本文介绍了一种通过接触抑制实现人原代角质形成细胞体外分化的逐步实验流程，并通过RNA-seq分析在分子水平对其进行表征。
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方法文章
通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人原代角质形成细胞常被用作研究表皮分化及相关疾病的体外模型。已有文献报道了在二维（2D）浸没培养条件下，通过不同诱导方式实现角质形成细胞体外分化的实验方法。本文所述方法为通过接触抑制诱导角质形成细胞进行二维体外分化，并继而通过RNA-seq进行分子表征的实验流程。简言之，角质形成细胞在添加生长因子的特定角质形成细胞培养基中培养，直至完全汇合。细胞间的紧密接触可诱导分化，同时通过去除培养基中的生长因子进一步促进分化过程。RNA-seq分析结果显示：1）分化后的角质形成细胞在分化过程中表现出独特的分子特征；2）其动态基因表达模式与表皮分层过程中的细胞高度相似。与正常角质形成细胞分化相比，转录因子p63突变的角质形成细胞表现出形态学改变及分子特征异常，与其分化缺陷表现一致。综上所述，本实验方案详细描述了二维体外角质形成细胞分化及其分子表征的步骤，重点介绍了RNA-seq数据的生物信息学分析流程。由于RNA提取及RNA-seq操作已有详尽文献记录，故本方案不重点阐述该部分。该体外角质形成细胞分化实验及生物信息学分析流程可用于研究健康与疾病状态下角质形成细胞表皮分化过程中的分子事件。
引言
来源于人体皮肤的原代角质形成细胞常被用作细胞模型来研究表皮生物学1,2,3,4。表皮的分层结构可通过角质形成细胞的分化进行模拟，既可在二维浸没式单层培养条件下实现，也可在三维气液界面类器官模型中建立2,3,5,6,7。尽管三维模型在评估表皮结构与功能方面的重要性日益增加，但由于二维分化模型操作简便，且能够获得大量用于分析的细胞，目前仍被广泛使用。
已采用多种条件在二维培养中诱导角质形成细胞分化，包括添加血清、高浓度钙、较低温度以及抑制表皮生长因子受体2,3。这些方法均已通过一系列角质形成细胞分化标志基因得到验证，并证明在评估角质形成细胞分化（包括在病理条件下）方面是有效的。然而，当检测....
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方案
从健康志愿者或p63基因突变患者的躯干部位取皮肤活检样本，用于建立原代角质形成细胞培养。所有关于建立人原代角质形成细胞的实验程序均经拉德堡德奈梅亨大学医学中心伦理委员会（“Arnhem-Nijmegen人类相关研究委员会”）批准。已获取知情同意书。
1. 通过接触抑制实现人原代角质形成细胞的分化
- 从角质形成细胞基础培养基（Keratinocyte Basal Medium）制备角质形成细胞生长培养基（KGM）材料表必要时。
- 使用预配制的储备液（KGM-pro；参见 表1).
- 配制500 mL分化培养基（KGM-dif；参见 表 2).
注意：添加补充剂的KGM可在4 °C保存两周。如需长期保存，可分装后于-20 °C储存。 - 以 5.0–20 × 10 的密度接种原代角质形成细胞3 细胞/厘米²2，根据细胞的增殖能力而定。加入足量的KGM-pro培养基以覆盖细胞。
注意：1）KGM 培养基中常规细胞培养的详细步骤可参见 Lonza 公司网站132）每种细胞系都应测试其接种密度。例如，正常原代角质形成细胞系的接种密度可为5.0 × 103 细胞/厘米²
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结果
正常角质形成细胞分化及RNA-seq分析
本实验采用来自五名个体的角质形成细胞系进行分化及RNA-seq分析。图1总结了分化过程及RNA-seq分析结果的实验流程。图1A展示了正常角质形成细胞体外分化过程及分化过程中细胞形态变化的概览。主成分分析（PCA）显示，处于分化过程中的角质形成细胞具有相互关联但又明显不同的整体基因表达谱（图1B）。通过k均值聚类对高变基因进行聚类，以可视化分化过程中基因表达的动态变化和表达模式（图1C）。
每个基因簇由角质形成细胞分化标志基因代表（例如，KRT5 代表增殖期，KRT1 和 KRT10 代表早期和中期分化，IVL/LOR/FLG 代表晚期分化）。对高变异性基因簇进行基因本体（GO）注释分析（图1C）显示，这.......
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讨论
本研究描述了一种诱导人角质形成细胞分化并利用RNA-seq分析对其进行后续表征的方法。在现有文献中，许多关于人角质形成细胞分化的研究采用另外两种方法：高钙浓度或添加血清 作为诱导分化的手段2,3,23。此前有研究报告对这三种不同方法进行了细致比较3，结果表明这些方法可能代表了角质形成细胞分化的不同生物学过程。在同一项研究中，作者指出，由血清诱导的分化细胞具有较高的增殖潜能，并表达KRT16和SKALP/PI3等基因，这些基因在银屑病皮肤中表达，但在正常表皮中不表达，因此血清诱导的分化模型可用于银屑病的研究。相比之下，接触抑制联合生长因子去除的方法能够诱导KRT1和KRT10的表达，这两种角蛋白通常在表皮中表达，更接近正常的角质形成细胞分化过程。高钙诱导所引发的基因表达谱介于血清诱导与接触抑制之间，是特异性最低的方法。在分化过程中采用RNA-seq分析进一步证实，接触抑制联合生长因子去除的方法可诱.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由荷兰科学研究组织（NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010，H.Z.）（NWO/ALW/开放竞争/ALWOP 376，H.Z.，J.G.A.S.）；拉德堡德大学研究员项目（H.Z.）；以及中国国家留学基金管理委员会资助项目 201406330059（J.Q.）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物分析仪 2100 | Agilent | G2929BA | |
| 牛脑垂体提取物（BPE） | Lonza | bulletKit 的组成部分 | |
| CFX96 实时系统 | Bio-Rad | qPCR 仪器 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 表皮生长因子（EGF） | Lonza | bulletKit 的组成部分 | |
| 乙醇胺 >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 高灵敏度 DNA 芯片 | Agilent | 5067-4626 | |
| 氢化可的松 | Lonza | bulletKit 的组成部分 | |
| 胰岛素 | Lonza | bulletKit 的组成部分 | |
| iQ SYBR Green 试剂盒 | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA 合成试剂 | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA 文库定量试剂盒 | Roche | 07960255001 | 低浓度测量试剂盒 |
| 含 RiboErase 的 KAPA RNA HyperPrep 试剂盒 | Roche | KK8540 | RNAseq 试剂盒 |
| KGM Gold 角质形成细胞生长培养基 bulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX（型号） | Nanodrop 和 Qbit 用于 DNA 和 RNA 测量 |
| NEXTflex DNA 条形码 -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp 长引物 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico 芯片 | Agilent | 5067-1513 |
参考文献
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation o....
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重印与许可
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