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使用化学活检评估移植物质量

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DOI：

10.3791/60946

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2020年6月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine, Toronto General Hospital

* These authors contributed equally

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摘要

本方案介绍了利用化学活检方法，随后进行全面的代谢组学和脂质组学分析，以评估分配用于移植的肾移植物质量。

摘要

肾移植是全球众多终末期肾功能障碍患者的一种挽救生命的治疗手段。与传统的透析相比，该手术可显著提高患者的生存率并改善其生活质量。遗憾的是，移植医学领域目前仍缺乏可靠的器官质量评估方法。现有的常规诊断技术仅限于肉眼观察器官宏观形态或进行有创的组织活检，这些方法无法提供关于移植器官的全面信息。本方案旨在引入固相微萃取（SPME）技术，作为一种理想的分析方法，用于对拟用于移植的肾脏中所有低分子量化合物进行全面的代谢组学和脂质组学分析。由于SPME探针体积微小，可实现“化学活检”，即直接从器官中提取代谢物，而无需采集组织样本。该方法的最小侵入性允许在多个时间点重复进行分析：包括器官获取后、保存期间以及受体体内再灌注后立即进行。我们假设，将这种新型采样方法与高分辨率质谱仪相结合，将能够识别出一组特征性化合物，这些化合物有望作为移植物质量的生物标志物，并用于提示器官功能障碍发生的可能性。

引言

根据美国器官获取和移植网络的数据，2019年美国有94,756名患者等待肾移植；而2018年欧洲的这一数字为10,791人。在美国，每十分钟就有一人被加入国家移植等待名单，据估计，每天有20人因等待移植而死亡1,2。对于全球大量患有终末期肾功能障碍的患者而言，肾移植是一种挽救生命的治疗手段。与传统的透析相比，该手术可提高生存率并显著改善生活质量。

然而，器官移植面临诸多严重问题，例如器官短缺或缺乏有效的器官质量评估工具。目前的标准方案仅限于肉眼观察器官外观或进行有创的组织活检，这些方法无法提供有关移植物质量的全面信息。尽管肉眼评估能够识别肉眼可见的肿瘤、解剖学异常或移植物的大范围损伤，但该方法具有很强的主观性，其有效性因观察者经验不同而存在差异。另一方面，活检可提供有关既往肾脏疾病的重要信息，因此被认为是一种在判断移植物预后方面具有客观性和证据价值的方法。然而，活检操作本身也存在缺陷；其可能带来出血等潜在并发症的风险，且样本制备还需额外4-5小时，显著延长了冷缺血时间。因此，尤其是在欧洲，直接组织分析的使用仅限于扩大标准供体（ECD）和循环死亡后供体（DCD）3,4。

代谢组学和脂质组学近年来被认为是在器官保存过程中深入了解生物化学通路变化的有前景的方法。代谢组学和脂质组学分析能够监测系统对器官离体后所引发的突发环境变化的即时响应，以及随之而来的缺血、氧化应激或炎症反应等后果5,6,7,8。肾脏是一个与代谢过程密切相关的器官，因此对代谢物和脂质浓度的测定可能有助于识别潜在的器官质量生物标志物，并更准确地预测移植器官的预后。

鉴于当前器官质量评估方法存在上述复杂性和局限性，亟需一种侵入性更小的诊断方案，以实现快速且复杂的器官质量评估。固相微萃取（SPME）作为一种微创分析技术，能够覆盖广泛的代谢物和脂质，符合这一需求。该技术基于将一根细小（约200 µm）、生物相容性的钛镍合金探针插入待测器官内，探针表面涂有选择性萃取相，停留时间较短。需要强调的是，SPME不会萃取蛋白质，因此可在样本采集阶段即抑制代谢活动，这是相较于其他方法的一项显著优势。此外，该装置的小型化设计使得对器官内多个结构进行重复且同步的分析成为可能9,10,11。

方案

所有动物均按照加拿大安大略省国立卫生研究院发布的《实验动物护理指南》以及国家医学研究协会制定的《实验动物护理原则》接受了人道护理。多伦多综合研究所动物护理委员会批准了所有研究。涉及人类受试者的研究已获得托伦哥白尼大学比得哥什医学院生物伦理委员会的批准。

