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方法文章

使用自动化食物摄入监测系统进行大鼠蔗糖偏好与新奇性诱导进食减少测试

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DOI：

10.3791/60953

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2020年5月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Department for Psychosomatic Medicine, Charité-Universitätsmedizin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin and Berlin Institute of Health, 2Department of Internal Medicine, Helios Clinic, 3Department of Psychosomatic Medicine and Psychotherapy, University Hospital Tübingen, 4Department of Quantitative Health Sciences, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种研究大鼠抑郁样行为和快感缺失行为的实验方案。该方案结合了两种成熟的动物行为学方法——蔗糖偏好实验和新环境诱导的进食抑制实验，并利用自动化食物和液体摄入监测系统，通过替代性参数间接评估啮齿类动物的行为表现。

摘要

全球范围内，抑郁障碍的患病率和发病率正在上升，影响约3.22亿人，凸显了在动物模型中开展行为学研究的必要性。本实验方案结合了成熟的蔗糖偏好测试和新环境诱导的进食减少测试，并联合使用自动化食物和液体摄入监测系统，用于研究大鼠的类抑郁行为和快感缺失行为。在测试前，蔗糖偏好实验范式中，雄性大鼠需接受至少2天的训练，以适应在饮用自来水的同时摄入蔗糖溶液。测试期间，大鼠再次暴露于水和蔗糖溶液中，摄入量由自动化系统每秒记录一次。蔗糖摄入量占总液体摄入量的比例（即蔗糖偏好比）是评估快感缺失的替代指标。在新环境诱导的进食减少测试中，雄性大鼠需经历一个训练阶段，在此期间接触一种可口的零食。训练过程中，啮齿类动物会形成稳定的基线零食摄入量。测试当天，动物从饲养笼转移至一个全新的空笼，该环境为陌生环境，但提供已知的可口零食。自动化系统记录总摄入量及其微观结构（例如接近零食的潜伏期），从而揭示快感缺失和焦虑样行为。将上述实验范式与自动化测量系统相结合，可提供更详细的信息，并通过减少测量误差提高准确性。然而，这些测试依赖于替代性指标，仅能间接反映抑郁和快感缺失状态。

引言

全球平均有4.4%的人口受到抑郁症的影响，相当于全球约3.22亿人，与十年前相比上升了18%1。根据世界卫生组织的估计，到2020年，抑郁症将在伤残调整生命年（Disability Adjusted Life Years）排名中位列第二2。为了应对情感障碍日益增长的患病率并建立新的干预策略，有必要进一步研究这一行为。在开展人类研究之前及同时，动物实验是必不可少的。

已有多种模型被建立用于研究抑郁行为的组成部分（例如强迫游泳实验、悬尾实验、蔗糖偏好实验和新奇环境诱导的进食减少实验）3,4。蔗糖偏好实验（SPT）和新奇环境诱导的进食减少（NIH）能够检测动物的类抑郁行为。这些实验本身并不会在啮齿类动物中诱发真正的抑郁状态，而是反映行为上的急性变化。SPT和NIH均用于评估抑郁的一个特征性表现——快感缺失（anhedonia），即个体对原本令人愉悦的活动失去兴趣，表现为对奖励性活动的兴趣减退5，以及对奖赏处理与反应这一复杂现象中某一层面的障碍6。这两个实验均通过可口食物作为奖赏性刺激来研究动物的反应。摄食量的多少被用作评估快感缺失的替代指标7,8,9。

用于研究快感缺失的测试的价值在很大程度上取决于对物质重量进行精确实测后所确定的消耗量的准确性。传统上，该测量在测试前和测试后各手动进行一次。然而，由于多种原因，这种方法容易产生测量误差。首先，啮齿类动物有贮藏食物的习性，即它们会将食物移走但并不立即食用，而是将其藏在安全的地方。因此，这种食物的丢失可能被错误地计入总消耗量的计算中。其次，大鼠在进食和饮水过程中会洒落食物和水，导致重量减少但并未实际消耗。第三，由于在将瓶子插入和取出笼子时的操作，会导致液体的非故意损失。

