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方法文章

通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

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DOI：

10.3791/60905

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2020年5月16日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过接触抑制实现人原代角质形成细胞体外分化的逐步实验流程，并通过RNA-seq分析在分子水平对其进行表征。

摘要

人原代角质形成细胞常被用作研究表皮分化及相关疾病的体外模型。已有文献报道了在二维（2D）浸没培养条件下，通过不同诱导方式实现角质形成细胞体外分化的实验方法。本文所述方法为通过接触抑制诱导角质形成细胞进行二维体外分化，并继而通过RNA-seq进行分子表征的实验流程。简言之，角质形成细胞在添加生长因子的特定角质形成细胞培养基中培养，直至完全汇合。细胞间的紧密接触可诱导分化，同时通过去除培养基中的生长因子进一步促进分化过程。RNA-seq分析结果显示：1）分化后的角质形成细胞在分化过程中表现出独特的分子特征；2）其动态基因表达模式与表皮分层过程中的细胞高度相似。与正常角质形成细胞分化相比，转录因子p63突变的角质形成细胞表现出形态学改变及分子特征异常，与其分化缺陷表现一致。综上所述，本实验方案详细描述了二维体外角质形成细胞分化及其分子表征的步骤，重点介绍了RNA-seq数据的生物信息学分析流程。由于RNA提取及RNA-seq操作已有详尽文献记录，故本方案不重点阐述该部分。该体外角质形成细胞分化实验及生物信息学分析流程可用于研究健康与疾病状态下角质形成细胞表皮分化过程中的分子事件。

引言

来源于人体皮肤的原代角质形成细胞常被用作细胞模型来研究表皮生物学1,2,3,4。表皮的分层结构可通过角质形成细胞的分化进行模拟，既可在二维浸没式单层培养条件下实现，也可在三维气液界面类器官模型中建立2,3,5,6,7。尽管三维模型在评估表皮结构与功能方面的重要性日益增加，但由于二维分化模型操作简便，且能够获得大量用于分析的细胞，目前仍被广泛使用。

已采用多种条件在二维培养中诱导角质形成细胞分化，包括添加血清、高浓度钙、较低温度以及抑制表皮生长因子受体2,3。这些方法均已通过一系列角质形成细胞分化标志基因得到验证，并证明在评估角质形成细胞分化（包括在病理条件下）方面是有效的。然而，当检测特定的标志基因组合时，这些诱导条件在分化效率和动力学方面也显示出差异2,3。

其中一种方法涉及角质形成细胞的接触抑制以及培养基中生长因子的耗尽8。研究表明，当细胞达到完全密度时，角质形成细胞可自发地发生分化。 在培养基中去除生长因子可进一步促进分化。已有研究显示，结合接触抑制和生长因子耗尽的方法，可在使用多种表皮标志物时，产生具有与正常复层表皮相似基因表达模式的分化角质形成细胞3，表明该模型适用于研究正常角质形成细胞的分化过程。最近，已有两项利用该模型对角质形成细胞分化进行的全面基因表达分析被报道9,10。研究人员在分子水平上验证了该模型，并证明其可用于研究正常及病变状态下的角质形成细胞分化。

本方案描述了以下操作步骤 体外 分化方法及利用RNA-seq对分化细胞进行分子分析。本文还展示了分化第0天（增殖阶段）、第2天、第4天和第7天（分别为早期、中期和晚期分化）细胞转录组的表征。结果显示，分化的角质形成细胞表现出与表皮分层过程中细胞高度相似的基因表达模式。为检验该方法是否可用于研究皮肤病理过程，我们采用相同的实验与分析流程，对来源于外胚层发育不良、并指（趾）畸形及唇腭裂（EEC）综合征患者的、携带转录因子p63突变的角质形成细胞进行了研究11,12本方案重点介绍角质形成细胞的体外分化以及随后对RNA-seq数据进行的生物信息学分析。完整实验流程中的其他步骤，如RNA提取、RNA-seq样本制备和文库构建，已有充分文献记录，尤其在使用多种常见商用试剂盒时易于操作，因此这些步骤在本方案中仅作简要描述。实验数据显示，该流程适用于研究健康与病变角质形成细胞在表皮分化过程中发生的分子事件。

