一种由压力超负荷诱导的中度心室重构和收缩功能障碍大鼠模型，区别于明显的收缩性心力衰竭

摘要

我们描述了一种由压力超负荷诱导产生中度心室重构和早期收缩功能障碍的大鼠模型，该模型可激活参与重构过程起始阶段的信号转导通路。该动物模型将有助于识别心力衰竭早期治疗性抗重构策略的分子靶点。

摘要

在心肌梗死、长期高血压或接触心脏毒性物质等损伤刺激下，心脏最初会通过激活信号转导通路进行代偿，以在短期内抵消心肌细胞丢失和（或）心壁应力增加的影响。然而，这些通路的持续激活将产生有害作用，引发并促进心脏重构，导致左心室几何结构改变及左心室容积增大；这一表型常见于收缩性心力衰竭（HF）患者。本文介绍通过使用内径面积为2 mm²的血管夹对升主动脉进行结扎（AAB），建立大鼠压力超负荷诱导的中度心脏重构及早期收缩功能障碍（MOD）模型的方法。手术在体重200 g的Sprague-Dawley大鼠中进行。MOD HF表型在AAB术后8–12周逐渐形成，并可通过超声心动图进行无创评估。既往研究表明，MOD HF表型中存在信号转导通路的激活、基因表达改变以及蛋白质的翻译后修饰变化，这些特征与人类收缩性心力衰竭中的变化相似；因此，MOD HF表型可作为转化研究的合适模型，用于识别和验证HF中潜在的抗重构治疗靶点。与明显的收缩性HF表型相比，MOD HF表型的优势在于能够识别参与早期心脏重构过程的分子靶点，并允许在疾病早期实施治疗干预。其局限性在于可能无法完全模拟导致人类收缩性HF的多种疾病谱。此外，该表型的建立具有挑战性，因为AAB手术伴随较高的死亡率和失败率，仅有约20%的手术大鼠能够成功形成目标HF表型。

引言

心力衰竭（HF）是一种常见疾病，与高发病率和高死亡率相关¹。通过升主动脉或横主动脉缩窄建立的啮齿类动物压力超负荷（PO）HF模型，常用于探索导致HF的分子机制，并检验HF中潜在的新型治疗靶点。这些模型还能模拟由长期系统性高血压或严重主动脉瓣狭窄继发的人类HF所呈现的变化。PO发生后，左心室（LV）壁逐渐增厚，这一过程称为向心性左心室肥厚（LVH），是为代偿和适应LV壁应力增加而产生的反应。然而，这一过程伴随多种不良适应性信号通路的激活，导致钙循环与稳态紊乱、代谢改变、细胞外基质重构、基因表达变化以及细胞凋亡和自噬增强^2,3,4,5,6。这些分子变化构成了心肌重构启动与进展以及向失代偿性HF表型转化的触发因素。

尽管使用了近交系啮齿类动物，并对夹闭装置的尺寸和手术技术进行了标准化，但在主动脉缩窄模型中，左心室腔的结构和功能仍存在巨大的表型变异性^7,8,9。大鼠Sprague-Dawley品系在压力超负荷（PO）后所出现的表型变异性已在其他文献中有所描述^10,11。其中可观察到两种心力衰竭（HF）表型，均伴有心肌重构以及信号转导通路的激活，导致氧化应激水平升高。这一状态与代谢重构、基因表达改变以及蛋白质翻译后修饰的变化相关，共同参与了重构过程^10,12。第一种为中度重构伴早期收缩功能障碍表型（MOD），第二种为明显收缩性心力衰竭表型（HFrEF）。

