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从固定心脏中分离心肌细胞用于免疫细胞化学和倍性分析

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DOI：

10.3791/60938

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2020年10月7日

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1Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 2Lillehei Heart Institute, Department of Medicine, University of Minnesota, 3Stem Cell Institute, University of Minnesota

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究的目的是建立一种可重复地从成年心脏中分离心肌细胞并测量其DNA含量和核化程度的方法。

摘要

成年哺乳动物心脏由多种细胞类型组成，包括心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。由于在组织学切片上可靠地鉴定心肌细胞核较为困难，许多研究团队依赖于在固定前分离出有活性的心肌细胞，以进行免疫染色。然而，这些活心肌细胞分离技术需要优化，以最大限度地提高样本的得率、存活率和质量，即使经过最大程度的优化，样本间仍存在固有的波动。本文报道了一种可重复的实验方案，该方案在心脏进行酶消化前先实施固定，可在保持单个心肌细胞体内形态的同时实现最大得率。我们进一步开发了一个自动化分析平台，用于测定单个心肌细胞的细胞核数量及每个细胞核的DNA含量。在暴露胸腔后，通过向心脏灌注含60 mM KCl的PBS溶液使其停搏于舒张期。随后，将心脏置于4%多聚甲醛（PFA）溶液中固定，再用60 mg/mL胶原酶溶液进行消化。消化完成后，通过吹打使细胞分散为单细胞悬液，并利用差速离心法富集心肌细胞组分。分离得到的心肌细胞经肌钙蛋白T（Troponin T）和α-肌动蛋白（α-actinin）染色以评估细胞群体的纯度。此外，我们开发了图像分析平台，在DAPI染色后用于确定心肌细胞的核型状态和倍性水平。基于图像的倍性分析获得了稳定且可重复的结果。因此，该实验方案能够在获得最大得率的同时，保持单个心肌细胞的天然形态，从而支持免疫细胞化学染色和DNA含量分析。

引言

几十年来，心脏病一直是大多数西方国家的主要死因1,2。尽管心血管疾病治疗手段已取得诸多进展，显著提高了患者生存率，但目前尚无任何疗法能够替代丢失的心肌细胞。因此，与心肌细胞功能、增殖、凋亡和肥大相关的研究一直是科学界关注的重点，并将持续受到重视。由于成年哺乳动物心脏的再生能力极为有限，心肌细胞的年更新率估计不足1%，因此准确识别心肌细胞增殖事件至关重要3,4。目前大多数检测增殖事件的策略依赖于对掺入的DNA核苷酸类似物进行染色，以评估既往或当前的增殖活性，或对活跃增殖相关的核标志物进行染色5。由于增殖的心肌细胞总体数量极低，准确识别心肌细胞增殖事件显得尤为重要3,6。例如，基于内源性心肌细胞每年约1%的更新率，可在任意时间点于成年小鼠心脏中发现约25至50个处于增殖状态的心肌细胞7,8。任何对心肌细胞核识别的不准确都可能导致假阳性结果。因此，准确识别心肌细胞核极为关键，但在组织切片中实现这一目标已被证明困难且不可靠9。相较于组织切片，单细胞水平的心肌细胞鉴定更为准确，因为在组织切片中即使使用α-actinin等标志物也难以将心肌细胞与其他细胞类型区分开来，尽管PCM1可能作为组织切片中心肌细胞核的可靠标志物10。

目前的方案依赖于在固定前分离活的心肌细胞，这一过程已知会导致至少30%的心肌细胞死亡，且可能无意中选择特定的心肌细胞亚群11。此外，这些方案以难以优化而著称，难以获得可重复的结果。即使经过优化的分离技术，通常也只能获得不超过65%的存活率，且呈杆状形态的心肌细胞产量存在差异12。

为解决这些问题，我们开发了一种可分离固定心肌细胞的实验方案。由于样品在分离前已预先固定，因此细胞得率最大化，且体内形态得以良好保存。此外，利用该方案还可从临床样本中分离心肌细胞，这类样本通常在获取后立即固定。进一步地，为了鉴定新生成的心肌细胞，测量单个心肌细胞的核数量和倍性状态至关重要，因为通常认为只有二倍体心肌细胞才是新形成的。流式细胞术无法区分多核性与多倍性，且该方法相对耗时耗材。通过图像手动勾画并测量细胞核的方法通量极低，且易受人为偏差影响。而对固定后分离的DAPI染色心肌细胞图像进行自动化定量分析，可同时解决上述两个问题。利用基础设备即可快速、节省试剂地获得基于成像的核数量和倍性分布数据。