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方案

从健康志愿者或p63基因突变患者的躯干部位取皮肤活检样本，用于建立原代角质形成细胞培养。所有关于建立人原代角质形成细胞的实验程序均经拉德堡德奈梅亨大学医学中心伦理委员会（“Arnhem-Nijmegen人类相关研究委员会”）批准。已获取知情同意书。

1. 通过接触抑制实现人原代角质形成细胞的分化

  1. 从角质形成细胞基础培养基（Keratinocyte Basal Medium）制备角质形成细胞生长培养基（KGM）材料表必要时。
  2. 使用预配制的储备液（KGM-pro；参见 表1).
  3. 配制500 mL分化培养基（KGM-dif；参见 表 2).
    注意：添加补充剂的KGM可在4 °C保存两周。如需长期保存，可分装后于-20 °C储存。
  4. 以 5.0–20 × 10 的密度接种原代角质形成细胞3 细胞/厘米²2，根据细胞的增殖能力而定。加入足量的KGM-pro培养基以覆盖细胞。
    注意：1）KGM 培养基中常规细胞培养的详细步骤可参见 Lonza 公司网站132）每种细胞系都应测试其接种密度。例如，正常原代角质形成细胞系的接种密度可为5.0 × 103 细胞/厘米²2，而携带转录因子p63突变且增殖能力较弱的细胞系应以20 x 10的密度接种3 细胞/厘米²23) 根据实验设计，应接种多皿或多孔细胞，以便在不同分化时间点收集重复样本。
  5. 接种后第0天接种细胞，第1天和第2天用KGM-pro培养基更换培养液（接种后第1次换液）st 第3天后，每隔一天更换一次KGM-pro培养基。定期观察细胞，至少每隔一天检查一次。
  6. 当细胞融合度超过90%时，通过更换为KGM-dif培养基诱导细胞分化。更换为KGM-dif培养基的当天定义为分化第0天。收集细胞用于后续RNA分析：首先用DPBS洗涤2次，随后加入RNA提取试剂盒中的裂解缓冲液。
    注意：以上述接种密度进行培养时，细胞应在7–10天内达到汇合。可通过提高初始接种密度以更快达到汇合状态。若细胞增殖能力较差，延长培养时间可能仍无法获得完全汇合的细胞层，此时可能需要提高接种密度。
  7. 每天用KGM-dif培养基更换培养基，并在分化第2、4和7天收集细胞，用于后续RNA提取。

2. RNA 提取

  1. 分离总RNA。可使用商业化的RNA提取试剂盒（如Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA），或采用苯酚法进行。14然而，对于RNA-seq样品，强烈推荐使用包含DNA酶处理步骤的分离试剂盒，以防止DNA污染和苯酚残留。文中提供了一种 commercially available RNA提取试剂盒的示例 材料表.
  2. 使用分光光度计测定RNA浓度。DNA和RNA在260 nm处均有吸收峰。
    注意：1）260 nm 与 280 nm 处吸光度的比值用于评估 RNA 的纯度。比值约为 2.0 通常被视为“纯”RNA。若该比值显著低于 2.0，则样品可能被在 280 nm 处有吸收的污染物（如蛋白质、苯酚或其他物质）污染。2）260 nm 与 230 nm 处吸光度的比值用于测定核酸纯度。预期比值在 2.0 至 2.2 之间。若该比值显著偏低，则样品可能被在 230 nm 处有吸收的污染物（如 EDTA、乙醇或其他物质）污染。

3. RNA 质量检测

  1. 可使用生物分析仪RNA Pico芯片对RNA进行检测，以定量验证RNA完整性数值（RIN），或通过凝胶电泳进行定性评估。通常建议RIN值至少达到8。然而，从组织中提取RNA时，RIN值可能较低。
    注意：可选择对RNA样本进行qPCR以实施质量控制。 