与心肌梗死（MI）心力衰竭模型相比，压力超负荷（PO）心力衰竭模型具有优势，因为PO诱导的周向和子午向心肌壁应力在心肌所有节段中均呈均匀分布。然而，这两种模型均存在PO严重程度的变异性^10,11，以及MI模型中梗死面积的变异性^13,14，同时伴有梗死部位明显的炎症和瘢痕形成¹⁵，以及MI模型中常见的心脏与胸壁及周围组织的粘连。此外，大鼠PO诱导的心力衰竭模型构建困难，因其伴随较高的死亡率和手术失败率¹⁰，仅有20%的手术大鼠可发展为中度心力衰竭（MOD HF）表型¹⁰。

舒张功能障碍型心力衰竭（MOD）是一种具有吸引力的心力衰竭表型，它是传统射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）表型的进一步发展，因其允许早期靶向干预在心肌重构中起关键作用的信号转导通路，尤其是在线粒体动力学与功能、心肌代谢、钙循环以及细胞外基质重构发生紊乱的情况下。这些病理生理过程在MOD心力衰竭表型中表现尤为显著¹¹。在本文中，我们描述了如何建立MOD和HFrEF两种心力衰竭表型，并讨论了在实施升主动脉缩窄（AAB）手术过程中可能遇到的陷阱。此外，我们还详细阐述了如何通过超声心动图对MOD和HFrEF两种心力衰竭表型进行最佳表征，以及如何将它们与其他未能发展为严重压力负荷（PO）的表型，或虽发展为严重PO和向心性重构但无明显离心性重构的表型相区分。

方案

本文所述所有方法和操作程序均已获得杜兰大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. AAB 模型构建的工具与仪器

1. 准备消毒剂，例如 70% 异丙醇和聚维酮碘。
2. 准备用于麻醉的氯胺酮和赛拉嗪，以及用于镇痛的丁丙诺啡。
3. 准备加热垫和尺寸为 18 英寸 × 30 英寸的高吸水性一次性护理垫。
4. 准备 100% 纯棉绳卷、胶带和毛发修剪器。
5. 准备一块 20 cm × 25 cm 的塑料板，厚度范围为 3–5 mm。
6. 准备 Z-LITE 光纤照明仪。
7. 准备适用于小型动物的机械呼吸机（例如 SAR-830/AP）。
8. 准备 2-0 和 3-0 Vicryl 圆锥形缝合线、3-0 尼龙单股缝合线、无菌纱布垫、无菌超大棉签和无菌手套。
9. 准备用于插管的 16 G 血管套管。
10. 购买以下手术器械。
    1. 准备 Weck 不锈钢止血夹结扎器及不锈钢结扎夹。
    2. 准备硬化精细虹膜剪。
    3. 准备 Adson 镊子。
    4. 准备两把弯型 Graefe 镊子。
    5. 准备 Halsted-Mosquito 止血钳（直型）。
    6. 准备 Mayo-Hegar 持针器。
    7. 准备带钝齿的 Alm 胸部牵开器。
11. 使用并准备高压灭菌器和干热灭菌器（ bead sterilizer）。

