用于活细胞超分辨率显微镜和单分子示踪的传统BODIPY缀合物

摘要

传统的BODIPY偶联物可通过利用其瞬时形成的、红移的基态二聚体，用于活细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像。本文提供了一种优化的SMLM实验方案，可在纳米尺度上对活体哺乳动物细胞和酵母细胞内的亚细胞中性脂质和脂肪酸进行追踪与高分辨率成像。

摘要

单分子定位显微技术（SMLM）突破了传统荧光显微镜的光学衍射极限，能够以约20 nm的精度解析细胞内结构及生物分子的动力学行为。SMLM的前提是使用能够在暗态与荧光态之间转换的荧光染料，以避免在数千帧数据采集过程中其点扩散函数在时空上的重叠。BODIPY类染料是已被广泛使用的荧光染料，其多种偶联物常用于传统显微成像。BODIPY基态二聚体（D_II）的瞬时形成可产生明亮的单分子发射，从而实现单分子定位显微（SMLM）。本文介绍一种简单且通用的实验方案，可在活酵母细胞和哺乳动物细胞中利用常规BODIPY偶联物进行SMLM成像。该方法可用于获取超分辨率图像，并追踪单个BODIPY-D_II状态，以提取BODIPY偶联物的时空信息。我们应用此方法在纳米尺度上解析了活体酵母和哺乳动物细胞中的脂滴（LDs）、脂肪酸和溶酶体的结构。此外，我们展示了BODIPY染料与其他荧光 探针联用时的多色成像能力。代表性结果揭示了在喂养与饥饿条件下，酵母细胞中BODIPY标记的脂肪酸与中性脂质在空间分布和运动性上的差异。本优化的SMLM实验方案可兼容数百种市售的BODIPY偶联物，为研究超越本研究应用范围的多种纳米级生物学过程提供了有力工具。 

引言

单分子定位显微技术（SMLM），如随机光学重建显微技术（STORM）和光激活定位显微技术（PALM），已成为能够生成超越阿贝光学衍射极限信息的超分辨率图像的方法^1,2 以及用于追踪单个生物分子的动力学行为^3,4单分子定位显微镜（SMLM）兼容探针的要求之一是能够在任意时刻控制活性荧光分子的数量，以避免其点扩散函数（PSF）在空间上重叠。在数千个数据采集帧中的每一帧中，通过拟合各个荧光分子对应的点扩散函数，可将其位置以约20 nm的精度确定。传统上，荧光分子的开关闪烁行为通过随机光致切换进行控制。^1,2,5 或化学诱导的内在闪烁⁶其他方法包括荧光原在短暂结合荧光原激活蛋白后被诱导激活^7,8 以及在全内反射荧光（TIRF）或光片激发下标记DNA寡核苷酸的可编程结合-解离⁹最近，我们报道了一种用于单分子定位显微....

方案

注意：有关酵母克隆和内源性标记，请参见我们最近的出版物¹⁰。

1. 成像用酵母细胞样品的制备

1. 准备一管液体培养的w303酵母菌株过夜培养物。使用无菌木棒，从含有酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖的琼脂平板上取少量酵母细胞，接种至含有约2 mL合成完全葡萄糖（SCD）培养基的培养管中。将培养管置于摇床培养箱中，在30 °C、270 rpm条件下孵育过夜。
2. 将过夜培养的细胞用SCD培养基按1:50比例稀释。继续在30 °C、270 rpm摇床培养箱中培养稀释后的细胞4小时，使其处于对数生长期，并达到约0.6的光密度（OD）。
   注意：此步骤可根据所研究的代谢状态进行调整。BODIPY偶联物并不要求细胞必须处于对数生长期。然而，需注意静止期死细胞可能产生的自发荧光，因其可能导致背景信号过强，从而无法分析单个BODIPY-D_II发射体。
3. 若需研究饥饿状态的细胞，将酵母培养物在不更换培养基的情况下继续培养2天。
4. 在铺板前约30分钟，将带腔室的盖玻片与80 µL浓度为0.8 mg/mL的无菌刀豆球蛋白A（ConA）溶于去离子H₂O中，在室温下孵育。30分钟后，用去离子H₂O清洗盖玻片三次。
5. 在成像前约30分钟，将细胞悬液转移至带腔室的盖玻片中，并加入适量新鲜SCD培养基....