4. RNA-seq文库构建

注意：RNA-seq文库构建通常使用商业试剂盒或在商业条件下进行。本方案改编自商业试剂盒KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase（Illumina），简要描述了所有必需步骤：利用寡核苷酸杂交去除人核糖体RNA（rRNA）、RNA片段化、第一链合成、第二链合成及A尾添加，以及每步之后的纯化15。其他文库构建试剂盒也可用于此目的。建议使用市售试剂盒进行此步骤，因为所生成cDNA文库的质量通常更为稳定。2）以下步骤以1次文库构建为例进行说明。若需同时处理多个样本，建议配制含额外10%体积的预混液。

  1. 寡核苷酸杂交与核糖体RNA去除
    1. 配制寡核苷酸杂交预混液（总体积 = 11 µL，包含4.4 µL杂交缓冲液、4.4 µL杂交寡核苷酸和2.2 µL无RNase水）和去除预混液（总体积 = 5.5 µL，包含3.3 µL去除缓冲液和2.2 µL RNase H）。
    2. 在热循环仪上设置PCR反应程序：95 °C 预变性2 min；以-0.1 °C/s的速率降温至45 °C；在45 °C暂停；45 °C延伸30 min；4 °C长期保存。
      注意：建议起始使用的RNA量为扩增所需量的两倍。首次操作时，取其中一半量进行后续步骤。此举可确保在扩增循环数不足或过度扩增时（见步骤4.7.2），仍有材料可用于以不同循环数重复实验。
    3. 使用25 ng至1 µg总RNA溶于10 µL无RNase水中，加入10 μL寡核苷酸杂交预混液。将样品放入预设程序的PCR仪中并启动程序。
    4. 当程序运行至45 °C的暂停步骤时，将5 µL去除反应主混合液加入20 µL杂交反应体系中，无需从热循环仪中取出反应管。通过反复吹吸数次充分混匀。
    5. 继续运行热循环仪程序，进入耗尽步骤（45 °C，30 分钟）。
      注意：1）在进行后续步骤的rRNA去除时，将用于rRNA去除的磁珠（例如KAPA纯化磁珠）置于室温（RT）；2）建议提前配制DNase消化主混合液（用于第4.2节），因为rRNA去除后的纯化步骤完成后需立即使用相关试剂。
    6. 进行2.2倍磁珠法KAPA Pure Beads纯化：将RNA混合物（25 μL）与KAPA Pure Beads（55 μL）混合，通过反复吹打数次，充分重悬磁珠于RNA混合物中。
    7. 室温孵育5分钟，使RNA结合到磁珠上，将管子置于磁力架上捕获磁珠，直至液体变澄清，小心移除并弃去60 µL上清液。
    8. 将管子置于磁力架上，加入200 µL 80%乙醇洗涤2次，每次与磁珠孵育≥30秒后弃去乙醇。第二次洗涤后，尽量在不扰动磁珠的情况下去除所有残留乙醇。
    9. 室温下干燥珠子3–5分钟，或直至所有乙醇完全挥发。
      注意：珠子过度干燥可能导致产率降低。
  2. DNase 消化
    1. 配制DNase消化主混合液（总体积 = 22 µL，包含2.2 µL DNase缓冲液、2 µL DNase和17.8 µL无RN酶水）。
    2. 用移液器反复吹打，将磁珠重悬于DNase消化主混合液（20 μL）中。将离心管在室温下孵育3分钟，以使RNA从磁珠上洗脱下来。
    3. 将管子置于磁力架上以捕获磁珠，直至液体澄清，然后小心地将20 µL上清液转移至干净的管中。
    4. 将含有上清液的离心管在 37 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：建议提前配制RNA洗脱、片段化和引物退火主混合液（见第4.3节），因为DNase消化后的纯化步骤完成后将直接需要这些试剂。
    5. 按照4.1.6–4.1.9步骤进行2.2倍磁珠纯化。
  3. RNA洗脱、片段化与引物结合
    1. 将11 µL Fragment, Prime and Elute Buffer (2x) 与11 µL无RNase水混合，配制Fragment, Prime and Elute Buffer (1x)的预混液。
    2. 用22 µL断裂、引物与洗脱缓冲液（1x），通过反复吹打数次，将珠粒与经纯化及DNase处理的RNA充分重悬。
    3. 室温孵育 3 分钟以洗脱磁珠上的 RNAs 然后将管子置于磁铁上，以捕获磁珠，直至液体变澄清。
    4. 小心地将20 µL上清液转移至一个或多个离心管中。弃去含有珠子的离心管。
      注意：此步骤可安全暂停，样品可在 -20 °C 保存不超过 24 小时。
    5. 将管子放入热循环仪中，在94 °C下进行片段化和引物退火，持续6分钟，得到约200–300 bp长度的片段。
      注意：对于100–200 bp的片段，在94 °C孵育8分钟。当使用部分降解的RNA时，根据降解程度在85 °C下片段化1–6分钟。
    6. 将管子置于冰上，并立即进行第一链合成。
  4. 第一链合成
    1. 准备  第一链合成预混液（总体积 = 12 µL，包含11 µL第一链合成缓冲液和1 µL KAPA Script）
