方法文章

用于活细胞超分辨率显微镜和单分子跟踪的传统 BODIPY 结合物

DOI：

10.3791/60950

⸱

2020年6月8日

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1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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传统的BODIPY结合物可用于活细胞单分子定位显微镜（SMLM），其瞬时成型、红移地面状态变暗器。我们提出了优化的SMLM协议，以跟踪和解决活哺乳动物和酵母细胞中的亚细胞中性脂质和脂肪酸在纳米长度尺度上。

摘要

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单分子定位显微镜（SMLM）技术克服了传统荧光显微镜的光衍射极限，能够以±20nm的精度解决细胞内结构和生物分子的动态。SMLM 的先决条件是荧光器，它从黑暗状态过渡到荧光状态，以避免其点扩散函数在数千个数据采集帧中每个帧中的分时重叠。BODIPYs 是成熟的染料，在传统显微镜中使用大量结合物。红移BODIPY地面状态变暗器（DII）的瞬态形成导致明亮的单分子发射，使单分子局部显微镜（SMLM）成为可能。在这里，我们提出了一个简单但通用的SMLM协议与传统的BODIPY结合在活酵母和哺乳动物细胞。此过程可用于获取超分辨率图像并跟踪单个 BODIPY-DII状态，以提取 BODIPY 偶联的时空信息。我们应用这个程序来解决脂质滴（LDs）、脂肪酸和在纳米长度尺度上活的酵母和哺乳动物细胞中的脂质脂滴（LD）、脂肪酸和淋索体。此外，我们演示了 BODIPY 染料与其他荧光探头结合使用时的多色成像功能。我们的代表性结果表明，在喂养和禁食条件下，酵母中BODIPY脂肪酸和中性脂质的空间分布和流动性存在差异。这种针对 SMLM 的优化协议可用于数百种商用 BODIPY 偶联，是研究纳米尺度生物过程的有用资源，远远超出本工作的应用范围。

引言

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单分子定位显微镜（SMLM）技术，如随机光学重建显微镜（STORM）和光活化定位显微镜（PALM），已成为生成超分辨率图像的方法，其信息超过Abbe的光衍射极限11，2，2并跟踪单生物分子33，44的动态。与 SMLM 兼容的探头要求之一是能够随时控制活动荧光波的数量，以避免其点差函数 （PSF） 的空间重叠。在数千个数据采集帧中，通过安装其相应的点扩散功能，确定每个荧光荧光波的定位，精度为±20 nm。传统上，氟脑的开离闪烁是通过随机光切换11，2，52,5或化学诱导的内在闪烁6加以控制。其他方法包括荧光原在瞬态结合时诱导激活氟原蛋白77、8，8以及标记的DNA寡聚物在总内部反射荧光（TIRF）或光片激发9中的可编程结合。最近，我们报道了SMLM10的新颖....

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方案

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注:关于酵母克隆和内源性标记，请参阅我们最近的出版物10。

1. 制备用于成像的酵母细胞样品

  1. 准备w303酵母菌株的液体过夜培养。使用无菌木棍，从含有酵母提取物的a加盘（peptone_dextrose）中发现少量酵母细胞，放入含有±2 mL合成完整脱脂（SCD）介质的培养管中。在 270 rpm 和 30°C 的摇摇培养箱中孵育管过夜。
  2. 在 SCD 中执行 1:50 的细胞稀释。在270 rpm的摇动培养箱中，在30°C下继续培养稀释细胞4小时，使细胞在指数相中生长，达到±0.6的光学密度（OD）。
    注:根据正在研究的代谢状态，该过程可能在这里有所不同。BODIPY偶联不需要细胞在指数生长阶段。然而，要认识到在静止阶段死细胞的自荧光，因为它可能导致背景信号太强，无法分析单个BODIPY-DII发射器。
  3. 研究禁食细胞，在不交换介质的情况下，将酵母培养菌培养2天。
  4. 在电镀细胞前约30分钟，在室温下以去离子H2O孵育80μL0.8mg/mL无菌康卡瓦林A（ConA）的室盖玻璃。30分钟后，用去离子H2O清洗盖玻璃三次。
  5. 在成像前约30分钟，将室盖玻璃上的细胞移液，以正确的新鲜SCD体积，达到±0.12的光学密度（通常在OD+0.6 μL SCD下培养60μL酵母培....