结果

本文基于上述方案，展示了利用 BODIPY 偶联物进行单分子定位显微镜（SMLM）的优化样品制备、数据采集与分析流程（图 1A）。为演示 SMLM 数据采集与分析的工作流程示例，我们在酵母中使用 BODIPY（493/503）实现对光学衍射极限以下脂滴（LDs）的分辨（图 1B-F）。图 2 展示了 BODIPY 与其他探针（如 GFP、mEos2）联用时不同多色成像模式的示例。我们通过在相同培养基中培养约 48 小时以调控酵母的代谢状态，并显示在饥饿条件下，BODIPY-C12 在细胞周边形成非脂滴来源的不动簇，而在营养充足条件下则被整合进脂滴中（图 3）。为进一步拓展 BODIPY 偶联物在哺乳动物细胞中的 SMLM 应用能力，我们在活的 U2OS 细胞中对 BODIPY-C12 与 LysoTracker-green 进行成像（

讨论

在本实验方案中，我们展示了如何利用传统的BODIPY偶联物获得空间分辨率提高一个数量级的单分子定位显微成像（SMLM）图像。该方法基于利用先前报道的、通过双分子相互作用瞬时形成的传统BODIPY染料的红移D_II态。这些状态可通过红移波长进行特异性激发和检测，且其稀疏性和短暂性足以满足SMLM的要求。通过调节BODIPY单体的浓度以及激光参数，可实现最佳的定位密度和信噪比。我们在营养充足和饥饿条件下，以约30 nm的分辨率（基于理论Thompson公式）解析了活酵母细胞内脂肪酸类似物和中性脂质的分布与运动特性。我们还发现，在20 Hz的数据采集条件下，约40%的BODIPY D_II态可持续存在两个或更多成像帧，从而实现了单分子追踪，可用于量化不同条件下的分子运动性。我们的结果揭示了饥饿状态下BODIPY-FAs在定位和运动性方面的差异，并提示了一种对抗脂毒性损伤的保护机制。我们能够追踪单个BODIPY分子，并在不同代谢状态下突破光学衍射极限，解析脂滴（LDs）和BODIPY-FA 点状结构的尺寸，这只有通过开发传统BODIPY偶联物的SMLM能力才能实现。脂肪酸分布与摄取过程中涉及的精.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BODIPY C12	ThermoFisher	D3822	绿色脂肪酸类似物
BODIPY C12 Red	赛默飞世尔科技	D3835	红色脂肪酸类似物
BODIPY(493/503)	ThermoFisher	D3922	中性脂质标记物
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2010	细胞在玻璃表面的固定
无氮碱基完全培养基混合物	US Biological	D9515	用于SCD的氨基酸
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021	SCD的碳源
八孔板	Cellvis	C8-1.58-N	带腔盖玻片
八孔，Lb-Tek II	Sigma-Aldrich		带腔室的盖玻片
ET525/50	染色		带通滤光片
ET595/50	色度		带通滤光片
ET610/75	色度		带通滤光片
胎牛血清（FBS）	Gibco	26140079	血清
FF652	Semrock		分束器
FF731/137	Semrock		带通滤光片
FluoroBrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	细胞培养基
Hal4000	庄实验室，哈佛大学		数据采集软件
Ixon89Ultra DU-897U	Andor		用于光子探测的EMCCD相机
激光 405、488、561、640 nm	CW-OBIS		用于激发的激光器
Insight3	庄实验室，哈佛大学		单分子定位软件
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081	细胞培养所需氨基酸
活细胞成像溶液	赛默飞世尔科技	A14291DJ	成像缓冲液
Lysotracker Green	ThermoFisher	L7526	基于Bodipy的溶酶体标记物
哺乳动物 ATCC U2OS 细胞（Manassas, VA）	Dr. Jochen Mueller（明尼苏达大学）
尼康-CFI Apo 100 1.49 数值孔径	尼康		油浸物镜
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	抗生素
丙酮酸钠	Gibco	11360-070	细胞培养补充剂
T562lpxr	染色		分束器
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400-054	贴壁细胞的解离
W303 MATa 菌株	Horizon-Dharmacon	YSC1058	亲本酵母菌株
酵母氮源基础培养基	Sigma-Aldrich	Y1250	不含氨基酸的氮源基础培养基
zt405/488/561/640rdc	染色		四波段二向色镜