势包括：可分析多种类型的样品；无需复杂的样品前处理或萃取步骤；能够分离并分析混合物中的各个组分；可鉴定所检测到的组分；并能提供所检测组分的半定量甚至定量信息。该方法的主要局限性在于样品本身。由于目标组分具有挥发性，容易在采样后发生损失或浓度改变，因此样品采集后的储存与运输必须得当。这也意味着样品的保存和运输条件相对昂贵。该方法适用于多种样品类型（包括尿液、粪便、毛发以及气味腺体分泌物）。这些气味由复杂混合物组成，存在于多种基质中，因此必须采用适当技术来分离各组分，并提取具有生物学意义的化合物。
引言
关于动物嗅觉信号背后的化学变化，目前所知甚少1，部分原因在于记录和量化气味挥发性化学谱时面临的方法学挑战2。在处理高度复杂的化学基质时存在多种潜在问题，包括在气味样品的采样和分析过程中可能出现的困难3。
在伍尔弗汉普顿大学罗莎琳德·富兰克林科学中心，我们正在对气味和嗅觉标记进行分析，以了解动物如何利用这些信号。我们将化感化学与行为生态学、内分泌学和细胞学相结合，以增进对嗅觉信号在动物交流中所起作用的理解。
我们已建立一种方法，并对多种物种的气味和标记物进行了分析，包括多种非人类灵长类动物（如冕狐猴、红领狐猴、日本猕猴、橄榄狒狒、黑猩猩）以及其他哺乳动物（如猫、牛）。我们收集并分析了多种样本，包括尿液、粪便、毛发以及气味腺分泌物。这些气味和气味标记由复杂的化合物混合物组成，因此用于分析的任何方法都必须包含某种分离技术。如图所示，这些物质还存在于多种基质中，因此有必要采用技术手段来提取目标成分。
Vaglio 等人4及其他作者5的先前研究采用动态顶空萃取（DHS）结合气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），而直接溶剂萃取
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方案
1. 样本采集
- 采集以下其中一种类型的样本气味：
- 通过让已适应的研究对象（例如动物园灵长类动物）在无菌滤纸上进行气味标记（如气味腺分泌物），或直接排入小瓶（如尿液），收集其自然释放的气味。
- 在使用正向强化训练使研究对象配合后，用无菌棉签擦拭采集样本。
- 在对研究对象实施镇静后，用无菌棉签擦拭采集样本。
- 将样本放入无菌的10 mL螺口透明玻璃小瓶中，并用带有PTFE/硅胶隔垫的螺口盖密封。立即在-20 °C条件下保存。
注意：必须使用洁净的个人防护装备（如丁腈手套），并频繁更换；避免皮肤直接接触样本和小瓶。建议使用全新的小瓶；若使用过的小瓶，则必须预先彻底清洗，再采用相同的处理流程。 - 每次采集气味标记时，均应同步采集环境空白样本。例如，在采样过程中将采样介质（如滤纸或棉签）以及顶空小瓶暴露于环境中，以作为空白对照。
2. 样品制备
- 在野外准备样品时，使用刀片从带有气味标记的滤纸上切取约10 mm见方的样本，或取棉签头部，放入10 mL带螺口盖的顶空瓶中。
- 每处理完一个样品后，应使用适当的抗菌湿巾和/或酒精清洁切割采样介质所用的刀片，并彻底擦干。
- 将所有样品储存在-20 °C条件下。
注意：建议在-20 °C保存，若条件....
