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方法文章

分离扁桃体单个核细胞以研究人体黏膜淋巴组织中外植体的先天免疫应答

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DOI：

10.3791/60914

⸱

2020年6月14日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology, Ulm University Medical Center, 2CNRS UMR-8601, Centre Interdisciplinaire Chimie Biologie, 3Team Chemistry & Biology, Modeling & Immunology for Therapy, Université Paris Descartes, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, 5Pediatric Otolaryngology Department, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Université de Paris, Institut Cochin

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们介绍如何简便地处理和培养接受部分手术切除扁桃体的健康人来源的扁桃体单个核细胞，以研究其在激活后模拟黏膜组织中病毒感染时的固有免疫应答。

摘要

研究来自黏膜相关淋巴组织（MALT）的分离细胞有助于理解涉及黏膜免疫的病理过程中免疫细胞的反应，因为这些细胞可在组织中模拟宿主与病原体的相互作用。尽管来源于组织的分离细胞是最早的细胞培养模型，但由于组织获取困难，其应用一直被忽视。在本实验方案中，我们介绍如何简便地处理并培养健康人扁桃体来源的扁桃体单个核细胞（TMCs），以研究在模拟黏膜组织病毒感染条件下激活的固有免疫应答。从扁桃体中分离TMCs操作快速，因为扁桃体几乎不含上皮组织，且可获得多达数十亿个主要免疫细胞类型。该方法可利用多种技术检测细胞因子的产生，包括免疫检测、qPCR、显微镜观察、流式细胞术等，其应用方式类似于使用外周血单个核细胞（PBMCs）。此外，TMCs在药物测试中表现出比PBMCs更高的敏感性，在未来的毒性检测中需予以考虑。因此，TMCs的离体培养是一种简便且易于获取的黏膜模型。

引言

由于可及性以及明显的伦理原因，对人体器官的研究受到限制。然而，这些研究对于全面理解人类生物学的复杂性至关重要。分离细胞（原代培养或细胞系）的培养体系因其易获得性，已成为细胞生物学研究中的标准系统。尽管分离细胞培养已促成许多重要发现，但细胞系的应用正受到更为严格的审视，因为它们无法完全模拟体内器官的生物学特性。然而，三维细胞或组织外植体的培养又极为复杂4,5,6。事实上，组织或器官片段具有高度异质性，其细胞组成因在组织中的位置不同而存在差异。因此，使用组织块需要进行大量技术重复和生物学重复分析，从而需要大量供体或患者样本。

黏膜相关淋巴组织（MALT）在结构上类似于淋巴结，但具有独特的功能，因为其主要作用是调节黏膜免疫7。与通常位于组织较远部位的淋巴结不同，MALT通常位于黏膜组织上皮的正下方。组织学上，它们主要由高浓度的B细胞和T细胞组成，同时也包含巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞。MALT约占人体淋巴组织总量的50%。根据其解剖位置，MALT可分为九个亚群：GALT（肠道）、BALT（支气管）、NALT（鼻腔）、CALT（结膜）、LALT（喉部）、SALT（皮肤）、VALT（外阴）、O-MALT（有序结构型）和D-MALT（弥散型）。其中O-MALT主要由瓦尔代尔环（Waldeyer's tonsillar ring）的扁桃体构成，是临床上最容易获取的MALT组织8,9。实际上，位于口咽部的扁桃体构成了抵御（潜在）侵袭性微生物进入消化道和呼吸道的主要屏障10。此外，扁桃体表面覆盖着一层细薄的复层鳞状非角化上皮，其下方由含血管、神经和淋巴管的结缔组织囊支撑，有利于免疫细胞的快速进入11,12。此外，扁桃体切除术（即手术切除扁桃体）是治疗儿童睡眠呼吸障碍的常见手术，使得扁桃体在生理条件下成为一种易于获得的组织样本13。

扁桃体可用于研究涉及黏膜免疫的病理状态下免疫细胞的反应。事实上，在HIV感染中，由于扁桃体含有高浓度的免疫细胞，它们既是病毒复制的主要靶标，又能产生大量在循环系统中无法检测到的细胞因子14,15。在稳态条件下，多种黏膜组织（包括扁桃体）中存在少量的类先天性细胞群体，而这些细胞在血液中基本不存在。

因此，扁桃体来源的单个核细胞（TMCs）相较于外周血单个核细胞（PBMCs）是一种更相关且更复杂的模型，能够回答更为深入的科学问题。另一方面，组织外植体的使用可能较为复杂，且并不总是适用于先天免疫研究。因此，我们建立了一种利用TMCs研究黏膜免疫激活的模型16。本文中，我们描述了一种从新鲜人扁桃体中高效分离TMCs的方法。该方法可在保持细胞完整性的前提下，获得大量可用于离体（ex vivo）研究的免疫细胞。