注意：需获得相关伦理委员会的批准。务必始终佩戴安全手套。切勿触碰固相微萃取（SPME）探针的提取相。建议在脂质组学分析中使用去活化玻璃小瓶。

1. 探针的制备

  1. 准备涂有7 mm混合模式吸附剂的钛镍合金探针（40 mm长；0.2 mm直径）。探针数量取决于整个实验过程中设定的时间点以及重复次数（建议每个时间点3次重复）。
    注意：提取相的长度和类型可根据研究模式、代谢物的极性以及样品基质进行调整。
  2. 配制由2:1氯仿:甲醇（v/v）组成的清洗液。将1.0 mL该溶液移入每个2.0 mL玻璃小瓶中，并将一根预先穿过瓶盖的探针放入每个小瓶中。
    注意：使用前需清洗所有探针，以去除污染物颗粒。
  3. 将小瓶置于振荡器上，设置振荡速度为1,200 rpm。45分钟后停止振荡，用LC-MS级水冲洗探针涂层。
  4. 由于涂层需经过预处理步骤以激活其性能，因此配制由1:1甲醇:水（v/v）组成的预处理溶液。将1.0 mL该溶液移入每个2.0 mL玻璃小瓶中，并将一根预先穿过瓶盖的探针放入每个小瓶中。
  5. 将小瓶置于涡旋振荡器上，设置振荡速度为1,200 rpm。
  6. 60分钟后停止振荡，用LC-MS级水冲洗探针涂层。
  7. 根据标准外科器械灭菌程序对探针进行灭菌处理。

2. 提取

  1. 采样前立即打开无菌包装，以确保无菌环境。
  2. 在每个时间点，将两根探针直接插入肾皮质，持续 10 分钟。探针涂层的整个长度必须被组织基质完全覆盖；无需特定角度，但通常采用约 90 度角。
    注意：整个医疗操作遵循所在机构的标准操作规程。关于 SPME 采样不作任何修改。该操作包括以下六个采样时间点：
    a) 肾脏切除前，来自供体的体内采样；
    b)–e) 肾脏灌注后 1 h、3 h、5 h、7 h，在器官腔室中的离体采样；
    f) 再灌注后，来自受体的体内采样。
  3. 通过从组织中抽出探针来回收探针，随后用液相色谱-质谱级水冲洗涂层，以清除涂层表面残留的血液。冲洗操作应远离手术区域，并在探针取出后立即进行。

3. 运输与储存

  1. 将探针分别放入不同的小瓶中并盖紧。
  2. 将小瓶置于装有干冰或液氮的泡沫塑料盒中进行运输。
  3. 将样品储存在超低温冰箱（-80 °C）中，或立即开始脱附步骤。

4. 解吸

  1. 为代谢组学分析配制由80:20乙腈:水（v/v）组成的洗脱溶液，为脂质组学分析配制1:1异丙醇:甲醇（v/v）的洗脱溶液。
  2. 将100 μL上述溶液移入置于已标记的2.0 mL小瓶中的插入件内，并将一根预先穿过瓶盖的探针放入每个小瓶中。
  3. 将小瓶置于涡旋振荡器上，设置振荡速度为1,200 rpm，持续120分钟。
  4. 从小瓶中取出探针。所得提取物即可用于仪器分析。