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结果
根据本方案，我们初步鉴定出红领狐猴（Varecia variegata rubra）在滤纸上自然释放的14份肛周腺体气味标记中共含有32种挥发性化学化合物，并将这些气味图谱与信号发出者的特征进行了比较12。这些图谱中包含天然存在的挥发性化合物，如烃类、萜烯类、萜烯醇类和酮类，其中一些化合物此前已在其他动物物种中被发现具有性信息素功能或可作为健康状况的化学信号。初步鉴定出的化合物列于表1中。图1展示了两个代表性色谱图（1个来自对照样本，1个来自狐猴气味标记）。不同研究对象之间的样本在组分数量和相对丰度上存在差异。然而，有六种化合物（苯甲醛、2-乙基-1-己醇、对甲酚、顺式-对薄荷-2,8-二烯-1-醇、2-蒎烯-4-酮、十五烷）在所有样本中均被检测到。
本研究的结果表明，红领狐猴利用气味标记传递有关性别和雌性年龄的信息，其中肛-生殖区标记在社会性交流中发挥着作用。
采用本.......
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讨论
使用对照样品（包括采样时建立的环境对照和系统空白）对于解释气味标记样品至关重要。必须从气味标记样品中排除归因于采样环境或仪器系统的任何峰，以确保在分析中仅包含目标峰。这些对照还可用于评估和监测仪器的“运行状态”。
该方案包括在每次萃取前后对纤维进行活化的步骤。使用自动进样器可使这一过程更加简便，并确保样品之间不会发生交叉污染。
该方法的主要局限性与样本本身有关。采集后，必须对样本进行适当的保存和运输。其中特定关注的组分具有挥发性，容易丢失或浓度发生变化。目前，样本通常在-20°C条件下冷冻保存和运输。因此，样本的储存和运输成本较高。若将样本运送至实验室进行分析的过程出现延迟，将进一步增加成本，并可能影响从气味标记中获得的分析结果。仍需进一步研究以明确时间和储存条件对样本分析结果的影响。由于气味标记中特别重要的组分多为挥发性较强的物质，因此在样本采集后，这些组分的含量可能发生改变。此外，还需考虑某些类型样本中潜在的细菌作用。例如，在尿液样本的酒精检测中，尿液中存在的细菌可能产生酒精，从而导致检测到的酒精水平升高。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢基思·霍尔丁（Keith Holding）在伍尔弗汉普顿罗莎琳德·富兰克林科学中心提供的化学分析协助，以及本·曼特尔（Ben Mantle）为本视频制作所做出的贡献。我们还感谢佛罗伦萨大学质谱中心的格洛里亚诺·莫内蒂教授（Prof. Gloriano Moneti）、朱塞佩·皮耶拉钦尼博士（Dr. Giuseppe Pieraccini）及其团队成员，以及意大利国家研究委员会（CNR）ARCA实验室的卢卡·卡拉迈教授（Prof. Luca Calamai）和马尔科·米凯洛齐博士（Dr. Marco Michelozzi），感谢他们在建立本方法学过程中提供的帮助。包含本文所述采样与分析方法的研究项目得到了两项玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里欧盟内部博士后奖学金（资助协议编号：327083、703611）、英国灵长类动物学会的小型资助项目（“感官丰富的灵长类动物”）以及英国科学院/利华休姆信托基金向S.V.提供的小型研究资助（“狩猎采集者是否具有特殊的嗅觉能力？”）的支持。建立本方法学所需的实验工作还获得了伍尔弗汉普顿大学科学与工程学部年度资助竞赛向S.V.提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 自动进样瓶 | Agilent | 5188-5392 | 带18 mm 瓶盖的10 mL 螺口瓶 |
| 18 mm 瓶盖 | Agilent | 8010-0139 | 带PTFE/硅胶隔垫的磁性瓶盖 |
| 自动进样器 | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| 毛细管色谱柱 | Agilent | HP5-MS | 30 m × 0.25 mm；0.25 µm |
| 数据分析软件 | Agilent | - | ChemStation |
| 气相色谱仪 | Agilent | 7890B | |
| 进样口隔垫 | Agilent | 5182-3442 | Merlin 微密封隔垫 |
| 质谱选择性检测器 | Agilent | 5977A | |
| 报告软件 | Microsoft | - | Excel |
| 质谱图库 | NIST | - | NIST/EPA/NIH 质谱图库 |
| 质谱图库检索程序 | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| 不分流进样衬管 | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME 萃取头 | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB 萃取头 |
参考文献
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68....
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