    2. 在热循环仪上设置PCR反应程序：25 °C 反应10分钟；42 °C 反应15分钟；70 °C 反应15分钟；4 °C 保存。
    3. 在冰上，将20 µL片段化的引物RNA与10 µL第一链合成预混液混合。保持离心管置于冰上，通过轻轻吹打反应液数次以充分混匀。
    4. 将管子放入预设程序的热循环仪中，并启动程序。
  5. 第二链合成与A尾添加
    1. 在冰上配制第二链合成与A尾化主混合液（总体积 = 33 µL，包含31 µL第二链合成缓冲液和2 µL第二链合成酶） & A-尾端酶混合物)
    2. 在热循环仪上设置PCR反应程序：16 °C 反应30分钟；62 °C 反应10分钟；4 °C 保存。
    3. 将30 µL第一条链合成产物与30 µL第二条链合成及A尾化主混合液混合，于冰上反复吹打数次以充分混匀。
    4. 将管子放入预设程序的热循环仪中，并启动程序。
  6. 接头连接及连接后纯化
    1. 将接头储备液（NEXTflex DNA barcode，25 µM）用无RN酶水稀释3.57倍至7 µM。
    2. 配制连接反应主混合液（总体积 = 50 µL，含 40 µL 连接缓冲液和 10 µL DNA 连接酶）。
    3. 将60 µL第二链合成产物、45 µL接头连接预混液和5 µL稀释后的接头混合。在冰上用移液器上下吹打数次，充分混匀。
    4. 在 20 °C 下孵育试管 15 分钟，随后立即进行第一次连接产物纯化。
    5. 通过将接头连接的DNA（110 µL）与KAPA纯化磁珠（70 µL）混合，进行0.63倍的磁珠纯化；然后通过反复吹打数次，充分重悬磁珠于DNA混合液中。
    6. 重复步骤 4.1.7–4.1.9。
    7. 将离心管从磁力架上取下，加入50 µL 10 mM Tris HCl（pH = 8.0–8.5），充分重悬磁珠，室温孵育2 min。
    8. 将平板置于磁铁上，等待液体澄清。吸取50 μL澄清上清液转移至新管中。
      注意：可在 4 °C 下安全暂停，时间少于 24 小时。
    9. 通过将50 µL磁珠与纯化的接头连接DNA及35 µL PEG/NaCl溶液混合，进行0.7x磁珠纯化。充分涡旋振荡混匀。
    10. 执行步骤 4.1.7–4.1.9 的纯化操作。将磁珠充分重悬于 20 µL 10 mM Tris HCl（pH = 8.0–8.5）中，在室温下孵育 2 分钟。
    11. 将培养板置于磁铁上，等待液体变澄清。吸取20 μL澄清上清液转移至新管中，进行4.7节操作。
      注意：可在 4 °C 下安全保存不足 1 周，或在 -20 °C 下不足 1 个月。
  7. 文库扩增与纯化
    1. 配制文库扩增主混合液（总体积 = 33 µL，包含27.5 µL的2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix和5.5 µL的10x文库扩增引物混合液）。
    2. 在PCR仪上设置以下反应程序：98 °C 预变性45 s；N个循环（见下文注释）：98 °C 变性15 s，60 °C 退火30 s，72 °C 延伸30 s；72 °C 最终延伸1 min；4 °C 保存。
      注意：文库扩增的循环数取决于起始材料量，可大致估算如下：起始RNA量为25–100 ng时，循环数N = 11–15；100–250 ng时，N = 9–12；250–500 ng时，N = 7–10。
    3. 通过将扩增的文库DNA（50 µL）与KAPA纯化磁珠（40 µL）混合，进行0.8x磁珠纯化，然后用移液器反复吹打数次，充分重悬磁珠于DNA混合液中。
    4. 执行步骤 4.1.7–4.1.9 的纯化操作。将磁珠充分重悬于 50 µL 10 mM Tris HCl（pH = 8.0–8.5）中，在室温下孵育 2 分钟。
    5. 将50 μL澄清上清液转移至新管，进行第二次文库扩增纯化。
    6. 将扩增后的文库DNA（50 µL）与KAPA纯化磁珠（50 µL）混合，进行1倍体积的磁珠纯化，然后通过反复吹打数次使磁珠在DNA混合液中充分重悬。
    7. 执行步骤 4.1.7–4.1.9 的纯化操作。将磁珠充分重悬于 22 µL 的 10 mM Tris HCl（pH = 8.0–8.5）中，在室温下孵育 2 分钟。
    8. 将20 μL澄清上清液转移至新离心管，进行Qubit和Bioanalyzer检测。
  8. 浓度与片段大小
    1. 测定样品的DNA浓度。使用高灵敏度的基于荧光染料的试剂盒（例如 Denovix Qubit，参见 材料表），或者如果浓度似乎低于 0.5 ng/μL，则使用更灵敏的 qPCR 方法重新定量（例如 Kappa 定量，参见 材料表).
    2. 使用高灵敏度电泳（如生物分析仪）测定文库的片段大小。
      注意：可选地，在测序前可使用稀释后的文库替代cDNA，通过qPCR进行质量控制（附录）。
  9. 测序
    1. 将文库送交测序。对于RNA-seq差异基因表达分析，每个样本通常测序深度在1000万至2500万条读段即可满足要求。