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方案

标本并非专门为研究目的而采集，且该研究不被视为侵入性研究。然而，人类扁桃体的采集需要获得当地相关机构的伦理批准。在本研究中，已获得人员保护委员会（Comité de Protection des Personnes，IDRCB/EUDRACT：2018A0135847）的批准。此外，还需获得每位患者或其法定代理人同意，以获取有助于解释实验结果的捐赠者个人资料（如性别、年龄、耳鼻喉感染史）。

1. 人扁桃体组织的处理

  1. 根据相关机构的建议，将每位供体的扁桃体放入一个无菌的50 mL试管中，试管内含25 mL 1× PBS，并在室温（RT）下运输至实验室（采用三层防护：试管、安全盒和袋子）。
    注意：整个操作应在生物安全二级实验室中进行。所有人体样本均应谨慎处理，因其未经预先筛查，可能含有传染性病原体。
  2. 每次使用后均需清洁所有工具。
    1. 使用后拆卸细胞筛，与其他器械（如研杵、镊子）一起置于含有洗涤剂溶液（1/10体积的洗涤剂溶于H2O中）的容器内，过夜浸泡。
    2. 用刷子刷洗每件器具以去除残留组织，并用清水冲洗干净。
    3. 将所有部件充分干燥后，准备细胞筛（85 mL，37 mm直径），方法是将60目不锈钢网置于10目不锈钢网之上，并拧紧固定环。
    4. 将所有工具放入无菌袋中，进行高压灭菌处理。

2. 人类扁桃体组织的解剖及扁桃体单个核细胞（TMCs）的分离

  1. 将细胞筛置于一个150 x 25 mm2（SPL150）细胞培养皿上，其余器械放置于另一个SPL150培养皿中以保持无菌状态。
  2. 使用无菌镊子将扁桃体组织从瓶中转移至细胞筛中。同时倒入所有PBS溶液，其中含有已从扁桃体中逸出的细胞。如有必要，可添加更多PBS以浸没筛网。
    注意：组织应始终浸没在液体中，以避免干燥。
  3. 使用镊子和手术刀去除烧灼、带血及纤维化组织。
    注意：来自儿童的扁桃体通常无需此步骤。
  4. 使用手术刀和弯头镊子将组织切成直径小于0.5 cm的小块。应将所有组织切碎，以便小块组织始终能够被液体浸没。
  5. 将少量组织块放入细胞筛中，用玻璃研杵在筛网上反复刮擦，直至仅剩极薄的一层白色基质。移除并丢弃该基质，以防止堵塞筛网。
  6. 当所有组织均已被挤压通过筛网后，使用10 mL移液器将全部细胞悬液转移至筛网上，并进行最后一次刮擦。
  7. 用10 mL移液器将细胞悬液转移至无菌瓶中。用1× PBS冲洗筛网和细胞筛。将细胞悬液在室温下静置5分钟。此步骤可使残留的基质、死亡细胞及释放的DNA沉淀并聚集，便于后续操作。
  8. 将一个无菌的70 µm滤网置于新的50 mL离心管上（小心从包装袋中取出），用10 mL移液器将细胞悬液轻柔地转移至滤网上。不要混匀悬液，因为其中常含有沉淀物。若滤网堵塞，可用无菌1 mL移液器吸头背面轻轻刮擦，使细胞通过滤网。根据需要及时更换滤网。
  9. 在4 °C条件下，以250 × g离心10分钟。
  10. 弃去上清液，通过轻柔振荡离心管重悬沉淀，随后将细胞重悬于35 mL PBS中。
  11. 在新的离心管上放置一个新的70 µm滤网，用10 mL移液器将细胞悬液转移至滤网上。若滤网堵塞，请采用步骤2.7中所述方法处理。