为了减少这些误差来源，我们将两种常用的快感缺失评估方法（SPT3,4 和 NIH9）与自动化食物和液体摄入监测系统相结合，用于测量食物和水的摄入量。该方法可准确研究大鼠对可口物质的摄取情况，同时提供有关其愉悦体验的信息，作为抑郁样行为的一个特征。上述与人工测量相关的误差通过不同的方法得以降低，具体细节将在后文详细说明。

为了提供有关微结构的信息，本方案中使用的自动化摄食监测系统10每秒称量一次食物重量（±0.01 g）。因此，稳定的重量记录为“未进食”，不稳定的重量记录为“正在进食”。“一次摄食事件”（bout）定义为某一事件发生前后稳定重量的变化。一餐由一个或多个摄食事件组成，在大鼠中定义其最小重量为0.01 g。在大鼠中，两餐之间以15分钟为间隔（标准化值）。因此，当摄食事件在15分钟内发生，且重量变化等于或大于0.01 g时，即视为同一餐。本方案评估的进餐参数包括进餐持续时间、进餐总时间、摄食事件量、摄食事件持续时间、摄食事件总时间、首次摄食事件的潜伏期以及摄食事件次数。

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方案

动物饲养和实验操作遵循特定的机构伦理准则，并经国家动物研究主管部门批准。

1. 自动监测系统的操作

注意：操作自动监测系统时，必须在执行每个操作前立即在软件包含的注释框中记录该操作。应在注释框中输入描述内容，然后点击保存，系统将附带特定时间点保存该记录。由于系统为连续记录，分析数据时这些时间点至关重要，必须明确标注感兴趣的分析时段。

  1. 安装、使用与维护自动化监测系统
    注意：本实验方案使用体重为250–300 g（约10周龄）的成年雄性Sprague Dawley大鼠。建议在适应期期间以群养方式饲养大鼠。环境条件应严格控制，参数如下：12 h/12 h明暗循环（光照于上午6:00开启）、湿度45%–65%、温度21–23 °C。 随意摄取 可自由获取水和标准啮齿类动物饲料。每日进行抓取操作，使动物逐渐适应研究人员。
    1. 将大鼠分开饲养，确保每只动物单独置于一个笼子中。在整个实验过程中保持每只大鼠的隔离状态。
    2. 在笼具中铺入常规垫料，厚度为1–2 cm。此（减少的）用量可降低垫料溢出污染微量天平和料斗的可能性，从而减少测量误差。添加塑料管（例如，一段长20 cm、直径8 cm的塑料排水管）和啃咬木作为环境丰富化材料，但省去纸巾以减少测量误差。
    3. 通过将两个带有微天平的封闭式笼架安装到笼子前侧定制的孔中，准备用于自动测量固体和液体食物摄入量的笼具。在笼架上放置两个空的料斗，一个用于饲料，另一个用于瓶子。
      注意：微量天平通过电缆连接至计算机上的记录系统，且相应的软件已安装在计算机中。
    4. 开始记录时，打开“监测”并按下“开始”，然后选择一个位置来保存数据。
    5. 使用校准功能（按“校准通过自动采食量监测系统功能，每次校准需移除料斗，并在笼架上的天平放置两个不同标准砝码进行校准。应定期（建议每周）执行此操作。.
    6. 将一个料斗完全装满饲料（约100 g），并剔除尺寸过小的饲料碎片和碎屑。向水瓶中注入水（约100 mL），并将其放入另一个料斗中。
    7. 记录食物和水的位置（例如，天平1：动物1的食物，天平2：动物1的水）。
    8. 将大鼠放入笼中，并打开笼具的所有通道，使其能够进食和饮水 随意摄取.
      注意：为了获得准确的测量结果，必须每天对天平和料斗进行维护，使用毛刷轻轻清理洒出的饲料，并清除饲料容器中的细小食物残渣。这将显著减少测量误差。日常维护期间，请关闭所有闸门。
  2. 实验结束后获取数据
    1. 在评论框中搜索需要分析的时段（如训练期、测试期）的起始和结束时间点。
    2. 点击“查看数据”在软件中打开数据查看器。
    3. 将时间点填入下方的方框中开始时间” 和 “结束时间按下左上角显示已记录信息的天平图标。
    4. 点击“PSC 总计”以访问微观结构数据。按下按钮“导出 PSC 表格”以导出数据。
      注意：若要使用自动监测来比较个体动物（例如，未受应激与受应激动物）的微结构，可在“数据查看器 通过按左上角相应的方框。 PSC 总计 仅显示所选动物的显微结构。该系统无法进行统计分析，数据需导出至电子表格程序或分析软件中进行处理。

