使用多层水凝胶生物墨水进行三维生物打印以实现均匀的细胞分布

摘要

本研究中，我们开发了一种新型的多层改性策略，用于低黏度类液体生物墨水（甲基丙烯酰化明胶），以防止包封细胞的沉降。

摘要

在基于挤出的三维生物打印过程中，低黏度的类液体生物墨水可保护细胞免受剪切应力引起的膜损伤，从而提高包封细胞的存活率。然而，储液器中细胞在重力作用下的快速沉降可能导致生物打印结构中的细胞分布不均，从而限制类液体生物墨水的应用。在此，我们开发了一种针对类液体生物墨水（例如低黏度的甲基丙烯酰化明胶）的新型多层改性策略，以防止包封细胞的沉降。通过在多层生物墨水中调控多个液体界面，实现界面滞留效应。因此，细胞在多层体系中穿越相邻层的沉降行为在生物墨水储液器中被显著延缓。研究发现，界面滞留力远高于细胞的沉降拉力，表明界面滞留效应在抑制细胞沉降、促进细胞在多层生物墨水中更均匀分散方面具有关键作用。

引言

三维（3D）生物打印已成为生物制造和再生医学领域中构建复杂结构和功能上类似天然组织的仿生组织的一种前景广阔的技术^1,2,3。常见的生物打印策略包括喷墨打印、挤出式打印和立体光刻打印，这些方法从不同角度来看各有优缺点⁴。在这些技术中，挤出式打印由于成本较低而被最广泛使用。生物墨水在挤出式生物打印的过程稳定性中起着关键作用。理想的含细胞生物墨水不仅应具备良好的生物相容性，还应具有适宜的机械性能⁵。低黏度的生物墨水通常呈液态，易于快速沉积，并可在挤出过程中避免因高剪切应力导致的细胞膜损伤。然而，在需要长时间打印的复杂情况下，低黏度常常会引起生物墨水储液池中包封细胞不可避免的沉降，这种沉降通常由重力驱动，导致细胞在生物墨水中分布不均^6,7。因此，细胞分散不均的生物墨水会阻碍功能性组织构建物的体外生物打印。

近期多项针对生物墨水的研究报道了封装细胞均一分散性的提升。一项研究采用基于双阶段交联的改性海藻酸盐生物墨水进行挤出式生物打印⁸。该研究中，海藻酸盐聚合物被肽段和蛋白质修饰。由于肽段和蛋白质提供了细胞黏附位点，细胞在此类改性海藻酸盐中的分布比在常规海藻酸盐中更为均一。此外，混合型生物墨水也被用于解决细胞在生物墨水中的沉降问题。另一项研究使用了一种包含聚乙二醇（PEG）与明胶或甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的混合生物墨水，其机械强度得到改善⁹。封装细胞呈现均一分布局的主要原因是混合生物墨水的黏度得以提高。总体而言，影响生物墨水中封装细胞分散性的因素包括生物墨水的黏度、细胞重力、细胞密度以及操作持续时间等。在这些因素中，细胞重力在促进沉降过程中起着关键作用。迄今为止，已有研究指出，黏性生物墨水所提供的浮力与摩擦力是抵抗重力的主要作用力¹⁰。

本文中，我们开发了一种新策略，通过调控生物墨水储液池中的多个液体界面，促进包封细胞在生物墨水中的均匀分散。这种通过多层修饰生物墨水形成的液体界面，不仅能够提供界面滞留作用，延缓细胞沉降，还能保持生物墨水适宜的生物相容性和流变行为。具体而言，我们对水相 GelMA 溶液（5%，w/v）采用蚕丝蛋白（SF）进行多层修饰，纵向形成四个界面，从而在混合生物墨水中产生界面张力。结果表明，人工引入的界面张力抵消了细胞所受的重力负荷，显著减少了细胞在相邻层间的沉降，实现了包封细胞在生物墨水中近乎均匀的分散。迄今为止，尚未见通过调控液态生物墨水中的界面滞留以减缓包封细胞沉降的类似报道。本文所呈现的方案展示了一种解决生物打印中细胞沉降问题的新方法。