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结果

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在这里，我们提出了基于上述协议（图1A）的基于BODIPY偶联的SMLM优化的样品制备、数据采集和分析程序。为了演示获取和分析 SMLM 数据的工作流示例，我们在酵母中使用 BODIPY （493/503） 来解决光学衍射限制以下的 LD（图 1B-F）。图2显示了BODIPY与其他探测器（如GFP、mEos2）不同的多色成像模式的示例。我们操纵酵母的代谢状态，将它们在同一介质中生长，持续约48小时，并表明BODIPY-C12在禁食时形成细胞外围的非LD聚类，而它们在喂食条件下与LD的合并形成鲜明对比（图3）。为了进一步将BODIPY结合的SMLM功能扩展到哺乳动物细胞，我们拍摄了活U2OS细胞中的BODIPY-C12和LysoTracker-Green（图4）。

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讨论

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在此协议中，我们演示了如何使用传统的 BODIPY 偶联来获取具有空间分辨率级级改进的 SMLM 图像。该方法基于利用先前报告的红色移位DII状态的传统BODIPY染料，这些状态通过双分子接触暂时形成。这些状态可以特别兴奋和检测与红色偏移波长，是稀疏和短寿命足以SMLM。通过调整 BODIPY 单体与激光参数的浓度，可实现本地化和噪声到噪声的最佳密度。在喂养和禁食条件下，我们解决了脂肪酸类比和中性脂质在食用和禁食条件下以±30 nm分辨率（理论汤普森公式）在活酵母细胞中的细胞内分布和流动性问题。我们还发现，在 20 Hz 时，约 40% 的 BODIPY DII状态保持两个或多个数据采集帧，使单分子跟踪能够量化其在不同条件下的移动性。结果表明，BODIPY-FA在禁食时具有差异定位性和流动性，并提出了防止脂毒性的保护机制。只有通过传统BODIPY偶联的SMLM能力，我们才能跟踪单个BODIPY分子并解决不同代谢状态下光衍射限以下的LD和BODIPY-FA puncta的大小。脂肪酸分布和摄入的空间调节所涉及的确切分子机制和途径是我们未来研究的主题。此外，我们通过解决U2OS细胞中的BODIPY.......

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披露

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作者声明没有相互竞争的利益。

致谢

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本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持，编号为R21GM127965。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BODIPY C12ThermoFisherD3822绿色脂肪酸类似物
BODIPY C12 红色ThermoFisherD3835红色脂肪酸类似物
BODIPY（493/503）ThermoFisherD3922中性脂质标志物
伴刀豆球蛋白 ASigma-AldrichC2010玻璃表面的细胞固定
脱落混合物 完全无氮碱US BiologicalD9515用于 SCD 的氨基酸
葡萄糖Sigma-AldrichG7021用于 SCD 的碳源
八孔CellvisC8-1.58-N腔室盖玻片
八孔，Lb-Tek IISigma-Aldrich腔室盖玻片
ET525/50色度带通滤光片
ET595/50色度带通滤光片
ET610/75Chroma带通滤光片
胎牛血清 （FBS）Gibco26140079血清
FF652Semrock分束器
FF731/137Semrock带通滤光片
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701细胞培养基
哈佛大学数据采集软件
Ixon89Ultra DU-897U用于光子检测Andor
用于激发的激光器 405、488、561、640 nmCW-OBIS激光器 用于激发
Insight3哈佛大学单分子定位软件
L-谷氨酰胺Gibco25030-081细胞培养所需的氨基酸
活细胞成像溶液ThermoFisherA14291DJ成像缓冲液
Lysotracker GreenThermoFisherL7526基于 Bodipy 的溶酶体标志物
哺乳动物 ATCC U2OS 细胞（弗吉尼亚州马纳萨斯）Jochen Mueller 博士（明尼苏达大学）
尼康-CFI Apo 100 1.49 N.A尼康油浸目标
青霉素 链霉素Gibco15140-122抗生素
丙酮酸钠Gibco11360-070细胞培养补充剂
T562lpxr色度分束器
胰蛋白酶-EDTAGibco15400-054贴壁细胞的解离
W303 MATa 菌株Horizon-DharmaconYSC1058亲本酵母菌株
酵母氮碱Sigma-AldrichY1250不含氨基酸的氮碱
zt405/488/561/640rdcChroma四频二向色镜
Hal4000 庄实验室 的 EMCCD 相机的激光器 庄实验室

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.

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BODIPY C12

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