方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）指南进行，并经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 溶液和手术器械的准备

  1. 分离前，使用70%乙醇溶液对手术器械进行灭菌。
  2. 将2.24 g氯化钾（KCl）加入500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为60 mM的KCl-PBS溶液。将KCl-PBS溶液置于室温保存。每只小鼠使用3 mL KCl-PBS溶液。
  3. 用PBS稀释32%的多聚甲醛（PFA）溶液，得到终浓度为4%的PFA溶液。每只小鼠准备10 mL 4% PFA PBS溶液。稀释后的PFA溶液可保存在玻璃容器中，于4 °C保存2-3周。
    注意：配制好的4% PFA溶液可在-20 °C长期保存。
  4. 通过将60 mg II型胶原酶溶于1 mL PBS中，为每只小鼠配制1 mL胶原酶溶液。

2. 心脏的灌注与固定

  1. 使用2-5%异氟烷（氧气流速为1 L/min）对动物进行麻醉。通过观察动物是否无活动及呼吸频率降低来确认麻醉效果。
    注意：在处死动物前注射肝素（100-500 U/kg）可防止血液凝固，从而提高固定液对心脏的灌注效率，有助于提升细胞质量和得率。
  2. 根据批准的方法对动物实施安乐死。
    注意：本研究遵循美国兽医协会（AVMA）关于动物安乐死的指南，并已获得本单位IACUC对安乐死程序的批准。
  3. 将已处死的动物置于仰卧位，并用胶带固定四肢使其伸展。
  4. 使用钝头剪刀剪开胸部以暴露心脏，剪断降主动脉和下腔静脉。
  5. 通过左心室注入3 mL KCl-PBS溶液进行心脏灌注，使用连接输液套件和23 G蝶形针头（新生动物使用26 G）的蠕动泵控制流速为3 mL/min。注意避免穿破室间隔。
    注意：也可使用连接注射器的针头手动注入溶液。
  6. 使用蠕动泵以1 mL/min的流速灌注10 mL 4%多聚甲醛（PFA）溶液，持续10分钟，完成心脏固定。
  7. 用剪刀取出完整心脏。取出后可根据需要切开分离心脏特定区域。将整个心脏或其部分组织放入含有1 mL 4% PFA溶液的1.5 mL微量离心管中。在室温下置于摇床上，以20–30 rpm的振荡速度孵育1小时。

3. 固定心肌细胞的分离

  1. 将心脏放入含有 PBS 溶液的培养皿中。挤压心脏以去除心室内残留的 PFA，并用 PBS 清洗。
  2. 将固定后的心脏放入含有胶原酶溶液（60 mg/mL）的新 1.5 mL 微离心管中。将管子置于摇床上（20–30 rpm），在 37 °C 下过夜孵育。
    注意：如果预期心脏组织存在纤维化，可能需要更长时间的胶原酶消化以降解细胞外胶原，此时可将孵育时间延长至最多 1 周，并每两天更换一次胶原酶溶液，以减少产量的可能波动。
  3. 将胶原酶溶液和心脏转移至 35 mm 培养皿中。使用镊子或剪刀将心脏组织剪切成约 1 mm 的小块。
  4. 使用移液管进一步吹打离散的组织约 2 分钟。如果培养皿中仍有组织颗粒残留，可换用开口更窄的移液管继续吹打，直至大部分组织被充分解离。
    注意：过度吹打会导致单个心肌细胞破裂。应定期在显微镜下检查，避免过度吹打。
  5. 将 200–600 µm 尼龙筛网置于 15 mL 离心管管口上方。
    注意：对于肥大的心肌细胞，建议使用 400 µm 尼龙筛网而非 200 µm。
  6. 向含有离散细胞的培养皿中加入 5 mL PBS，并将溶液连同组织颗粒一起通过尼龙筛网过滤。再用额外的 4 mL PBS 冲洗筛网，以充分回收细胞。
  7. 将过滤后的溶液在 10–100 × g 条件下离心 1 分钟。
    注意：100 × g 离心不能获得 100% 纯的心肌细胞群体，部分非心肌细胞仍可能被保留。
  8. 若无需同时染色或评估非心肌细胞，则弃去上清液。将沉淀物重悬于 10 mL PBS 中，用于后续染色。