5. 液相色谱-质谱分析

  1. 将含有提取物的小瓶放入LC-MS系统的自动进样器中。
    注：本研究采用与高分辨质谱联用的液相色谱（反相，HILIC）及轨道阱质谱分析仪。代谢组学分析参数见步骤5.2，脂质组学分析参数见步骤5.6。
  2. 使用五氟苯基（PFP）色谱柱（2.1 mm × 100 mm，3 μm）进行反相分离。
    1. 设置流速为300 µL/min，自动进样器温度为4 °C，柱温为25 °C。
    2. 按以下比例配制流动相：流动相A：水:甲酸（99.9:0.1，v/v）；流动相B：乙腈:甲酸（99.9:0.1，v/v）。流动相梯度设置如下：起始流动相（0–3 min）为100% A，随后线性梯度洗脱至10% A（3–25 min），接着以10% A等度洗脱至34 min，之后进行6 min的色谱柱再平衡。
  3. 对于HILIC分离，使用HILIC色谱柱（2.0 mm × 100 mm，3 μm，200A），设置流速为400 μL/min。
    1. 按以下比例配制流动相：流动相A：乙腈:乙酸铵缓冲液（9:1，v/v，有效盐浓度20 mM）；流动相B：乙腈:乙酸铵缓冲液（1:1，v/v，有效盐浓度20 mM）。
    2. 流动相梯度设置如下：起始流动相（0–3 min）为100% A，保持3.0 min，随后在5 min内线性升至100% B，保持100% B至12 min，之后进行8 min的色谱柱再平衡。
  4. 设置扫描范围为85–1000 m/z。在正离子化模式下，设定HESI离子源参数如下：喷雾电压1,500 V，毛细管温度300 °C，鞘气40 a.u.，辅助气流速15 a.u.，探针加热器温度300 °C，S-透镜射频水平55%。
  5. 运行质控（QC）样品，每10–12个样品插入一次，每次取各分析样品10 µL混合，用于监测仪器性能。
  6. 对于反相分离，使用C18色谱柱（2.1 mm × 75 mm，3.5 μm）。
    1. 设置流速为200 µL/min，自动进样器温度为4 °C，柱温为55 °C。按以下比例配制流动相：流动相A：H2O:MeOH（60:40，v/v），含10 mM乙酸铵和1 mM乙酸；流动相B：IPA:MeOH（90:10，v/v），含10 mM乙酸铵和1 mM乙酸。
    2. 流动相梯度设置如下：0–1 min（20% B），1–1.5 min（20–50% B），1.5–7.5 min（50–70% B），7.5–13 min（70–95% B），13–17 min（95% B），17–17.1 min（95–20% B），17.1–23 min（20% B）。
  7. 对于HILIC分离，使用HILIC色谱柱（100 × 2.1 mm，3 μm）。
    1. 设置流速为400 µL/min，自动进样器温度为4 °C，柱温为40 °C。
    2. 按以下比例配制流动相：流动相A：乙腈（ACN）；流动相B：含5 mM乙酸铵的水溶液。流动相梯度设置如下：0–2 min（96% B），2–15 min（96–80% B），15–15.1 min（80–96% B），15.1–21 min（96% B）。
  8. 在正离子化模式下，设定HESI离子源参数如下：喷雾电压3,500 V，毛细管温度275 °C，鞘气20 a.u.，辅助气流速10 a.u.，探针加热器温度300 °C，S-透镜射频水平55%。
  9. 运行质控（QC）样品，每10–12个样品插入一次，每次取各分析样品10 µL混合，用于监测仪器性能。
  10. 在与仪器兼容的软件中进行数据采集。

6. 数据分析

  1. 使用专用于非靶向代谢组学和脂质组学分析的软件进行数据处理、初步鉴定和统计分析。
    注意：可通过主成分分析（PCA）和箱线图来可视化数据结构。

结果

根据上述SPME方法进行样品采集，使用涂有7 mm混合模式萃取相的探针。采样直接从移植前的移植物组织（体内）、灌注1 h、3 h、5 h和7 h后在离体肾脏腔室中，以及受体体内再血管化后进行。采用液相色谱法（反相、HILIC）联用高分辨质谱进行非靶向代谢组学和脂质组学分析，质谱分析器设置为正离子化模式。为评估数据质量并获得对结果的整体认识，对数据进行了主成分分析（PCA）。如图1所示，QC样本形成紧密的聚类，证实了分析结果的质量。各研究组表现出相对良好的分离，能够可视化移植前后以及器官灌注期间代谢组和脂质组谱的变化（图2）。SPME采样实现了器官随时间推移的代谢谱分析。图3展示了选定代谢物的箱线图，用以示例实验过程中代谢物水平的变化。在反相和HILIC色谱柱上分离出的广泛特征谱如图4所示。

主成分分析（PCA）散点图；比较质控与样本组分布的示意图。
图1：主成分分析显示非靶向代谢组学反相（A）、HILIC（B）以及脂质组学反相（C）、HILIC（D）分析中质量控制样本的聚类情况。在非靶向分析中，质量控制对于监测仪器不稳定性可能引起的变化至关重要。质量控制样本的紧密聚类表明所观察到的所有变化均源于生物学差异。请点击此处查看该图的放大版本。

比较灌注状态及供体-受体样本的主成分分析（PCA）图表。
图 2：主成分分析显示特定采样时间点之间的代谢组学（A）和脂质组学（B）差异。采用SPME-LC-HRMS对肾脏进行非靶向代谢物分析，可观察器官在保存过程中各阶段的生化差异。请点击此处查看该图的放大版本。

药代动力学分析；剂量-反应箱形图；吸收、浓度指标；数据图
图 3：选定化合物的箱须图，显示移植期间代谢物（A, B）和脂质（C, D）的变化。在筛选并鉴定出具有区分能力的化合物后，可通过箱须图监测这些化合物在实验方案后续步骤中的水平变化，并比较经不同保存方案处理的器官或来自不同供体（如心脏跳动供体或心脏死亡后供体）的器官中代谢物的水平。请点击此处查看该图的放大版本。

