本研究中，我们开发了一种新型的多层改性策略，用于低黏度类液体生物墨水（甲基丙烯酰化明胶），以防止包封细胞发生沉降。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在基于挤出的三维生物打印过程中，低黏度的类液体生物墨水可保护细胞免受剪切应力引起的膜损伤，从而提高包封细胞的存活率。然而，储液器中细胞在重力作用下的快速沉降可能导致生物打印结构中的细胞分布不均，从而限制类液体生物墨水的应用。在此，我们开发了一种针对类液体生物墨水（例如低黏度的甲基丙烯酰化明胶）的新型多层改性策略，以防止包封细胞的沉降。通过在多层生物墨水中调控多个液体界面，实现界面滞留效应。因此，在多层系统中，细胞跨越相邻层的沉降行为在生物墨水储液器中被显著延缓。研究发现，界面滞留力远高于细胞的沉降拉力，表明界面滞留效应在抑制细胞沉降、促进细胞在多层生物墨水中更均匀分散方面具有关键作用。
引言
三维（3D）生物打印已成为生物制造和再生医学领域中构建复杂结构和功能上模拟天然组织的有前景方法1,2,3。常见的生物打印策略包括喷墨打印、挤出式打印和立体光刻打印，这些方法从不同角度各有优缺点4。在这些技术中，挤出式打印因成本效益高而应用最为广泛。生物墨水在挤出式生物打印的过程稳定性中起着关键作用。理想的含细胞生物墨水不仅应具备良好的生物相容性，还应具有适宜的力学性能5。低黏度的生物墨水通常呈液态，易于快速沉积，并可在挤出过程中避免因高剪切应力导致的细胞膜损伤。然而，在需要长时间打印的复杂情况下，低黏度常导致生物墨水储液装置中包封细胞不可避免地发生沉降，这种沉降通常由重力驱动，进而引起生物墨水中细胞分布不均6,7。因此，细胞分散不均的生物墨水会阻碍功能性组织构建物的体外生物打印。
近期多项针对生物墨水的研究报道了封装细胞均一分散性的提升。一项研究采用基于双阶段交联的改性海藻酸盐生物墨水进行挤出式生物打印8。该研究中，海藻酸盐聚合物被肽和蛋白质修饰。由于肽和蛋白质提供了细胞黏附位点，细胞在此改性海藻酸盐中的分布比在常规使用的海藻酸盐中更为均一。另一种策略是使用混合型生物墨水以解决细胞在生物墨水中的沉降问题。另一项研究使用了一种包含聚乙二醇（PEG）与明胶或甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的混合生物墨水，其机械强度得到改善9。封装细胞呈现均一分布局的主要原因是混合生物墨水的黏度得以提高。总体而言，影响生物墨水中封装细胞分散性的因素包括生物墨水的黏度、细胞的重力、细胞密度以及操作持续时间等。在这些因素中，细胞重力在促进沉降过程中起着关键作用。迄今为止，已有研究指出，黏性生物墨水所提供的浮力和摩擦力是抵抗重力的主要作用力10。
本文中，我们开发了一种新策略，通过调控生物墨水储液池中的多个液体界面，促进包封细胞在生物墨水中的均匀分散。这种通过多层修饰生物墨水形成的液体界面，不仅能够提供界面滞留作用，延缓细胞沉降，还能保持生物墨水适宜的生物相容性和流变行为。具体而言，我们对水相 GelMA 溶液（5%，w/v）采用蚕丝蛋白（SF）进行多层修饰，纵向形成四个界面，从而在混合生物墨水中产生界面张力。结果表明，人工界面张力抵消了细胞所受的重力负荷，显著减少了细胞在相邻层间的沉降，实现了包封细胞在生物墨水中近乎均匀的分散。迄今为止，尚未见通过调控液态生物墨水中的界面滞留来减缓细胞沉降的类似报道。本文所呈现的方案展示了一种解决生物打印中细胞沉降问题的新方法。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 含细胞丝素蛋白-甲基丙烯酰胺（SF-GelMA）的制备
- 使用 0.22 μm 注射器滤器对所有材料进行灭菌处理。所有操作均须在生物安全柜中进行。
- 将 1× PBS 加热至 50 °C，并在搅拌条件下将明胶溶解于加热的 1× PBS 中。明胶在 PBS 中的终浓度应为 10%（w/v）。
- 在搅拌条件下，缓慢将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中（甲基丙烯酸酐与明胶的质量比为 0.6:1），并在 50 °C 下混合至少 1 小时。通常，使用 12 g 甲基丙烯酸酐制备 200 mL 的 10% 明胶溶液；具体体积可根据实验需求调整。
- 将含有明胶和甲基丙烯酸酐的混合溶液转移至 50 mL 无菌离心管中。
- 在 3,500 × g 条件下离心该混合溶液，通常需 3–5 分钟形成两层。收集上层液体（GelMA），弃去下层（未反应的甲基丙烯酸酐）。
- 用两倍体积的去离子水（40–50 °C）稀释第 1.5 步获得的上层溶液。
- 使用截留分子量为 12–14 kDa 的透析膜，在去离子水中对第 1.6 步所得溶液进行透析，持续 5–7 天（40–50 °C），每天换水两次。
- 将透析后的 GelMA 溶液收集并置于 −80 °C 冷冻过夜。
- 将 GelMA 溶液在冷冻干燥机中冻干 3–5 天，设定温度为 -45 °C，压力为 0.2 mbar。
- 将冻干的 GelMA（取代度约为 75%）溶解于含 10% FBS（胎牛血清，v/v）、25 mM HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸）和光引发剂（0.5%，w/v）的 1× PBS 中，制备 GelMA 生物墨水。
注：GelMA 的取代度可通过茚三酮法测定3。 - 将 GelMA 溶液（10%，w/v）与不同体积的初始丝素蛋白（SF）溶液（5%，w/v）以及不同体积的 1× PBS 混合，以制备不同 SF 浓度的 SF-GelMA 生物墨水。不同生物墨水中每 1 mL GelMA 与 SF 溶液的比例见表 1。
注：所有生物墨水的 GelMA 终浓度必须为 5%（w/v），而 SF 浓度则分别为：0.5、0.75、1.0、1.25 和 1.5%（w/v）。将采用逐层方式修饰 GelMA 的生物墨水命名为 SF-M-Layered-GelMA；将采用均相方式修饰 GelMA 的生物墨水命名为 SF-X-GelMA（例如，经 1% SF 修饰的 GelMA 命名为 SF-1-GelMA）。 - 对所有生物墨水进行 10–20 分钟的超声处理。