4. 心肌细胞染色

  1. 以 100 × g 离心 1 分钟收集细胞，并加入 5 mL 通透化溶液（例如含 0.5% Triton X-100 的 PBS）。在室温下于摇床上孵育 20 分钟。
    注意：步骤 4.1、4.2 和 4.4 建议使用 15 mL 离心管，相比 1.5 mL 微量离心管更易于去除上清液而不扰动细胞沉淀。
  2. 以 100 × g 离心 1 分钟收集细胞，加入 5 mL 封闭缓冲液（例如含 3% 牛血清白蛋白 [BSA] 的 PBS），在室温下于摇床上孵育 30 分钟。
  3. 以 100 × g 离心 1 分钟收集细胞，加入 1 mL 含适当稀释比例的一抗溶液（溶于 PBS 中）。将溶液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在优化条件下（例如 4 °C 过夜）孵育心肌细胞。
  4. 将含一抗溶液的心肌细胞转移至 15 mL 离心管中，加入 9 mL PBS。在室温下于摇床上孵育心肌细胞 10 分钟。
  5. 以 100 × g 离心 1 分钟收集细胞，加入 10 mL PBS。在室温下于摇床上孵育心肌细胞 10 分钟。重复此步骤一次。
  6. 以 100 × g 离心 1 分钟收集细胞，加入含 DAPI 的二抗溶液。在室温下于摇床上孵育 30 分钟，随后重复步骤 4.5 两次以洗涤心肌细胞。
  7. 将细胞置于盖玻片或显微镜兼容板上，进行成像。
    注意：文中所含图像使用 10× 和 40× 物镜拍摄。所用激光波长分别为：DAPI 使用 405 nm，Alpha actinin 使用 561 nm，Edu 使用 640 nm。

5. 设置成像软件

注意：请结合补充文件1-SoftwareScreenshots.pdf中的步骤进行操作。

  1. 下载 ImageJ 的 Fiji 发行版。
  2. 打开 Fiji，点击 帮助 > 更新… > 管理更新站点，勾选“IJPB-plugins”和“Biomedgroup”更新站点，以下载依赖插件 Ellipse Split 和 Morpholibj。
  3. 点击 关闭，Fiji 将开始下载依赖项。下载完成后重启 Fiji。
  4. 下载 Rstudio 并打开。
  5. 将 install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) 复制到 R 控制台的命令行中，然后按 Enter 键。对所有提示输入“y”以安装所有 R 依赖包（见 补充文件 1 中的截图 1）。