2. 升主动脉缩窄手术操作

1. 通过腹腔注射75-100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪的混合物对动物进行麻醉。
   注意：需等待数分钟，直至动物完全镇静且肌肉松弛。若麻醉剂量不足，动物仍在笼内活动，应间隔足够时间（约5-10分钟）后，再次注射相同剂量的麻醉剂。大多数动物需注射1-2次方可达到深度镇静与麻醉状态。
2. 剃除位于右侧腋下右胸侧手术区域的毛发。
3. 用胶带轻轻将动物四肢固定在塑料板上以保持稳定。随后使用16 G套管针进行气管插管。动物成功插管后，以潮气量2 mL、频率50次/分钟、吸氧浓度FiO₂₂ 21%。观察每次呼吸时胸壁是否对称抬起。
4. 将动物缓慢翻转至左侧卧位，然后将尾巴弯成U形，并用胶带轻轻固定在塑料板上以保持稳定。随后，对剃毛区域进行消毒，局部涂抹聚维酮碘。 
5. 在切口前，以体积比1:1混合1-2%利多卡因与0.25-0.5%布比卡因，在切口部位皮内浸润，作为预先镇痛措施。
6. 在右侧腋窝区域距右腋窝下方1 cm处，做一长度为1-2 cm的横向皮肤切口。随后分离胸肌层，直至暴露胸廓肋骨。在第2肋骨之间做1 cm的开胸切口。^nd 和 3^rd 肋骨笼
   1. 解剖胸部肌肉层时，需小心操作，避免损伤位于右侧腋窝下方的右腋动脉。
      注意：在第1肋间进行开胸手术^st 以及 2^nd 肋骨可能带来将右头臂动脉而非升主动脉套扎的风险。在第3肋间进行开胸术^rd 第四肋使得升主动脉的观察和套扎变得困难，因为操作者此时面对的是右心房。
      注意：避免将胸廓切口过度向内侧延伸至胸骨，以防分离和损伤右侧内乳动脉。
7. 轻柔地分离胸腺的两个叶，并将其向两侧推开。然后辨认升主动脉，使用弯头格雷费钳通过钝性分离将其从上腔静脉中游离出来。
   注意：对胸腺的过度操作会导致其肿胀，从而难以观察升主动脉。
   1. 用额外的谨慎将上腔静脉从主动脉分离，以避免损伤或破裂上腔静脉，后者可导致致命后果。这可能是该操作中最困难的部分，即使在经验最丰富的操作者中也可能偶尔发生，但在初学者和学习者中更为常见。
8. 用弯头格雷费镊子轻轻提起升主动脉，并将血管夹置于升主动脉周围。
   1. 通过预切割的塑料部件调节血管止血夹结扎工具 7" 获取一段血管夹，其所需的内径面积为1.5 mm² 或 2 mm²，具体取决于所需的HF模型。
9. 使用Vicryl 2-0单丝缝线缝合胸腔。然后使用3-0 Vicryl锥形缝线缝合胸部肌肉层。最后使用Nylon 3-0单丝缝线缝合皮肤切口。
10. 手术完成后，给予以下药物组合，持续48–72小时，以在术后期间提供镇痛：1) 皮下注射布托啡诺（Buprenorphine）0.01–0.05 mg/kg，每8–12小时一次；2) 皮下注射美洛昔康（Meloxicam）2 mg/kg，每12小时一次；3) 根据需要，皮下注射吗啡（Morphine）2.5 mg/kg，每2–4小时一次，用于缓解重度疼痛。
    注意：将动物留在加热垫上，在常规监测下恢复。当动物表现出麻醉恢复迹象（能够自主呼吸——无喘息或使用辅助呼吸肌超过两分钟的现象——且反射良好，四肢红润温暖）时，拔除气管插管并将动物放回笼中。

3. 超声心动图

1. 通过腹腔注射80-100 mg/kg的氯胺酮对动物进行镇静。确保充分镇静，以获得高质量的超声心动图图像。
   注意：不建议使用异氟烷作为麻醉剂，因其具有心脏抑制作用，尤其是在严重压力超负荷的情况下，可能导致左心室扩张和收缩功能障碍的假象，而这些表现可能在动物脱离麻醉后消失。
   1. 对于表现为呼吸困难和呼吸急促、疑似已发展为射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）表型的动物，应谨慎操作，给予半量甚至三分之一剂量的氯胺酮。
2. 在完全镇静的动物身上，剃除胸部前侧的毛发。
3. 将动物仰卧位放置，并将其固定在塑料板上。
4. 在乳头肌水平获取二维胸骨旁长轴和二维胸骨旁短轴切面的图像或视频片段。同时，从乳头肌水平的胸骨旁短轴切面获取M型图像，以测量舒张期左心室室间隔和后壁厚度，以及左心室舒张末期和收缩末期内径。
   1. 在心率370 - 420次/分钟的条件下获取图像或视频片段，以确保对左心室大小和功能的准确评估。在较低心率下获取图像会导致左心室功能减退和左心室扩张的假象。
      注意：获取的二维胸骨旁长轴切面图像/片段若存在缩短伪影，将导致错误测量。为保证质量控制，请确保左心室心尖和主动脉-二尖瓣夹角在同一平面内被清晰显示。
   2. 在乳头肌中段水平获取二维胸骨旁短轴切面图像/片段。这将作为随访动物研究期间进行可靠连续性左心室测量的参考依据。
5. 在主动脉瓣水平的胸骨旁长轴切面获取M型图像，以评估收缩末期主动脉与左心房（LA）直径的相对比值。
   注意：中度扩张型（MOD）和射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）表型的动物应表现出左心房扩张的证据，其中MOD心衰表型的LA/Ao比值应≥1.25且<1.5，而HFrEF表型的LA/Ao比值应≥1.5¹⁰。