- 在含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）中培养 NIH3T3 细胞，培养箱条件为 37 °C、5% CO2。当细胞密度达到 80% 时，按 1:3 比例传代。
- 将 NIH3T3 细胞悬液在 1500 rpm 下离心 5 分钟。吸除上清液，并在 15 mL 无菌离心管中用新鲜生物墨水溶液重悬细胞沉淀。
注：生物墨水中包封细胞的浓度应为 1 × 106 个细胞/mL，需使用细胞计数仪进行浓度计算。 - 使用 2 mL 不同类型的 SF-GelMA 生物墨水重悬细胞沉淀，以获得多种含细胞的生物墨水。
2. SF-M-分层-GelMA 的装载、重新加热与生物打印
- 将0.4 mL含细胞的SF-0.5-GelMA加入注射器的底层。
注意：本研究中使用2 mL注射器作为生物墨水储液器。以逐层方式将不同的SF-GelMA生物墨水装入注射器中。 - 将注射器置于冰水浴（0 °C）中5分钟，使底层生物墨水转变为凝胶状态。
- 在底层上方加入0.4 mL含细胞的SF-0.75-GelMA生物墨水。
- 将含有两层生物墨水的注射器置于冰水浴（0 °C）中5分钟，使两层生物墨水均转变为凝胶状态。
- 对剩余的三种生物墨水（SF-1-GelMA、SF-1.25-GelMA、SF-1.5-GelMA）重复上述加载和冷却步骤共3次，以获得在不同层中含有不同浓度丝素蛋白（SF）的多层生物墨水系统。每次加载所有生物墨水的体积均为0.4 mL。
- 在进行生物打印前，将多层生物墨水置于培养箱（37 °C）中加热30分钟以使其重新融化。
- 使用带有27 G打印喷嘴的2 mL注射器作为生物墨水储液器。设定流速为50 μL/min，喷嘴移动速度为2 mm/s，喷嘴高度为1 mm。在室温（约20 °C）下进行生物打印操作。
- 使用自行研制的生物打印机，按照我们先前研究中优化的参数11,12，通过挤出方式打印组织构建体。
- 使用紫外光（365 nm，800 mW）照射40秒，对打印后的组织构建体进行交联。
- 将交联后的组织构建体置于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中，在培养箱（37 °C，5% CO2）中培养。前两天每8小时更换一次培养基，之后每2–3天更换一次。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
含细胞生物墨水制备示意图如图所示 图1在制备不同生物墨水后，进行装载、重新加热和生物打印（图2）。为了评估包封细胞在生物墨水储液槽中的分布情况，使用三种不同的含细胞生物墨水在三个96孔板中进行了生物打印操作（图3A）。采用两个对照组（原始 GelMA 和 SF-1-GelMA 生物墨水）和一个实验组（SF-M-Layered-GelMA 生物墨水）来研究包封细胞的分散性（图3B）。在三个96孔板的每个孔中挤出60 μL含细胞的生物墨水。三种生物墨水的总体积为2 mL，因此生物打印过程耗时超过30分钟。加上打印前额外的孵育时间（30分钟），总操作时间超过1小时，被认为适合用于打印大尺寸组织和器官。目标孔中的细胞数量，如标记所示，在 图 3A在三个培养板中的细胞数量进行了计数。不同孔中细胞的计数值可反映各组间包封细胞分布的均匀性。结果显示，随着生...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
多层体系的稳定性是成功实施本方案的关键。我们基于Nauman的研究13，从理论上计算了丝素蛋白（SF）分子在 GelMA 溶液中的扩散情况。研究发现，蛋白质在溶液中的扩散与其分子量相关。牛血清白蛋白（BSA）的平均分子量（MW）为66.5 kDa，其扩散系数为64–72 μm2/s；纤维蛋白原的平均分子量为339.7 kDa，其扩散系数为23–34 μm2/s。本研究中SF分子的平均分子量约为100 kDa。根据Nauman研究的结果，在25 °C的水中，单个SF分子的扩散系数介于23–72 μm2/s之间。依据斯托克斯-爱因斯坦方程（Stokes–Einstein equation），扩散系数定义如下：
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（81771971、81970442、81703470 和 81570422）以及国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2018YFC1005002）、上海市科学技术委员会（17JC1400200）、上海市重大科技项目（项目编号：2017SHZDZX01）以及上海市教育委员会（创新计划 2017-01-07-00-07-E00027）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（PI2959） | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES） | Gibco | 15630080 | |
| 杜尔贝科’改良型伊格尔’DMEM培养基 | Gibco | 10569044 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10091 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| 甲基丙烯酸酐（MA） | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| 青霉素–链霉素类抗生素 | Gibco | 15140163 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010049 | |
| 丝素蛋白 | Advanced BioMatrix | 5154 |
参考文献
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510(2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