6. 图像定量分析

  1. 打开 Fiji 并拖拽 "AnalyzeNucleation.py" （作为补充代码文件提供）输入 Fiji 的状态栏。这将打开一个脚本编辑窗口。点击 运行 左下角开始（图2） 补充文件 1).
  2. 一个对话框将弹出（补充文件 1：截图3），要求指定输出数据目录的位置。所有分析数据、图像以及其他由该软件使用的数据将存储在此文件夹中。随后将弹出另一个较大的对话框，显示所有图像分析设置补充文件 1：图4截图。
    1. 选择包含待分析图像的目录位置。
    2. 使用正则表达式输入图像文件名格式。请根据文件名中行、列、通道以及（可选）位点所对应的部分，用大括号标注，并使用正则表达式表示。大括号内不得包含空格。将文件名格式中的变量部分用大括号 {} 括起。文件的保存方式取决于成像软件，此步骤将从图像文件名中提取相关信息。
      注意：例如，格式字符串
      r" 平板 1-(?P<行>[A-Za-z]+)(?P<柱>[0-9]+)-(?P<通道>[A-Za-z]+).tif"
      描述一个以...开头的文件名 "1号板"，后跟一个或多个表示行的英文字母，再后跟一个或多个表示列的数字，随后是 "-"，其后跟有一个或多个字母表示通道，再之后是 ".tif". 尖括号内的字母，如 "<>" 是变量名，会在数据收集时自动复制到数据中。其中一个变量名必须是 "<通道>"
    3. 标明细胞核染色可见的通道名称以及心肌细胞可见的通道名称。这些名称必须是 精确地 如它们在匹配部分中的情况一样 "<通道>" 正则表达式文件名中的变量。
    4. 使用逗号分隔的变量名称来指明图像应如何分组。每个组内的所有图像将被批量打开并进行分析。例如，如果图像按每个孔划分为一组，且每个唯一的行与列组合对应一个孔，则填写 "行，列" 在此领域。
      注意：这些分组变量必须是格式字符串中所用变量的子集。请勿使用 "通道" 作为分组变量，这将把相应的通道图像彼此分离开来。
    5. 指明图像是否在一个孔内拼接成单张图像，或每个位点的图像是分开的。若为前一种情况，则文件名格式字符串中不应包含位点信息。
    6. 选择用于将细胞核与背景分离的阈值分割方法。Fiji 的所有标准阈值分割方法均可使用。测试不同的阈值分割方法，以确定哪种方法对本图像集效果最佳。在本示例中，选择 Otsu 方法。
    7. 指明是否应对每个位点的图像重新计算阈值，或是否应对组内所有图像使用相同的阈值。指明心肌细胞图像是明场图像还是使用了荧光标记。
    8. 指明心肌细胞的阈值分割方法。如果在上一步中选择了明场图像，则该阈值分割方法将应用于经过边缘滤波的明场图像。指明是否应对每个视野图像重新计算阈值，或是否对组内所有图像使用相同的阈值。
    9. 注明覆盖每个孔的位点图像的行数。 注明覆盖每个孔的位点图像的列数。 注明细胞核的最小面积（像素）。 采用较为宽松的下限尺寸，更精确的阈值将在分析步骤中计算得出。 注明心肌细胞的最小面积。
    10. 选择所需设置后，单击 好的.
  3. 与以下所示相似的图像 图3 和 图4 屏幕上将显示分析流程的不同阶段图像，请检查这些图像以确保阈值设定和分割过程正确进行。
  4. 选定的结果文件夹现在应已填充分析数据（补充文件 1：截图5）。只要文件名不以 "厘米", "细胞核"，或 "核连接".

7. 数据分析

注意：生成的 csv 文件可进行手动分析。每个分析的图像子集会产生三个 csv 文件，文件名分别为“nuclei(metadata).csv”、“nucleilink(metadata).csv”和“cardiomyocytes(metadata).csv”，其中(metadata)会被一系列形如“_(name)=(value)”的名称-值对替换，(name)和(value)是由先前给出的正则表达式匹配的字符串派生出的字母数字字符序列。（例如，若文件名中包含行和列信息，则会出现类似“_row=F”和“_column=8”的字符串）。每个nuclei文件和nucleilink文件中最左侧无名称的列是细胞核ID编号。nucleilink文件中的“Min”列是完全包含该细胞核的心肌细胞的ID，否则为0。“Max”列在nuclei文件中表示部分包含该细胞核的编号最高的心肌细胞ID，否则为0。cardiomyocytes文件中的“Mean”列是心肌细胞的ID编号。