5. 数据预处理

  1. Fastq 文件质量检查
    1. 下载并安装 Trimgalore16，以去除 Fastq 文件中的低质量碱基对和空读段。
      注意：1）此处提到的大多数软件仅适用于 Linux 系统。如果仅能使用 Windows 计算机，可使用 MobaXterm 或 Putty 软件连接 Linux 服务器进行分析。请注意，基因组索引需要大量随机存取内存（RAM），约为 64 GB。2）强烈建议将所有所需软件安装到 conda 环境中，这有助于简化软件安装和包管理。有关 conda 的更多信息，请访问 <https://docs.conda.io>。
    2. 为数据创建一个目录（文件夹），例如“RNA_seq_KC_diff”。通过输入命令“cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/”将其设置为工作目录。
      注意：有关文件夹结构的概览，请参见补充代码文件中的“folder_structure.txt”。
    3. 在工作目录中创建多个具有特定名称的文件夹：“Fastq”、“CRCh38_fasta”、“CRCh38”、“scripts”和“Mapping”。
    4. 将测序数据的 fasta 文件移至 fastq 文件夹中。或者，使用命令“ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile”为 Fastq 文件创建软链接，以节省磁盘空间。
    5. 对 Fastq 文件运行 Trim Galore，具体代码请参见 TrimGalore.txt 文件，可直接复制粘贴至 bash 中执行。根据需要修改命令中的文件夹名称和设置。
  2. 比对（Mapping）
    1. 下载用于比对的基因组，例如 hg38 ensembl release 97（未屏蔽版本）：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz；以及相应的基因注释文件：hg38 基因注释 ensembl release 97，ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz。将这两个文件传输至 CRCh38_fasta 文件夹。
      注意：也可使用其他版本的基因组，例如 UCSC 版本的 hg38，若更倾向于基于转录本 ID 而非基因 ID 进行比对。
    2. 安装 STAR 2.7.117。
    3. 使用 STAR 2.7.1 和生成基因组脚本（参见 补充代码文件）构建本地参考基因组。根据处理器核心数调整线程数量（--runThreadN X）。根据需要修改该脚本中的文件夹名称和设置，并通过复制粘贴至 bash 中运行。
    4. 安装 samtools 1.918 用于对 bam 文件进行索引，安装 gzip 用于压缩 wiggle 文件。
    5. 使用 STAR 2.7.1 将经 Trim Galore 处理后的测序读段比对至人类基因组组装 hg38（ensembl release 97），随后使用 samtools 和 gzip 进行索引。此过程应使用脚本 map_fastq.txt（参见 补充代码文件）完成。根据需要修改脚本中的文件夹名称和设置，并通过复制粘贴至 bash 中运行。
      注意：STAR 比对会生成多个输出文件，包括一个 bam 文件、一个 wiggle 文件，以及一个名为 *_ReadsPerGene.out.tab 的读段计数表，该表格可直接在 R 中合并后作为 Deseq2 的输入文件。
  3. 基因组浏览器可视化
    1. 从 UCSC 基因组浏览器工具中安装 wigToBigWig，用于通过 big2bw 脚本生成 bigwig 文件19。
    2. 将补充代码文件中的“convertBigWigChroms.py”和“CRCH38_ensembl2UCSC.txt”文件转移至工作目录下的“scripts”文件夹中。
    3. 使 convertBigWigChroms.py 文件可执行（在 Linux 系统中使用命令：‘chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py’）。
    4. 使用脚本 wig2bw.txt（参见 补充代码文件）从 Wiggle 文件生成 bigWig 文件。通过复制粘贴至 bash 中运行。
    5. 将生成的 BigWig 文件导入 UCSC 基因组浏览器或 Integrative Genomics Viewer（IGV）中进行可视化。