2. 糖水偏好实验的实施

  1. 进行训练阶段
    注意：测试前，需使动物适应通过笼门在食槽处接触两个液体瓶的环境，同时食物应从笼顶供给（设置方式如图所示）。 图1。该训练期应至少持续2天，需在动物饲养房间内的饲养笼中进行。
    1. 关闭所有闸门。从微量天平上取下水瓶和食物容器。
    2. 将预先称重的食物（约50 g）放置于笼顶，每日使用常规天平称量并记录其重量，以评估每日食物消耗量。必要时补充食物。
    3. 用清水清洗瓶子，并重新加入约100 mL水。将瓶子放回料斗上。
    4. 用一个干净的瓶子装入100 mL新配制的1%蔗糖溶液，置于进样漏斗上。
      注意：仔细标记瓶子并记录其位置（例如，天平1：水 动物1，天平2：蔗糖溶液 动物1）。
    5. 打开所有闸门。在监测系统中记录训练开始时间。将闸门保持开启状态24小时，结果导致 随意摄取 24小时后关闭闸门，并记录训练结束。可通过插入“自动化监测系统”来评估24小时间隔内的数据。开始时间” 和 “结束时间当评估1小时测试间隔时，操作步骤相同。
    6. 每24小时清洁并更换瓶子一次。每天配制新鲜的1%蔗糖溶液。每天交换水瓶与蔗糖溶液瓶的位置，以避免习惯化效应。
      注意：对所有动物的训练应持续至少48小时，直至偏好比率达到约1。训练结束后立即使用“数据查看器其计算方式为蔗糖摄入量与总摄入量（水和蔗糖摄入量之和）的比值。
    7. 测试前24小时，移除蔗糖溶液瓶，使大鼠仅可接触标准饲料和水。
    8. 准备一个装有约100 mL自来水的新鲜瓶子和一个装有约100 mL 1%蔗糖溶液的瓶子。
    9. 测试前，请关闭所有闸门。
    10. 从漏斗中取出装有自来水的瓶子，将两个新瓶子放在漏斗上，其中一个装有自来水，另一个装有1%蔗糖溶液。
    11. 打开所有闸门，在监测系统中记录测试开始时间。保持闸门开启状态60分钟。60分钟后关闭闸门，并在监测系统中记录测试结束时间。
    12. 评估数据（例如，蔗糖/总液体摄入量比率）。
      注意：该测试可重复进行多次，每次之间需安排训练间隔（至少2天）。

3. 新颖性诱导的进食抑制实验的实施

  1. 进行训练阶段
    注意：测试前建议进行为期5天、每天30分钟的训练（设置如图所示） 图2目的是在实验前使动物对可口零食的摄入量达到稳定的基线水平。该过程在动物饲养房间内的饲养笼中进行。
    1. 关闭所有闸门，移除装有标准饲料的料斗。
    2. 用适口性零食（约 50 g）填装一个新的料斗。小心地将饼干放入料斗中，防止碎裂。将料斗安装在位于微量天平上方的笼具支架上。
    3. 打开闸门30分钟，使大鼠能够 随意摄取 获得零食和水的权限。在监测系统中记录训练的开始时间。
      注意：在训练期间，大鼠不应接触标准饲料。
    4. 30 分钟后关闭闸门，并在监测系统中记录训练结束。将零食替换为标准饲料。
    5. 每天重复此操作，直至达到：1）稳定的基线可口零食摄入量（例如，1.5–2.0 g/30 min）；且 2）训练日之间的摄入量无统计学差异。
  2. 进行新奇环境诱导的进食抑制测试
    1. 准备一个空的、 freshly cleaned 笼子，不加垫料或 enrichment，连接到自动食物摄入监测系统。在笼子的安装位置放置一个装有自来水瓶的饲喂器和一个装有可口零食的饲喂器。
      注意：新笼子应放置在饲养大鼠和进行训练的同一房间内。保持笼门关闭。
    2. 将大鼠从饲养笼中取出，放入新环境笼中。
    3. 打开所有闸门30分钟。在监测系统中记录测试开始时间。
      注意：在30分钟的零食摄取时间内，使用自动食物摄取监测系统记录零食摄入量及相关的微观结构参数（如首次进食的潜伏期）。
    4. 30 分钟后关闭闸门，记录测试结束时间，将大鼠放回饲养笼中。
      注意：该测试可在训练间隔（至少5天）后重复进行多次。