  1. 在 Rstudio 中打开“AnalyzeMultinucleatedServer.R”文件（作为补充代码文件提供）。
  2. 在此文件的顶部有一个名为“folderName”的变量，其后为一个文件路径。在此处输入上一步中选择的输出数据文件夹的路径，路径末尾不加斜杠（补充文件 1：截图 6）。
  3. 在脚本编辑窗口的左上角应有一个标有 Run App 的绿色箭头。单击此箭头。数据加载和应用程序弹出可能需要一些时间。
  4. 初始时将显示三个门控图，分别用于指示有效的最小核面积阈值、有效的最小核平均强度阈值，以及心肌细胞有效的最大最小Feret直径。使用滑块设置这些阈值（补充文件 1：截图 7）。
    注意：在每个图中，应存在一个对应于有效细胞核或心肌细胞的宽大主峰，其两侧为表示碎片或错误分割的心肌细胞的宽尾。使用阈值将每个峰的一侧尾部截除。
  5. 向下滚动，点击 Apply Selected Thresholds 按钮（位于 补充文件 1：截图 7 的底部）。
  6. 点击 Plot Intensity Distribution 按钮。将生成整个样本的核强度分布图，以及每个分组变量的独立子图。
    注意：例如，如果在 Fiji 对话框的正则表达式中输入了 <row> 和 <column> 分组变量，则此处将显示按行和按列划分的强度分布图（补充文件 1：截图 8）。如果样本不同区域的照明和染色条件保持一致，这些图应清晰显示两个强度峰，一个较暗且较高的峰代表二倍体细胞核，一个较亮且较矮的峰代表四倍体细胞核。
  7. 样本内变异可能导致全样本图中无法观察到该模式，并导致按行、列或其他分组变量划分的二倍体和四倍体峰位置差异显著。在此情况下，向下滚动并勾选 Normalize Separately by group 复选框以校正此类变异（补充文件 1：截图 9）。
  8. 点击 Calculate Ploidy 按钮（补充文件 1：截图 9），然后点击 Plot Estimated Ploidy Distribution 按钮。图形将出现在右侧的空白窗口中。在归一化的全样本图中，此前未显现的双峰模式此时应可见。
  9. 使用滑块选择阈值，以将二倍体和四倍体峰彼此分离，并排除异常值（补充文件 1：截图 9）。向下滚动，点击 Calculate Ploidy and Nucleation 按钮（补充文件 1：截图 10）。
  10. 点击 Plot and Save Into Results Folder 按钮。生成的图表将保存至所选的结果文件夹，并同时显示在此交互窗口中（补充文件 1：截图 10）。

结果

心肌细胞的分离按照上述方案进行。采用该方法，我们通常可获得均匀的单个心肌细胞，且纯度较高，无非心肌细胞污染（图1A）。由于心肌细胞具有特征性的大小和双折射性，可在明场显微镜下轻松识别。该技术易于实施，不同批次分离所得结果一致，心肌细胞的得率和质量均具有可比性（图1B）。分离后的心肌细胞可在4 °C下保存数周，以备后续使用。

根据上述方案分离的心肌细胞可用于多种后续实验，例如测定心肌细胞大小、心肌细胞倍性以及免疫细胞化学分析。作为代表性结果，我们展示了依据本方案分离的心肌细胞可使用抗体以及荧光染料偶联的叠氮化物通过点击化学反应进行染色，分别用于检测特定蛋白的定位或检测心肌细胞DNA复制。例如，我们使用识别α-肌动蛋白的抗体对心肌细胞进行染色，以显示肌节典型的Z线染色模式（图2A）。在另一项实验中，我们在分离固定的心肌细胞前向小鼠给予胸腺嘧啶类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。心肌细胞分离后，我们采用标准方案13对掺入的EdU进行染色，能够检测到在单核、双核以及三核心肌细胞中发生S期的细胞（图2B）。

为了进一步拓展该分离方法的应用，我们开发了一种基于整合DNA染色的定量心肌细胞倍性的分析流程。为了能够测量细胞或细胞核的倍性状态，我们需要对细胞核和心肌细胞进行分割。图3展示了我们用于识别单个细胞核的策略示意图。首先，对原始的DNA染色图像（图3A）根据荧光强度进行阈值分割（图3B）。本实验中使用DAPI对DNA进行染色，但任何其他与DNA含量呈线性关系的细胞核染料均可适用。该程序允许选择Fiji软件中的任意强度阈值方法，本示例中采用的是Otsu法。接触图像边缘或面积小于设定最小像素阈值的细胞核掩膜将被排除。随后，对细胞核掩膜拟合椭圆，以实现单个细胞核的分割。图3C显示了这些椭圆叠加在原始图像上的结果。接下来，填充掩膜中的空洞，并根据像素点距离最近的椭圆将其划分至相应区域（图3D）。然后利用这些区域的边界在细胞核簇中划出分界线，完成细胞核的分割过程（图3E）。