6. RNA-seq 数据分析

  1. 将样本数据输入 Deseq2
    1. 下载并安装 Rstudio（版本 1.1.456）和 R（版本 3.6）。
    2. 安装所有必需的 R 软件包（参见补充代码文件）。
      注：有关展示全部编程代码和输出的详细 R-markdown 文件，请参见所附文件：“RNA_seq_kc_differentiation_wt.html” 和 “RNA_seq_kc_differentiation_patient.html”。以下包含所有步骤的总体说明。
    3. 从 ReadsPerGene.out.tab 文件生成计数表。
    4. 编写一个样本数据文件，包含所有文件名、分化天数及其他相关样本信息。示例样本文件请参见 补充代码文件 中的“sample_data_example.csv”。
    5. 使用计数表和样本数据生成一个 Deseq220 对象，该对象同时包含计数数据和样本数据。
  2. 基因表达标准化、样本距离和主成分分析（PCA）
    1. 使用 Deseq2 的 rld 或 vst 标准化方法对 Deseq2 对象中的计数表进行标准化。推荐使用 rld 标准化，但在样本数量较多时，vst 标准化速度更快。
    2. 基于标准化后的读段计数强度，使用 R 中的“dist”函数计算样本距离，并基于样本距离进行“hclust”聚类。使用 pheatmap 软件包绘制热图。
    3. 使用 Deseq2 的 plotPCA 函数生成标准化读段计数强度的主成分分析（PCA）图。
      注：PCA 是探索性数据分析的工具，可用于可视化不同样本之间的距离和相关性。
  3. 差异表达/高变异性基因表达分析
    1. 使用 Deseq2 的 result 函数计算差异表达基因。然而，当评估多个时间点的变化且不适合进行成对比较时，应使用高变异性基因。在此情况下，通过 rowVars 函数计算不同时间点样本间方差，并按方差排序提取前 500 个高变异性基因。
      注：在我们的分析中，对照样本使用前 500 个高变异性基因（即在分化各天标准化表达强度中标准差最高的基因）进行后续分析。而对于疾病组与对照组的比较，则使用 Deseq2 计算随时间变化的疾病组与健康对照组之间的差异表达基因，并以多重检验校正后的 p 值 1 × 10-4 作为阈值。另一个可能的筛选步骤是排除变化倍数低于特定阈值的差异表达基因。
    2. 对差异表达基因或高变异性基因进行 kmeans 聚类，以不同表达模式进行分组。
    3. 使用 pheatmap 软件包以热图形式可视化差异表达基因或高变异性基因。热图中绘制的强度为 Deseq2 标准化强度减去中位值后的结果。
  4. 基因本体（GO）注释富集分析
    1. 通过筛选在任一样本中计数超过 10 的所有基因，生成一组表达背景基因列表。
    2. 使用 GOrilla21 等在线工具进行 GO 分析。将聚类中的差异表达/高变异性基因列表作为“目标基因列表”，将背景基因列表作为对照背景。
      注：更高级的 R 用户可使用 clusterProfiler22 软件包自动化 GO 术语富集分析。