质谱色谱图，m/z 与保留时间（RT）关系图，显示化合物分离分析结果。
图4：通过LC-MS分析获得的特征离子图（m/z 与保留时间关系），分别采用（A）反相色谱和（B）HILIC色谱进行分离。该图可用于评估本研究方案（从提取到检测）所获得特征的总体数量，并根据极性评估分析物的覆盖范围。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

器官质量的评估对临床医生而言仍是一项重大挑战，他们必须快速做出知情决策，判断某个特定器官是否适合移植，或是否应当弃用。多种因素，如供体年龄、缺血持续时间以及感染和炎症过程，均可能影响移植物的长期预后。尽管迄今为止已开发出多种方法用于诊断肾移植器官功能，组织病理学检查仍是该领域的金标准3,4,12。虽然活检操作可提供有关供体既往疾病及血管改变的重要信息，但其本身并非没有缺陷。取样误差、观察者间变异以及所取肾小球数量不足导致无法全面评估器官功能，仍是此类检查中的典型问题。此外，标本制备过程也存在一些问题，例如冷冻切片可能无法对移植物进行全面评估，而石蜡包埋切片则会延长操作时间。然而，活检操作最主要的危及生命并发症是出血风险增加，可能急性表现为显微镜下或肉眼血尿。因此，在移植过程中允许进行的活检次数受到严格限制，这一因素阻碍了通过该方法捕捉动态变化和进行时间序列分析的可能性12,13,14。组织学分析的益处必须与其方法相关风险进行权衡。组织学发现的价值无可置疑，但其无法解释异常背后的分子机制。

代谢组学与脂质组学是“组学”科学家族中最新发展的领域。与代谢网络相关的全套低分子量（<1,200 Da）人类代谢物和脂质被定义为人类代谢组。基因组在其生命周期中相对稳定，仅因罕见发生的突变而产生轻微改变。代谢组是基因表达的产物，对所有生物过程以及环境因素的变化高度敏感。代谢物和脂质的动态特性使其成为反映器官当前状态的理想指标7,8,15,16。上述方案中提出的固相微萃取（SPME）方法能够检测器官在保存期间发生的变化，时间范围从供体器官摘除开始，直至受体端重新血管化为止。探针直径小（约200 µm），侵入性极低，可在同一器官上进行多次取样而不会对组织造成损伤。以肾脏——最常进行移植的器官——为研究对象，有助于更深入地理解并进一步表征导致移植物质量和功能下降的代谢通路。与传统的侵入性方法（如活检）相比，能够随时间推移监测代谢变化的可能性无疑是该技术的重要优势。目前的分析已识别出多类脂质和代谢物浓度的改变，尤其是必需氨基酸、嘌呤、嘌呤核苷以及甘油磷脂类物质。这些结果与此前的组织分析报告一致5,6,17,18,19,20。迄今为止，大多数利用代谢组学或脂质组学解释移植后并发症或缺血/再灌注损伤（IRI）现象的科学研究仅局限于生物流体的分析21,22,23。

每种临床应用都需要优化采样方案，以确保分析方法的性能满足预期标准。在此方面，使用固相微萃取（SPME）的优势在于可以根据不同的实验设计调整条件。多种可选的萃取相能够提取具有不同极性的广泛代谢物。然而，这也可能被视为该方法的一个局限性，因为每种吸附剂对特定组分具有选择性，并不能提取样品基质中存在的所有化合物。需要注意的是，SPME涂层仅通过游离分子进行萃取，而完全不与分析物的结合态组分发生相互作用。涂层的生物相容性不会对组织产生毒性，同时限制了蛋白质等大分子的萃取；因此，酶促反应在样品采集阶段即被抑制，从而最大限度地减少了人为假象的产生，这是相较于其他采样方法的一大优势。涂层长度影响萃取效率（即涂层长度决定了表面积和萃取相体积），因此较长的涂层可获得更高的回收率。另一方面，较短的涂层可实现更高的空间分辨率。为了获得可靠的结果，必须将探针插入至肾皮质相同深度。插入过深可能导致进入肾髓质。萃取时间也与萃取效率成正比，因此选择最佳萃取时间是SPME方法开发中最关键的步骤之一。时间测量的准确性可提供最高的重复性。在诸如本研究讨论的生物学应用中，分析方案的灵敏度和重复性始终需要与临床操作的限制条件之间取得平衡。尽管平衡态萃取可提供最高的灵敏度，但出于安全考虑，此类应用中通常采用非平衡态条件，因为萃取时间不应影响手术的总时长。解吸效率由解吸过程的时间和解吸溶剂的组成决定，且解吸溶剂应与用于色谱分离的流动相相容9,10,11。