下一步是心肌细胞的检测。对于基于荧光染色细胞获得的心肌细胞图像（图4A），其处理过程与细胞核检测非常相似。根据所选的阈值方法（本例中为三角法）计算出的强度值对图像进行阈值分割。排除与图像边界接触或面积小于特定阈值的心肌细胞掩膜，并对掩膜中的孔洞进行填充，从而获得正确分割的心肌细胞（图4B）。由于心肌细胞的形状比细胞核更不规则，因此在分析过程中不尝试分割心肌细胞簇；相反，这些细胞簇会因其较大的最小费雷特直径而在分析步骤中被排除。基于明场图像的分割过程略有不同。首先，对原始明场图像（图4C）应用Sobel边缘滤波器。该滤波器计算图像中每个像素梯度的绝对值，图像中变化剧烈的区域像素值较高，而平滑区域的像素值较低。随后，使用三角法根据强度对该边缘滤波后的图像进行阈值分割，得到心肌细胞的掩膜（图4D）。接着，通过形态学闭运算对这些高度不规则的掩膜进行平滑和连接，闭运算中使用的结构元素为半径2像素的圆，可填充图像中该圆在不与黑色区域重叠的前提下无法完全嵌入的所有白色区域（图4E）。最后，填充掩膜中的孔洞，排除与图像边界接触的区域，并去除小颗粒，完成心肌细胞的分割过程（图4F）。

采用上述分割策略，我们可以确定单个心肌细胞的核型状态。利用该方法，我们分析了来自远交系CD-1小鼠出生后早期心脏中分离的心肌细胞的核型状态。新生小鼠（出生第一天）心脏显示，此时大多数心肌细胞为单核状态（图5：新生期）。在幼年小鼠（2周龄）中，单核心肌细胞的比例显著降低，约占心肌细胞总数的25%（图5：幼年期）。最后，我们可测定心肌细胞内各个细胞核的倍性状态，判断其为二倍体或四倍体。结果显示，青少年期小鼠中心肌细胞核的四倍体频率更高（Figure 6）。

心肌细胞分离显微图像及每颗心脏细胞计数的柱状图比较。
图1：固定后心肌细胞分离效率。（A）分离心肌细胞的代表性图像，用DAPI染色显示细胞核。（DAPI（蓝色），明场（灰色））（B）从3月龄不同小鼠中分离得到的心肌细胞产量。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

肌纤维显微图像；荧光标记显示细胞结构，比例尺为50μm。
图2：分离心肌细胞的免疫细胞化学染色。（A）心肌细胞α-肌动蛋白（α-actinin，红色）和DAPI（蓝色）染色的代表性图像。（B）心肌细胞掺入EdU（红色）和DAPI（蓝色）染色。图中显示EdU阳性且分别为单核（左）、双核（中）和三核（右）的代表性心肌细胞。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

使用荧光显微镜进行细胞分割的过程；显微镜图像与分析示意图。
图3：细胞核分割策略。（A）原始DAPI通道图像。（B）经阈值处理后的图像（本示例中采用Otsu方法）。（C）从阈值化图像中识别出的掩膜，叠加于原始DAPI染色图像上。（D）基于细胞核掩膜的Voronoi镶嵌图。（E）最终分割得到的细胞核，其中被分割的聚集体已高亮显示。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

晶体形态显微观察；示意图；光学方法；各向异性生长比较；比例尺100μm。
图4：心肌细胞分割策略。（A）原始荧光染色肌钙蛋白I标记的心肌细胞图像。（B）经三角阈值法处理、填充孔洞并排除小物体及接触边界的物体后的图像。（C）原始明场心肌细胞图像。（D）经边缘滤波和三角阈值法处理后的心肌细胞图像。（E）经半径为两个像素的形态学闭运算处理后的边缘滤波图像。（F）经填充孔洞并排除小物体及接触边界的物体后的图像。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

新生期与幼年期心肌细胞群体的柱状图；每细胞核数量比较。
图5：基于细胞核数量的心肌细胞分类。 新生期心脏（出生1天）中心肌细胞以单核为主，数量多于幼年期心脏（出生14天）。请点击此处查看该图的放大版本。

新生儿和幼年期倍性分布直方图；有核细胞计数分析。
图6：每个细胞核的心肌细胞DNA含量分布。 在新生儿中（左图），13.5%的单核心肌细胞核为四倍体，11.9%的双核心肌细胞核为四倍体。在幼年个体中（右图），33.9%的单核心肌细胞核为四倍体，31.2%的双核心肌细胞核为四倍体。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：软件截图。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