结果

在主动脉弓缩窄（AAB）术后8-12周，可通过超声心动图轻松完成对心力衰竭（HF）表型的表征。假手术组（Sham）、AAB术后第3周、中度心力衰竭（MOD）表型及射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）表型的代表性M型超声图像见图1A。图1B和图1C分别展示了用于建立MOD HF表型和HFrEF表型的血管夹尺寸。左心室舒张末期容积（LVEDV）和收缩末期容积（LVESV）可通过面积-长度法公式计算：V=5/6×A×L，其中V为以ml为单位的容积；A为舒张期（Ad）和收缩期（As）短轴胸骨旁切面中左心室腔横截面积（单位：cm²），测量水平位于乳头肌中部；L为左心室腔长度（单位：cm），通过长轴胸骨旁切面测量，即从舒张期（Ld）和收缩期（Ls）左心室内膜心尖至二尖瓣-主动脉连接处的距离。假手术组和MOD H...

讨论

在大鼠中，由于升主动脉缩窄（AAB）导致的压力超负荷（PO）引起左心室（LV）向心性重构，表现为左心室壁增厚，即所谓的向心性左心室肥厚（concentric LVH），这是机体为对抗左心室壁应力增加而产生的代偿机制。左心室壁增厚通常在AAB术后第一周内即开始显现，并于术后2至3周达到最大厚度。在此期间，病理性信号转导通路被激活，导致左心室进行性扩大，左心室容积增加，这一过程称为离心性肥厚或重构。大多数动物在AAB术后约8周时出现心力衰竭（HF）表型，少数动物则在术后第12周发展为心力衰竭。根据AAB的严重程度不同，可产生两种不同的HF表型。中度心力衰竭（MOD）表型通过使用内径为2 mm²的血管夹实施升主动脉缩窄（AAB）建立；而射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）表型则需使用更窄的血管夹（内径1.5 mm²）进行AAB来建立。在AAB术后2至3周进行超声心动图检查至关重要，以确认是否存在严重的向心性左心室肥厚。严重左心室肥厚的定义为室间隔和左心室后壁厚度≥正常值的1.5倍（正常值为0.19 cm），通常范围在0.27 – 0.3 cm之间。若动物在AAB术后第3周未发展出严重左心室肥厚，则视...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿德森镊	F.S.T.	11019-12	手术器械
带钝齿阿尔姆胸腔拉钩	ROBOZ	RS-6510	手术器械
格拉夫镊，弯型	F.S.T.	11152-10	手术器械
哈尔斯特德-蚊式止血钳，直型	F.S.T.	13010-12	手术器械
硬化精细虹膜剪，直型	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	手术器械
传统不锈钢结扎夹（hemoclip）	Weck	523735	手术器械
梅奥-赫加针持	F.S.T.	12004-18	手术器械
机械呼吸机	CWE inc	SAR-830/AP	小型动物用机械呼吸机
威克不锈钢 Hemoclip 结扎夹	Weck	533140	手术器械