本研究中，我们开发了一种新型的多层改性策略，用于低黏度类液体生物墨水（甲基丙烯酰化明胶），以防止包封细胞发生沉降。
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本文内容
摘要
摘要
在基于挤出的三维生物打印过程中，低黏度的类液体生物墨水可保护细胞免受剪切应力引起的膜损伤，从而提高包封细胞的存活率。然而，储液器中细胞在重力作用下的快速沉降可能导致生物打印结构中的细胞分布不均，从而限制类液体生物墨水的应用。在此，我们开发了一种针对类液体生物墨水（例如低黏度的甲基丙烯酰化明胶）的新型多层改性策略，以防止包封细胞的沉降。通过在多层生物墨水中调控多个液体界面，实现界面滞留效应。因此，在多层系统中，细胞跨越相邻层的沉降行为在生物墨水储液器中被显著延缓。研究发现，界面滞留力远高于细胞的沉降拉力，表明界面滞留效应在抑制细胞沉降、促进细胞在多层生物墨水中更均匀分散方面具有关键作用。
引言
三维（3D）生物打印已成为生物制造和再生医学领域中构建复杂结构和功能上模拟天然组织的有前景方法1,2,3。常见的生物打印策略包括喷墨打印、挤出式打印和立体光刻打印，这些方法从不同角度各有优缺点4。在这些技术中，挤出式打印因成本效益高而应用最为广泛。生物墨水在挤出式生物打印的过程稳定性中起着关键作用。理想的含细胞生物墨水不仅应具备良好的生物相容性，还应具有适宜的力学性能5。低黏度的生物墨水通常呈液态，易于快速沉积，并可在挤出过程中避免因高剪切应力导致的细胞膜损伤。然而，在需要长时间打印的复杂情况下，低黏度常导致生物墨水储液装置中包封细胞不可避免地发生沉降，这种沉降通常由重力驱动，进而引起生物墨水中细胞分布不均6,7。因此，细胞分散不均的生物墨水会阻碍功能性组织构建物的体外生物打印。
近期多项针对生物墨水的研究报道了封装细胞均一分散性的提升。一项研究采用基于双阶段交联的改性海藻酸盐生物墨水进行挤出式生物打印8。该研究中，海藻酸盐聚合物被肽....
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方案
1. 含细胞丝素蛋白-甲基丙烯酰胺（SF-GelMA）的制备
- 使用 0.22 μm 注射器滤器对所有材料进行灭菌处理。所有操作均须在生物安全柜中进行。
- 将 1× PBS 加热至 50 °C，并在搅拌条件下将明胶溶解于加热的 1× PBS 中。明胶在 PBS 中的终浓度应为 10%（w/v）。
- 在搅拌条件下，缓慢将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中（甲基丙烯酸酐与明胶的质量比为 0.6:1），并在 50 °C 下混合至少 1 小时。通常，使用 12 g 甲基丙烯酸酐制备 200 mL 的 10% 明胶溶液；具体体积可根据实验需求调整。
- 将含有明胶和甲基丙烯酸酐的混合溶液转移至 50 mL 无菌离心管中。
- 在 3,500 × g 条件下离心该混合溶液，通常需 3–5 分钟形成两层。收集上层液体（GelMA），弃去下层（未反应的甲基丙烯酸酐）。
- 用两倍体积的去离子水（40–50 °C）稀释第 1.5 步获得的上层溶液。
- 使用截留分子量为 12–14 kDa 的透析膜，在去离子水中对第 1.6 步所得溶液进行透析，持续 5–7 天（40–50 °C），每天换水两次。
- 将透析后的 GelMA 溶液收集并置于 −80 °C 冷冻过夜。
- 将 GelMA 溶液在冷冻干燥机中冻干 3–5 天，设定温度为 -45 °C，压力为 0.2 mbar。 ....
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结果
含细胞生物墨水制备示意图如图所示 图1在制备不同生物墨水后，进行装载、重新加热和生物打印（图2）。为了评估包封细胞在生物墨水储液槽中的分布情况，使用三种不同的含细胞生物墨水在三个96孔板中进行了生物打印操作（图3A）。采用两个对照组（原始 GelMA 和 SF-1-GelMA 生物墨水）和一个实验组（SF-M-Layered-GelMA 生物墨水）来研究包封细胞的分散性（图3B）。在三个96孔板的每个孔中挤出60 μL含细胞的生物墨水。三种生物墨水的总体积为2 mL，因此生物打印过程耗时超过30分钟。加上打印前额外的孵育时间（30分钟），总操作时间超过1小时，被认为适合用于打印大尺寸组织和器官。目标孔中的细胞数量，如标记所示，在 图 3A在三个培养板中的细胞数量进行了计数。不同孔中细胞的计数值可反映各组间包封细胞分布的均匀性。结果显示，随着生.......
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讨论
多层体系的稳定性是成功实施本方案的关键。我们基于Nauman的研究13，从理论上计算了丝素蛋白（SF）分子在 GelMA 溶液中的扩散情况。研究发现，蛋白质在溶液中的扩散与其分子量相关。牛血清白蛋白（BSA）的平均分子量（MW）为66.5 kDa，其扩散系数为64–72 μm2/s；纤维蛋白原的平均分子量为339.7 kDa，其扩散系数为23–34 μm2/s。本研究中SF分子的平均分子量约为100 kDa。根据Nauman研究的结果，在25 °C的水中，单个SF分子的扩散系数介于23–72 μm2/s之间。依据斯托克斯-爱因斯坦方程（Stokes–Einstein equation），扩散系数定义如下：
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（81771971、81970442、81703470 和 81570422）以及国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2018YFC1005002）、上海市科学技术委员会（17JC1400200）、上海市重大科技项目（项目编号：2017SHZDZX01）以及上海市教育委员会（创新计划 2017-01-07-00-07-E00027）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（PI2959） | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES） | Gibco | 15630080 | |
| 杜尔贝科’改良型伊格尔’DMEM培养基 | Gibco | 10569044 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10091 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| 甲基丙烯酸酐（MA） | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| 青霉素–链霉素类抗生素 | Gibco | 15140163 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010049 | |
| 丝素蛋白 | Advanced BioMatrix | 5154 |
参考文献
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510(2019).
- Daniela, L., et al.
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重印与许可
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