补充文件 2：AnalyzeNucleation.py。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充文件 3：AnalyzeMultinucleatedServer.R。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

讨论

由于心肌细胞无法在体外培养中长期维持，因此分离原代心肌细胞以研究其结构与功能显得尤为重要11。因此，心肌细胞分离技术已在心脏研究领域得到广泛应用。如果研究目标是评估心肌细胞的功能特性，则必须分离出具有活性的心肌细胞。这些活的心肌细胞还可用于对分离后的心肌细胞进行免疫染色。然而，活心肌细胞分离技术的优化在操作上具有较大挑战性，即使是最优方法通常也只能获得60–65%的活棒状心肌细胞，其余心肌细胞均呈球形收缩状态，处于死亡或已死亡状态11,12。在此，我们建立了一种先固定心脏再高效分离心肌细胞的技术。与以往发表的方法相比，该新方案可显著提高棒状心肌细胞的得率。此外，我们开发了一个成像分析平台，可基于细胞核化状态和倍性自动分类心肌细胞。借助这些新技术，研究团队可对心肌细胞中不同蛋白进行染色，并通过心肌细胞的倍性与核化状态来评估心脏的再生潜能。

本文所述方案相对简单，无需任何高级设备即可实施。胶原酶的用量和消化孵育时间可能因胶原酶批次及其供应商的不同而有所变化。我们采用的是胶原酶2型，因为这是目前用于消化心脏以获取活心肌细胞最常用的方法。根据我们的观察，无论纤维化程度如何，对几乎所有小鼠心脏而言，使用60 mg/mL的胶原酶2型进行过夜孵育均为最佳条件。由于细胞内蛋白已被固定，不易被消化，因此我们从未遇到过度消化的问题。然而，如果心脏组织未充分消化，则可能需要更剧烈的吹打，而这会因剪切力导致细胞破碎。因此，在进行吹打操作前，必须确保心脏组织已充分消化。可通过镊子轻压心脏以检测其硬度，从而评估消化程度。经胶原酶孵育后，心脏组织应变得较软，易于撕开。也可使用其他类型的胶原酶。此前有研究报告采用胶原酶B与胶原酶D的组合14。

此外，我们认为该方案可用于评估心脏中心肌细胞的总体数量15。然而，如果目标是从心脏中获取并定量全部心肌细胞，则需要在胶原酶溶液中孵育心脏较长时间（例如3-7天），期间应每天更换一次胶原酶溶液。这将通过消除吹打程度对心肌细胞得率的影响，从而最大限度地减少分离效率的不一致性。

利用DNA含量测定倍性并非新方法，该技术已用于流式细胞术数十年。最近研究表明，显微镜也可用于估算每个细胞核的DNA含量16。本文中，我们采用该策略测量心肌细胞细胞核的倍性，以此作为新形成心肌细胞的替代指标。在心脏再生领域，普遍认为只有单核的二倍体心肌细胞才能进行胞质分裂并产生新的心肌细胞。由于在体内直接测量新心肌细胞的生成极为困难，因此通常通过分离在给予DNA核苷酸类似物后被示踪的心肌细胞，并确定其中单核二倍体心肌细胞的比例，来近似评估心脏生成新心肌细胞的能力17。本文提供了一个ImageJ宏工具，可实现心肌细胞倍性的简便定量分析。为准确估算G1峰的位置，至少需测量500个细胞核。若能确保成像板中每个孔的染色和成像条件一致，则整个样本中总共测量500个细胞核即可；否则，每个图像组需测量500个细胞核18,19。基于成像的细胞核与倍性测量方法存在局限性，例如在使用二维图像时，难以区分黏附细胞的细胞核与真正的心肌细胞细胞核。这些黏附细胞可能导致多核细胞数量被高估，并降低四倍体心肌细胞核群体测量的准确性。解决该问题的一种可能策略是使用心肌细胞核标志物PCM16,20。然而，我们在固定良好的细胞或组织上获得可靠PCM1染色方面遇到了困难。