用于术中评估的诊断仪器的一个主要要求是分析时间。目前，研究人员正在尝试开发一种快速工具，将活体固相微萃取（SPME）与质谱仪通过微流控开放式接口（MOI）24 或涂覆刀片喷雾（CBS）25 直接耦合。此类方法可实现接近实时或真正的实时分析结果输出。在移植手术过程中，利用这些方法进行干预前的代谢组和脂质组谱型分析，有助于提升决策效率，实现最佳的个体化治疗策略，并在器官功能衰竭时迅速作出响应。

综上所述，本研究假设所提出的方案将能够获得肾移植器官的完整代谢组和脂质组谱，从而全面评估器官质量，并阐明导致缺血-再灌注损伤的相关过程。本项目的创新之处在于采用固相微萃取技术（SPME），该技术可对活体系统进行低侵入性取样，并结合目前代谢组学与脂质组学分析领域最先进的技术之一（例如Orbitrap高分辨质谱仪）。SPME将样品采集、提取及代谢物淬灭过程整合为一步，因此非常适用于快速分析。预计该方案将有助于回答以下问题：肾脏移植前的哪些状态会导致移植后器官功能延迟恢复或功能障碍，以及移植物保存方案如何影响器官的生物化学特性。此类知识不仅对预防移植相关并发症具有重要意义，还可能优化现有的移植物保存方案，最大限度减少可移植组织的损失以及降低患者死亡风险。该方案将为该领域的进一步研究打开大门，包括特定潜在生物标志物的验证以及移植医学治疗效果的提升。

披露

作者谨此感谢德国达姆施塔特默克集团旗下的MilliporeSigma公司提供固相微萃取装置，以及赛默飞世尔科技公司提供Q-Exactive Focus Orbitrap质谱仪的使用权限。

致谢

本研究由波兰国家科学中心资助，项目编号为 Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013。作者感谢德国达姆施塔特默克集团（Merck KGaA）旗下 MilliporeSigma 公司提供 SPME 装置。默克集团的生命科学业务在美国和加拿大以 MilliporeSigma 名称运营。同时，作者感谢赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）提供 Q-Exactive Focus Orbitrap 质谱仪的使用权限。作者谨向 Aleksandra Woderska-Jasin 博士致谢。́ska 及比得哥什移植学与普通外科部门的工作人员对本项目提供的帮助表示感谢。BB 要感谢多伦多综合医院的 Janusz Pawliszyn 教授，使其在滑铁卢大学访学期间有机会采集样本。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Merck5330010050流动相添加剂
乙腈Alchem696-34967-4X2.5LHPLC溶剂
乙酸铵Merck5330040050流动相添加剂
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXERBenchmark ScientificBV1010涡旋混合器
瓶盖Perlan Technologies5183-2076蓝色螺纹盖，预切PTFE/硅胶垫片，100个/包
氯仿Merck1024441000
Discovery HS F5 Supelguard 保护柱，3 μm，L × I.D. 2 cm × 2.1 mmMerck567570-UHPLC保护柱
Discovery HS F5，2.1 mm x 100 mm，3 μmMerck567502-UHPLC色谱柱
甲酸Alchem497-94318-50ML流动相添加剂
玻璃小瓶Perlan Technologies5182-0714
HILIC Luna 3 μm，200A，100 x 2.0 mmShim-PolPHX-00D-4449-B0HPLC色谱柱
HILIC SecurityGuard 保护柱，3 μm，4 x 2.0 mmShim-PolPHX-AJ0-8328HPLC保护柱
异丙醇Alchem231-AL03262500HPLC溶剂
甲醇Alchem696-34966-4X2.5LHPLC溶剂
超纯水Merck1037281002HPLC溶剂
Q Exactive Focus 混合四极杆-Orbitrap 质谱仪Thermo ScientificQ Exactive Focus质谱仪
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mmMerck1506570001HPLC色谱柱
SeQuant ZIC-HILIC 保护柱套件 20 x 2.1 mmMerck1504360001HPLC保护柱
SPME LC 纤维探针，混合模式Supelcoprototype fibers
UltiMate 3000 HPLC 系统Thermo ScientificUltiMate 3000HPLC系统
小瓶内插管（去活化）Perlan Technologies5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mmWaters186005644HPLC色谱柱
XSelect CSH C18 VanGuard 保护柱 3.5μm, 2.1x5mmWaters186007811HPLC保护柱

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 8/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.

The third affiliation was updated from:

Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"

to:

Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

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