方案

1. 含细胞丝素蛋白-甲基丙烯酰胺（SF-GelMA）的制备

1. 使用 0.22 μm 注射器滤器对所有材料进行灭菌处理。所有步骤均须在生物安全柜中进行。
2. 将 1× PBS 加热至 50 °C，并在搅拌条件下将其加热溶解明胶。PBS 中明胶的终浓度应为 10%（w/v）。
3. 在搅拌条件下缓慢将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中（甲基丙烯酸酐与明胶的质量比为 0.6:1），并在 50 °C 下混合至少 1 小时。通常，使用 12 g 甲基丙烯酸酐制备 200 mL 的 10% 明胶溶液；具体体积可根据实验需求调整。
4. 将含有明胶和甲基丙烯酸酐的混合溶液转移至 50 mL 无菌离心管中。
5. 在 3,500 × g 条件下离心混合溶液，通常需 3–5 分钟形成两层。收集上层（GelMA），弃去下层（未反应的甲基丙烯酸酐）。
6. 用两倍体积的去离子水（40–50 °C）稀释步骤 1.5 中获得的上层溶液。
7. 使用截留分子量为 12–14 kDa 的透析膜，在去离子水中对步骤 1.6 所得溶液进行透析，持续 5–7 天（40–50 °C），每天换水两次。
8. 收集透析后的 GelMA 溶液，并于 −80 °C 冷冻过夜。
9. 将 GelMA 溶液置于冷冻干燥机中，在温度 -45 °C、压力 0.2 mbar 条件下冻干 3–5 天。
10. 将冻干后的 GelMA（取代度约为 75%）溶解于含 10% FBS（胎牛血清，v/v）、25 mM HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸）和光引发剂（0.5%，w/v）的 1× PBS 中，制备 GelMA 生物墨水。
    注：GelMA 的取代度可通过茚三酮法测定³。
11. 将 GelMA 溶液（10%，w/v）与不同体积的初始丝素蛋白（SF）溶液（5%，w/v）及不同体积的 1× PBS 混合，制备含不同 SF 浓度的 SF-GelMA 生物墨水。不同生物墨水中每 1 mL GelMA 与 SF 溶液的比例见表 1。
    注：所有生物墨水的 GelMA 终浓度必须为 5%（w/v），而 SF 浓度在不同 SF-GelMA 生物墨水中分别为 0.5、0.75、1.0、1.25 和 1.5%（w/v）。使用 SF-M-Layered-GelMA 表示以逐层方式修饰 SF 的 GelMA 生物墨水；使用 SF-X-GelMA 表示以均相方式修饰 SF 的 GelMA（例如，含 1% SF 修饰的 GelMA 称为 SF-1-GelMA）。
12. 对所有生物墨水进行 10–20 分钟的超声处理。
13. 在含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）中培养 NIH3T3 细胞，培养条件为 37 °C、5% CO₂ 的培养箱。当细胞密度达到 80% 时，按 1:3 比例传代。
14. 将 NIH3T3 细胞悬液在 1500 rpm 条件下离心 5 分钟，吸除上清液，并在 15 mL 无菌离心管中用新鲜生物墨水溶液重悬细胞沉淀。
    注：生物墨水中包封细胞的浓度应为 1 × 10⁶ 个细胞/mL，需使用细胞计数仪计算细胞浓度。
15. 使用 2 mL 不同的 SF-GelMA 生物墨水重悬细胞沉淀，获得多种含细胞的生物墨水。

2. SF-M-分层-GelMA 的装载、重新加热与生物打印

1. 将0.4 mL含细胞的SF-0.5-GelMA加入注射器的底层。
   注意：本研究中使用2 mL注射器作为生物墨水储液器。以逐层方式将不同的SF-GelMA生物墨水加载到注射器中。
2. 将注射器置于冰水浴（0 °C）中5分钟，使底层生物墨水转变为凝胶状态。
3. 在底层上方加入0.4 mL含细胞的SF-0.75-GelMA生物墨水。
4. 将含有两层生物墨水的注射器置于冰水浴（0 °C）中5分钟，使两层生物墨水均转变为凝胶状态。
5. 对剩余的三种生物墨水（SF-1-GelMA、SF-1.25-GelMA、SF-1.5-GelMA）重复上述加载和冷却步骤共3次，从而获得在不同层中含有不同SF浓度的多层生物墨水体系。每次加载所有生物墨水的体积均为0.4 mL。
6. 在进行生物打印前，将多层生物墨水体系置于培养箱（37 °C）中加热30分钟，使其重新熔化。
7. 使用装有27 G打印喷嘴的2 mL注射器作为生物墨水储液器。设定流速为50 μL/min，喷嘴移动速度为2 mm/s，喷嘴高度为1 mm。在室温（约20 °C）下进行生物打印操作。
   1. 使用定制的生物打印机，根据我们先前研究^11,12优化的参数，通过挤出方式打印组织构建体。
8. 使用紫外光（365 nm，800 mW）照射40秒，对打印后的组织构建体进行交联。
9. 将交联后的组织构建体置于含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中，在培养箱（37 °C，5% CO₂）中培养。前两天每8小时更换一次培养基，之后每2–3天更换一次。

结果

含细胞生物墨水制备的示意图如下所示 图1不同生物墨水制备完成后，依次进行装载、重新加热和生物打印（图2）。为了评估包封细胞在生物墨水储液池中的分布情况，使用三种含细胞的生物墨水在三个96孔板中进行了生物打印操作（图3A）。采用两个对照组（原始 GelMA 和 SF-1-GelMA 生物墨水）和一个实验组（SF-M-Layered-GelMA 生物墨水）来研究包封细胞的分散性（图3B。每孔加入60微升含细胞的生物墨水，共使用三块96孔板。三种生物墨水的总体积为2 mL，因此生物打印过程持续超过30分钟。加上打印前额外的孵育时间（30分钟），总操作时间超过1小时，被认为适合用于大尺寸组织和器官的生物制造。目标孔中的细胞数量，标记于 图3A在三个孔板中对细胞数量进行了计数。不同孔中细胞的计数结果可反映包封细胞在各组之间的分布情况。结果显示，随着生物...

讨论

多层体系的稳定性是成功实施本方案的关键。我们基于Nauman的研究¹³，理论计算了丝素蛋白（SF）分子在GelMA溶液中的扩散情况。研究发现，蛋白质在溶液中的扩散与其分子量相关。牛血清白蛋白（BSA）的平均分子量（MW）为66.5 kDa，其扩散系数为64–72 μm²/s；纤维蛋白原的平均分子量为339.7 kDa，其扩散系数为23–34 μm²/s。本研究中SF分子的平均分子量约为100 kDa。根据Nauman研究的结果，在25 °C的水中，单个SF分子的扩散系数介于23–72 μm²/s之间。依据斯托克斯-爱因斯坦方程（Stokes–Einstein equation），扩散系数定义如下：

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮（PI2959）	TCI	M64BK-QD
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Gibco	15630080
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基	Gibco	10569044
胎牛血清（FBS）	Gibco	10091
明胶	Sigma-Aldrich	V900863MSDS
甲基丙烯酸酐（MA）	Sigma-Aldrich	276685MSDS
青霉素–链霉素类抗生素	Gibco	15140163
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010049
丝素蛋白	Advanced BioMatrix	5154