3. 通过细胞密度梯度分离TMCs

注意：TMC 可在步骤 2.10 之后使用。然而，为了获得更澄清的细胞悬液，并去除其他细胞碎片及任何红细胞，建议对单个核细胞进行细胞密度梯度分离。

  1. 在新的50 mL离心管中加入15 mL密度梯度介质（密度 = 1.076 g/mL）。将TMCs溶液小心地加在密度梯度介质上方，注意尽量减少悬液与密度梯度介质之间的混合。
  2. 在室温下以1,000 × g 离心30分钟，加速度和刹车设置为关闭。
  3. 用10 mL移液器小心吸除并弃去上层液体（主要含1× PBS），注意不要扰动TMCs与密度梯度介质之间的界面。
    注意： TMCs中红细胞数量较少，因此溶液较为澄清，导致TMCs在PBS中的溶液与密度梯度介质之间的界面可能难以观察。因此，在进行密度梯度分离前，可将细胞重悬于补充有20 mM HEPES（不含FBS）的RPMI 1640培养基中。
  4. 用无菌的1 mL移液枪头吸取TMCs，并转移至新的50 mL离心管中。
  5. 加入含2%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA的PBS溶液至总体积50 mL，洗涤细胞，然后在4 °C下以250 × g 离心10分钟，以去除残留的血小板。
  6. 重复步骤3.5，但在4 °C下以400 × g 离心10分钟。
  7. 通过向RPMI 1640培养基中添加10%热灭活FBS、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素溶液（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），配制培养基（R10）。
  8. 将TMCs重悬于10 mL R10培养基中并计数细胞。通常情况下，每对扁桃体可获得5 × 108–2 × 109个TMCs。这些细胞现在可用于类似全血PBMC的实验研究（如特定细胞类型的纯化、细胞培养、流式细胞术、RT-qPCR、冻存等）。
  9. 如有需要，可采用原代细胞冻存的标准技术将细胞冻存以备后续使用。
    1. 计数细胞数量。
    2. 离心细胞并弃去上清液。将沉淀溶解于足量的100% FBS中，使终浓度为1 × 108 个细胞/mL，然后加入等体积的80% FBS + 20% DMSO溶液，最终细胞浓度为5 × 107 个细胞/mL。此步骤应在4 °C下进行，且FBS和DMSO溶液在使用前应保持在4 °C。
    3. 将1 mL细胞悬液分装至冻存管中，放入已在4 °C预冷过夜的程序降温盒中，以控制细胞冻存速率。随后置于-80 °C保存。
    4. 复苏细胞时，将冻存管置于37 °C水浴中轻轻摇动数秒，待细胞刚开始解冻时立即转移至49 mL R10培养基中，离心去除DMSO。计数细胞后即可按PBMC的方式使用。
      注意： 尽管冻存和复苏过程可去除部分碎片，但也可能损伤某些稀有细胞类型。若复苏后存在细胞团块或碎片，建议在使用前将细胞悬液通过无菌的70 µm细胞筛过滤。

4. 通过流式细胞术对TMCs进行表型分析

  1. 针对每个需要检测的抗体混合组，从之前的溶液中取出 5 × 106 个细胞，并置于 5 mL 流式管中。另取 1 × 106 个细胞用于未染色对照。
  2. 用 PBS 洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 500 µL PBS（1 × 106 个细胞/mL）中，并在 4 °C 避光孵育 30 分钟，加入活率染料进行染色。
  3. 每 100 µL 细胞悬液中加入 5 µL 热灭活人 AB 血清，在 4 °C 避光孵育 15 分钟。
  4. 用 PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA（洗涤缓冲液）洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。
  5. 将 TMCs 重悬于 500 µL 含有抗体的洗涤缓冲液中，具体抗体信息见表 1。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  6. 用洗涤缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。将 TMCs 重悬于 500 µL 含 0.5% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 中。避光保存于 4 °C，直至进行流式细胞术检测。
    注意：PFA 具有危害性。建议使用市售即用型溶液配制 0.5% PFA 溶液。
抗体克隆荧光染料公司
活/死细胞染色BV405ThermoFisher Scientific
CD3SP34-2V500BD Pharmingen
CD8SK1AmcyanBD Pharmingen
CD8BW135/80VioBlueMiltenyi Biotec
CD4RPA-T4PE-Cy7BD Pharmingen
CD45HI30PerCP-cy5.5BD
CD19HD237ECDBeckman Coulter
CD202H7Alexa Fluor 700BD Pharmingen
CD14M5E2PE-cy7BD Pharmingen
CD14M5E2APCBD Pharmingen
CD163G8APC-H7BD Pharmingen
CD56MEM188PEBD Pharmingen
CD1237G3PEBD Pharmingen
BDCA-1L161Pacific BlueBD Pharmingen
BDCA-3AD5-14H12FITCMiltenyi Biotec
BDCA-4AD5-17F6APCMiltenyi Biotec
HLA-DRG646-6PerCP-cy5.5BD Pharmingen
CD11c3.9Alexa Fluor 700ebiosciences