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结果

为检验数据分布，采用 Kolmogorov-Smirnov 检验。当数据呈正态分布时使用 t 检验，否则使用 Mann-Whitney-U 检验。对于符合正态分布的多组比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验；对于非正态分布的情况，则采用单因素方差分析结合 Dunn 多重比较检验。当 p < 0.05 时，认为组间差异具有统计学意义。

本研究对未经处理的大鼠进行了糖水偏好实验（SPT）。在训练期间，大鼠对糖水溶液的消耗量增加，而对水的摄入量减少（图3）。训练第一天，大鼠饮用糖水溶液量为24.40 mL ± 3.48 mL（图3A），饮用普通水量为4.83 mL ± 0.89 mL（图3B），糖水偏好比为0.80 ± 0.06（图3C）。训练第二天，大鼠对糖水溶液的消耗量增加至33.7...

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讨论

蔗糖偏好实验和新奇环境诱导的进食减少实验是评估大鼠快感缺失的两种成熟技术。结合自动化食物摄入监测系统，可对未受干扰的大鼠进行更详细的分析，并减少测量误差。

通过多种方法可降低误差发生率。首先，为解决因洒落造成的误差，在食斗与门之间留有间隙，使得啃食过程中产生的碎屑可落入集成托盘中。这些洒落的饲料被收集在笼具支架上，因此仍包含在测量范围内（由于洒落物仍在天平上，不会影响测量结果）。其次，为防止动物囤积食物，大鼠笼具支架的开口设计为足够大，使动物能够将头部伸入开口内从食斗进食，但又足够小，以限制动物在进食时使用前爪，从而限制其取出食物并带入笼内的能力。

第三，该系统减少了液体的非故意损耗，因为液体瓶在预灌注后不会泄漏，且在精密不锈钢球与吸管接口处仅发生缓慢的蒸发（约<10 mg/h）。此外，由于系统可自动称量瓶子，记录过程中无需人工操作瓶子，从而避免了因人工操作瓶子而常导致的误差。手动测量与自动测量之间比较所观察到的差异（表1）可能源于人工操作瓶子时的非故意损耗。

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披露

A.S. 担任 a & r Berlin、Boehringer-Ingelheim、Takeda 和 Schwabe 的顾问。不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了德国研究基金会（STE 1765/3-2）和夏里特大学基金（UFF 89/441-176，A.S.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组装 LH 笼具支架 - RAT-FOOD - 包含不锈钢笼具支架、料斗、阻隔器、连接件Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCMPRF01
未连接的 LH 笼具支架组件 - RAT-FOOD - 包含不锈钢笼具支架、料斗、阻隔器、未连接适配器、连接件Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCMUPRF01
带两个开口的笼具 - RAT - 定制改装笼具 - 包含笼盖和标准水瓶Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCR02单只饲养
数据采集笔记本电脑 Windows 系统 - 配置 BioDAQ 软件Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABLT003
环境丰富材料（塑料管、啃咬木块）由动物设施分发
HoneyMaid 玛氏饼干碎Nabisco, East Hanover, NJ, USAASIN: B01COWTA98NIH 测试用适口性零食
低振动聚合物支架Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABRACKR
雄性 Sprague Dawley 大鼠Envigo订单编号: 002
型号 #2210 32 通道 BioDAQ 中央控制器 - 包含电缆和校准套件Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCC32_03
外周传感器控制器 - 包含电缆Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABPSC01
SigmaStat 3.1Systat Software, San Jose, CA, USA统计分析
不锈钢阻隔器Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABBLKR
标准啮齿类动物饲料，含 10 kcal% 脂肪Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USAD12450B
蔗糖粉末Roth4621.1用于 SPT

参考文献

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