另一个潜在的局限性是，某些细胞核染色图像可能存在显著的背景细胞质染色，导致在未进行充分预处理的情况下，无法使用 Fiji 内置的方法进行适当的阈值分割。此外，这种背景荧光的不规则贡献会降低倍性估算的准确性。再者，如果细胞在 DNA 染色液中孵育时间不足，荧光染料将无法在细胞核内达到饱和结合，此时细胞核积分强度与 DNA 含量之间的线性关系假设将不再成立。

需要注意的是，该软件无法分割心肌细胞簇，而是会将其从分析中剔除。因此，以相对较低的密度接种心肌细胞至关重要（例如，1000 个细胞/cm2）。此外，该软件无法区分两个首尾相接的心肌细胞与一个细长的单个心肌细胞。此类细胞排列可能错误地导致多核化率的高估。

尽管所述方法无法获得具有活性的心肌细胞，因此不能用于测量动态的细胞过程，但如果目标是进行免疫染色，我们认为该方法优于现有方案，能够获得更高产量的心肌细胞，并在形态学和蛋白质定位质量方面表现更佳。最后，所述方法还可用于从临床样本中分离心肌细胞14,21。我们相信，该方法学能够帮助不同研究者获取高质量的心肌细胞，并通过检测成核现象和倍性水平来间接评估新心肌细胞的生成。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

JHvB 获得了美国国立卫生研究院（NIH）、明尼苏达再生医学项目以及哈特韦尔基金会个人生物医学研究奖的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于成像的96孔板Corning3340我们使用这些板，因为它们适用于成像，尽管共聚焦成像时玻璃底板效果更佳
α-肌动蛋白Novus BiologicalsNBP1-32462该抗体用作心肌细胞肌节的标记物
钝头剪刀Fine Scissor Tools14072-10我们偏好使用钝头剪刀，因为在暴露心脏时撕裂心脏组织的可能性较低
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664用于心肌细胞群体的成像、倍性及核化状态评估
CD-1小鼠Charles river22用于心肌细胞群体的成像、倍性及核化状态评估
胶原酶2WorthingtonLS004177就本实验方案而言，不同批次间的差异极小，不影响分离的整体得率和质量
五水硫酸铜Sigma-Aldrich203165-10G用于EdU染色
Cy5 甲基叠氮Click Chemistry Tools1177-25用于EdU染色的叠氮化合物
Cytation3BioTek-用于DNA分析的自动成像
DAPILife TechnologiesD3571用于DNA染色的DAPI。储备液溶于蒸馏水中。
驴抗小鼠IgG-Alexa568Life TechnologiesA10037用于检测心肌细胞内α-肌动蛋白染色的二抗
镊子ROBOZRS-5137我们使用这些弯曲的钝头镊子，尽管直镊子也可使用
盐酸Fisher ScientificA144212用于将Tris-HCl缓冲液的pH调节至8.5
ImageJimagej.net/Fiji/Downloads-用于图像分析
L-抗坏血酸Sigma-Aldrich255564-100G用于EdU染色
输注用针头TERUMOSV*23BLK我们在整个实验方案中使用带翼输注装置，因为在注射过程中使用这些装置更容易调节针头位置
Nikon A1R HD25Nikon-用于获取α-肌动蛋白染色的共聚焦图像
200微米尼龙筛网Elko filtering03-200/54用于过滤普通心肌细胞（非肥大性）
400微米尼龙筛网Elko filtering06-400/38用于过滤肥大的成年心肌细胞
磷酸盐缓冲液（1X）Corning21-040-CV也可在实验室自行配制。尽管本实验中无菌条件很重要，但我们认为配制PBS并进行过滤即可满足要求
颗粒状氯化钾Mallinckrodt6858我们更偏好使用颗粒状氯化钾，因其在室温储存时形成的聚集体较少
Rr-project.org-用于分析从图像中获得的测量数据
Tris碱Fisher ScientificBP152-5用于缓冲EdU染色反应

参考文献

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146(2017).
  2. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
  3. Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
  4. Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
  5. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
  6. Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  7. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  8. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
  11. O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
  12. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  13. Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657(2018).
  14. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  15. Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
  16. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  17. Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
  18. Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6(2018).
  19. Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
  20. Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).

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