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结果

正常角质形成细胞分化及RNA-seq分析
本实验采用来自五名个体的角质形成细胞系进行分化及RNA-seq分析。图1总结了分化过程及RNA-seq分析结果的实验流程。图1A展示了正常角质形成细胞体外分化过程及分化过程中细胞形态变化的概览。主成分分析（PCA）显示，处于分化过程中的角质形成细胞具有相互关联但又明显不同的整体基因表达谱（图1B）。通过k均值聚类对高变基因进行聚类，以可视化分化过程中基因表达的动态变化和表达模式（图1C）。

每个基因簇由角质形成细胞分化标志基因代表（例如，KRT5 代表增殖期，KRT1 和 KRT10 代表早期和中期分化，IVL/LOR/FLG 代表晚期分化）。对高变异性基因簇进行基因本体（GO）注释分析（图1C）显示，这...

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讨论

本研究描述了一种诱导人角质形成细胞分化并利用RNA-seq分析对其进行后续表征的方法。在现有文献中，许多关于人角质形成细胞分化的研究采用另外两种方法：高钙浓度或添加血清 作为诱导分化的手段2,3,23。此前有研究报告对这三种不同方法进行了细致比较3，结果表明这些方法可能代表了角质形成细胞分化的不同生物学过程。在同一项研究中，作者指出，由血清诱导的分化细胞具有较高的增殖潜能，并表达KRT16和SKALP/PI3等基因，这些基因在银屑病皮肤中表达，但在正常表皮中不表达，因此血清诱导的分化模型可用于银屑病的研究。相比之下，接触抑制联合生长因子去除的方法能够诱导KRT1和KRT10的表达，这两种角蛋白通常在表皮中表达，更接近正常的角质形成细胞分化过程。高钙诱导所引发的基因表达谱介于血清诱导与接触抑制之间，是特异性最低的方法。在分化过程中采用RNA-seq分析进一步证实，接触抑制联合生长因子去除的方法可诱...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由荷兰科学研究组织（NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010，H.Z.）（NWO/ALW/开放竞争/ALWOP 376，H.Z.，J.G.A.S.）；拉德堡德大学研究员项目（H.Z.）；以及中国国家留学基金管理委员会资助项目 201406330059（J.Q.）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物分析仪 2100AgilentG2929BA
牛脑垂体提取物（BPE）LonzabulletKit 的组成部分
CFX96 实时系统Bio-RadqPCR 仪器
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Sigma-AldrichD8537
表皮生长因子（EGF）LonzabulletKit 的组成部分
乙醇胺 >= 98%Sigma-AldrichE9508
高灵敏度 DNA 芯片Agilent5067-4626
氢化可的松LonzabulletKit 的组成部分
胰岛素LonzabulletKit 的组成部分
iQ SYBR Green 试剂盒BioRad170-8886
iScript cDNA 合成试剂Bio rad1708890
KAPA 文库定量试剂盒Roche07960255001低浓度测量试剂盒
含 RiboErase 的 KAPA RNA HyperPrep 试剂盒RocheKK8540RNAseq 试剂盒
KGM Gold 角质形成细胞生长培养基 bulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX（型号）Nanodrop 和 Qbit 用于 DNA 和 RNA 测量
NEXTflex DNA 条形码 -24IllumniaNOVA-5141036 bp 长引物
青霉素-链霉素Gibco15140122
RNA Pico 芯片Agilent5067-1513

参考文献

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接触抑制表皮分化基因表达谱分析主成分分析K-均值聚类基因本体分析P63突变
通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化
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