表1：通过流式细胞术进行细胞表征的抗体列表。

5. TMC 激活及细胞因子产生检测示例

  1. 用R10培养基稀释TMCs，使其浓度为2 × 106 个细胞/mL。
  2. 在96孔圆底培养板中，每孔加入200 µL R10培养基，含400,000个TMCs。
  3. 为激活细胞，加入终浓度为5 µg/mL的TLR7/8激动剂雷西莫特（R848），孵育过夜。
  4. 离心培养板，收集TMCs的上清液并冻存以备后续分析。采用基于微球的免疫检测法，按照试剂盒生产商的说明书，利用流式细胞仪同时定量多种可溶性细胞因子。
  5. 按照生产商的说明书，使用化学发光法细胞活力检测试剂盒评估细胞活力。简要步骤：每孔加入60 µL细胞活力检测溶液，10分钟内测定发光信号（每孔采集1秒）。

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结果

我们首先表征了培养物中存在细胞的免疫谱型，并分析了扁桃体单个核细胞（TMCs）的数量。我们采用流式细胞术对来自扁桃体的TMCs进行了表型分析。如图1所示，来自血液的外周血单个核细胞（PBMCs）中存在的所有主要免疫细胞类型在来自扁桃体的TMCs中均有存在。然而，在TMCs中，除B细胞外，所有细胞类型的频率均低于PBMCs中的频率。

流式细胞术分析示意图；TMCs设门策略；淋巴细胞分化；细胞类型百分比表格。
图1：扁桃体中TMCs的表型分析。 来自健康供体的TMCs通过人扁桃体组织解剖及细胞分离获得。（

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讨论

人类扁桃体代表了一种整合性且生理性的离体模型，可用于研究黏膜界面的固有免疫应答，因为其模拟了次级淋巴器官的功能。有趣的是，TMCs 的细胞组成与 PBMCs 相似，包含所有主要的细胞群体，尽管其细胞比例可能与外周血来源的 PBMCs 不同（图1）。此外，还可发现其他细胞群体，因为所有免疫应答均起始于组织（黏膜或次级淋巴器官）而非血液中。

使用人组织外植体、细胞培养或血细胞各有其优势。然而，在研究细胞因子分泌和细胞活化方面，组织外植体并非最佳模型。事实上，我们在组织外植体的上清液中未能检测到任何干扰素（IFN）的产生（图2B）。我们推测这些细胞因子可能被周围细胞直接消耗。另一方面，外周血单个核细胞（PBMCs）的刺激可模拟机体对感染的初始免疫应答，但无法反映组织内发生的免疫过程——而大多数细胞因子的产生以及病毒的复制均发生在组织中。因此，我们建立了一种从次级淋巴组织——扁桃体中分离和纯化细胞的实验方案。我们从健康人扁桃体中纯化了扁桃...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了法国艾滋病与肝炎研究署（ANRS）（J-P.H）对实验以及N.B.奖学金（AAP 2017 166）的资助。N.S.感谢ANRS对其奖学金（AAP 2016 1）的支持、欧洲分子生物学组织（EMBO）提供的奖学金（LT 834 2017）、乌尔姆大学医学院启动资金项目"Baustein"（LSBN.0147）以及德国研究基金会（DFG）（SM 544/1 1）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10目钢网 - 1910 µmDutscher198586用于放入Cellector细胞滤器
60目钢网 - 230 µmDutscher198591用于放入Cellector细胞滤器
70 µm 白色ClearLine细胞滤器Dutscher141379C
Anios Excell D 清洗剂Dutscher59852清洗剂
抗生素溶液，100倍浓缩液Thermo Fisher15140122100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素——用于添加至培养基中
BD FalconTM 圆底离心管，5 mLBD Biosciences352063FACS 管
Cellector细胞滤器，85 mL，直径37 mmDutscher198585
CellTiter-Glo (CTG) 发光法细胞活力检测试剂盒PromegaG7572细胞活力检测
Centrifuge 5810 R 离心机Eppendorf
Falcon 50 mL 锥形离心管Dutscher352070
弯头镊子Dutscher711200
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8537不含钙和镁
EnVisionPerkinElmer用于检测发光信号
胎牛血清（FBS）用于添加至培养基中
荧光标记抗体见表1
玻璃研磨棒Dutscher198599
Hepes（1 M）Thermo Fisher15630056使用浓度为20 mM
培养箱
LEGENDplex 人抗病毒反应检测试剂盒BioLegend740390基于微球的免疫检测试剂盒
LymphoprepStemCell7801密度梯度分离液
Mr. Frosty 冷冻容器Thermo Fisher5100-0001慢速冷冻容器
Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇Thermo Fisher28908
瑞喹莫德（R848）InvivoGentlrl-r848TLR7/8 激动剂
RPMI-1640 培养基Sigma-AldrichR8758
SPL 细胞培养皿，150 mm × 25 mm（SPL150）Dutscher330009
无菌外科刀片 N°23Dutscher132523
UltraComp eBeads 补偿微球Thermo Fisher01-2222-41
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher15575020用于配制PBS洗涤缓冲液

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